過氧化物酶（POD）活性檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案

過氧化物酶（POD）活性檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案原理過氧化物酶，POD（EC）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，可催化過氧化氫氧化酚類和胺類化合物，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用。POD催化H2O2氧化特定底物生成有色物質(zhì)，在460nm有特征光吸收。可以檢測(cè)植物、細(xì)菌、細(xì)胞、血清等樣本。自備耗材·酶標(biāo)儀或可見分光光度計(jì)（能測(cè)460nm處的吸光度）及恒溫培養(yǎng)箱·96孔板或微量玻璃比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·去離子水·勻漿器（組織樣本）試劑準(zhǔn)備ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。Substrate：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃避光保存。H2O2：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃避光保存。樣本制備注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣本可在-80℃保存1個(gè)月。測(cè)定過程中樣本在冰上放置，以免變性和失活。植物樣本：用冷的PBS清洗植物組織，吸干組織上的水分，盡可能剪碎，稱重，加入1mL/0.1g預(yù)冷的ExtractionBuffer。對(duì)于植物纖維不多的植物組織快速冰上勻漿，勻漿后的樣本，4℃，8,000g離心10min，取上清待測(cè)。對(duì)于植物纖維較多的植物組織冰浴超聲波破碎（功率300W，超聲3s，間隔7s，總時(shí)間3min），然后4℃，8,000g離心10min，取上清待測(cè)。細(xì)菌或細(xì)胞樣本：收集每次檢測(cè)所需的細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量（約1-2×106個(gè)細(xì)胞或細(xì)菌），首先用冷PBS清洗細(xì)胞2次（用PBS重懸細(xì)胞或細(xì)菌，4℃，600g離心10min），按5×106個(gè)細(xì)胞或細(xì)菌加入1mLExtractionBuffer的比例重懸細(xì)胞，冰浴超聲波破碎5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復(fù)30次），然后4℃，8,000g離心10min，取上清待測(cè)。血清或其他液體樣本：直接檢測(cè)。注意：如需測(cè)定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號(hào)：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。實(shí)驗(yàn)步驟酶標(biāo)儀或可見分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到460nm，可見分光光度計(jì)用去離子水調(diào)零。工作液的配制：臨用前將ExtractionBuffer、Substrate、H2O2按照每孔139μL：50μL：1μL的比例混勻（按需要檢測(cè)的樣本數(shù)量進(jìn)行計(jì)算，可多配一些以防不夠）；在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）預(yù)熱10min以上；現(xiàn)配現(xiàn)用。在96孔板或微量玻璃比色皿中加入10μL樣本和190μL工作液，混勻，記錄460nm下0min時(shí)吸光值A(chǔ)1和1min后的吸光值A(chǔ)2。計(jì)算ΔA=A2-A1。注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果加入工作液以后顏色立刻變得較深，可將樣本用提取液稀釋后測(cè)定，計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，植物樣本通常稀釋5倍比較適宜。結(jié)果計(jì)算注意：我們?yōu)槟峁┑挠?jì)算公式，包括推導(dǎo)過程計(jì)算公式和簡(jiǎn)潔計(jì)算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡(jiǎn)潔計(jì)算公式為最終計(jì)算公式。使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式按樣本鮮重計(jì)算單位的定義：每g組織在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A460變化0.005為一個(gè)酶活力單位。POD(U/g鮮重)＝ΔA×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷0.005÷T=4,000×ΔA÷W按樣本蛋白濃度計(jì)算：?jiǎn)挝坏亩x：每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A460變化0.005為一個(gè)酶活力單位。POD(U/mgprot)＝ΔA×V反總÷(V樣×Cpr)÷0.005÷T=4,000×ΔA÷Cpr按細(xì)菌或細(xì)胞樣本密度計(jì)算單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A460變化0.005為一個(gè)酶活力單位。POD(U/104)＝ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.005÷T=8×ΔA按液體樣本體積計(jì)算單位的定義：每1mL液體樣本在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A460變化0.005為一個(gè)酶活力單位。POD(U/mL)＝ΔA×V反總÷V樣÷0.005÷T=4,000×ΔA使用微量玻璃比色皿測(cè)定的計(jì)算公式按樣本鮮重計(jì)算單位的定義：每g組織在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A460變化0.01為一個(gè)酶活力單位。POD(U/g鮮重)＝ΔA×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷0.01÷T=2,000×ΔA÷W按樣本蛋白濃度計(jì)算：?jiǎn)挝坏亩x：每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A460變化0.01為一個(gè)酶活力單位。POD(U/mgprot)＝ΔA×V反總÷(V樣×Cpr)÷0.01÷T=2,000×ΔA÷Cpr按細(xì)菌或細(xì)胞樣本密度計(jì)算單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A460變化0.01為一個(gè)酶活力單位。POD(U/104)＝ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.01÷T=4×ΔA按液體樣本體積計(jì)算單位的定義：每1mL液體樣本在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A460變化0.01為一個(gè)酶活力單位。POD(U/mL)＝ΔA×V反總÷V樣÷0.01÷T=2,000×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣品質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，1min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。相關(guān)產(chǎn)品CatalogNo.ProductNam