噬菌體展示技術和其應用課件

2025/2/81Phagedisplay

噬菌體展示技術及其應用食品學院廖振林Email：2025/2/82噬菌體展示技術是將各種多肽或蛋白質以融合蛋白的形式表達并展示在噬菌體外表，同時將其遺傳密碼包含于噬菌體內部，這使得蛋白質的功能與其基因密碼有機的連結在一起。2025/2/83非展示系統(tǒng)展示系統(tǒng)2025/2/84TheexpressionofexogenouspeptidesonthesurfaceoffilamentousbacteriophagewasinitiallydescribedbySmithin1985.Sincehisfirststudy,differentmoleculessuchassmallpeptidesandantibodieshavebeendisplayedoncoatproteinsofphage,greatlyexpandingtheapplicationsofthetechnology.Thepastdecadehasseenconsiderableprogressinthetechniquesandapplicationsofphagelibraries.Inaddition,differentscreeningmethodshaveallowedisolationandcharacterizationofpeptidesbindingtoseveralmoleculesinvitro,inthecontextoflivingcells,inanimalsandinhumans.2025/2/85-Invivouseofphagelibraries.Initiallythephagelibraryisinjectedinthecirculation.Next,phageisallowedtocirculateforminutesorhours(inthiscasewheninternalizedphagesaretoberecovered).Finally,afterdeepanesthesia,miceareeuthanizedandtheorgansaredissectedforphagerecoveryandpeptidesequencing.2025/2/86Phagestructure.PIII,pVI,pVII,pVIIIandpXIXrepresent

phageproteins.Exogenouspeptidesareexpressedor“displayed〞usually

onpIIIorpVIII.

2025/2/87三絲狀噬菌體的生物學形態(tài)：長桿狀，長度約1um，管直徑約6nm。基因組：約6400核苷酸大小的單鏈線狀DNA，結構：●2700個主要蛋白〔PVIII〕分子螺旋狀排列形成長管，●一頭5個拷貝的次要殼蛋白PIII和PVI，●另一頭那么由次要殼蛋白PVII和PIX。生理：●F菌毛結合的序列是PIII蛋白N端的200個氨基酸。●一個分裂周期中可生產幾百個子代，●

其產量可到達0.3mg/ml。2025/2/88外源蛋白的展示部位

2025/2/89噬菌體展示技術所展示外源多肽和及文庫

1.

隨機肽庫

l

隨機肽庫通常較短〔4~36氨基酸[8,9]長度〕

l

編碼它們的核酸由化學法合成而得l

其展示方式包括3，33，3+3，8，88，8+8等

2.

基因文庫

l

基因組文庫如DNAstaphylococcusaurous

l

cDNA文庫

l

抗體庫

l

病毒cDNA

3.各種自然蛋白及蛋白片段等

其中包括

-半乳糖苷酶等蛋白片段；酶類如堿性磷酸酶，胰酶等；激素類如人生長素，血管緊張激素等；酶抑制劑如牛胰蛋白酶抑制劑等；毒素如蓖麻毒蛋白B鏈等；受體如IgE受體

亞單位、T細胞受體等；觸體如P物質、神經激肽A和B等；抗原及抗原表位；DNA和RNA結合蛋白如鋅指蛋白等；酶底物如蛋白酶底物等；細胞素如IL3，IL6等。

2025/2/810抗體庫技術簡單流程2025/2/811

獲得抗體基因2025/2/812

插入載體2025/2/8132025/2/814

表達2025/2/815

篩選2025/2/8162025/2/817噬菌體展示技術的開展簡史1985年Smith—證實噬菌體fd基因組能通過基因工程的手段進行改造[1]。1988年Parmley—將抗原決定簇與噬菌體PⅢN端融合呈現(xiàn)在其外表[2]。1990年McCafferty—用噬菌體展示技術篩選溶菌酶的單鏈抗體成功使噬菌體展示技術進入一個廣泛應用的時代[3]。一系列噬菌體文庫的構建—噬菌體展示技術煥發(fā)出了新的生命力。2025/2/818

噬菌體定義：是感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒。

噬菌體宿主菌形態(tài)核酸T1-T7、λ、N4大腸埃希菌蝌蚪形dsDNA，線狀P1志賀菌蝌蚪形dsDNA，線狀P22沙門菌蝌蚪形dsDNA，線狀SP01、SP82枯草芽胞桿菌蝌蚪形dsDNA，線狀Φ29解淀粉芽胞桿菌蝌蚪形dsDNA，線狀PM2假單胞菌微球形，有包膜dsDNA，線狀ΦX174、S13、M12、G4大腸埃希菌微球形ssDNA，線狀f1、fd、M13大腸埃希菌絲形ssDNA，線狀MS2、f2、fr、Qβ大腸埃希菌微球形ssRNA，線狀Φ6假單胞菌微球形，有包膜dsRNA，線狀，分成3節(jié)段噬菌體分類：2025/2/819絲狀噬菌體蝌蚪形噬菌體λ噬菌體、T4噬菌體、T7噬菌體M13噬菌體2025/2/820T7與M13相比優(yōu)勢明顯T7Select的優(yōu)勢解釋是在細胞質中表達的裂解性噬菌體與M13不同，T7是裂解性的，其展示的蛋白無需分泌。C-端融合插入序列被克隆到T7Select載體基因10的C-端，可以使帶有終止密碼子的插入子得以表達和展示。載體克隆容量大T7載體比M13克隆容量大，而任何克隆到M13上大于1kbp的片段都不穩(wěn)定。插入片段穩(wěn)定T7重組子很穩(wěn)定，而M13重組子–

尤其是>1kb的很不穩(wěn)定洗提條件靈活M13穩(wěn)定性尚可，但是洗提條件頗受限制，SDS、鹽、離液劑等，都能造成不穩(wěn)定。而T7在1%SDS，5MNaCl，4M尿素，2M鹽酸胍，10mMEDTA,100mMDTT，pH4-10等條件下穩(wěn)定。生長迅速(小于3小時)，噬斑大明顯縮短富集過程，每輪親和淘洗之間時間少，2天內即可完成標準淘洗包裝效率極高(>109pfu/ug)操作很簡便，只需將DNA加到抽提物中，放置并鋪板?？寺⌒矢進13要用電轉化方能獲得高效克隆，而T7Select制備大文庫則容易得多2025/2/821噬菌體cDNA展示技術以改構的噬菌體為載體，cDNA基因片段定向插入噬菌體外殼蛋白基因區(qū)，使外源蛋白表達并展示于噬菌體外表，通過親和富集法篩選表達有特異蛋白質的噬菌體。2025/2/822噬菌體展示系統(tǒng)的類型產品概況載體用途展示拷貝數(shù)/噬菌體展示大小(氨基酸)宿主T7Select415-1多肽41540–50aaBL21T7Select1-1*蛋白或多肽≤11200aaBLT5403或5615T7Select1-2a,b&c蛋白或多肽≤1900aaBLT5403或5615T7Select10-3b*蛋白或多肽約為10>564**(上限待定)BLT5403或56152025/2/823噬菌體cDNA展示技術的應用1用于模擬表位的研究。2用于DNA、RNA結合蛋白的研究。3用于蛋白-蛋白相互作用的研究。4用于非蛋白小分子與蛋白相互作用的研究。5細胞與蛋白相互作用的研究。6酶作用底物的分析、先導化合物的發(fā)現(xiàn)、定位信號轉導途徑等。2025/2/8242025/2/825問題1.沒有一個系統(tǒng)能夠表達所有的真核細胞蛋白。2.在外源cDNA插入噬菌體載體時存在雙向插入，可能導致表達減少或者逆向表達。2025/2/826展望噬菌體cDNA展示技術有效地實現(xiàn)了基因型和表現(xiàn)型的轉換，在分子克隆的根底上，實現(xiàn)蛋白質設想的體外控制，從而可獲得具有生物學活性的表達產物。假設將其與蛋白質三維結構預測、分子模擬技術完美融合，對分子相互作用、分子識別、受體識別、酶學機制等研究進程將起到極大的推動作用。2025/2/827應用舉例：局部做過的工作2025/2/828一、半合成噬菌體抗體庫的構建構建一個半合成抗體庫，不經免疫制備人源抗Tie2Fab抗體。通過RT-PCR方法，從人臍帶血淋巴細胞總RNA擴增輕鏈基因及重鏈VH段基因，將輕鏈基因插入pCOMb3載體中，得人輕鏈質粒庫；從乙肝外表抗體〔HBsAb〕的Fd段基因制備含有不同長度隨機化CDR3的FR3-CDR3-J-CH1片段，然后將VH段基因與隨機化的CDR3融合，得到Fd基因片段，再將其插入輕鏈質粒庫中，得半合成人Fab質粒庫。2025/2/829材料和方法人臍帶血淋巴細胞

Ficoll–paqueplus購自Pharmacia公司。Trizol試劑購自Invitrogen

公司。pComb3噬菌體抗體表達載體：4029bp，含有可插入輕鏈和重鏈基因的克隆位點。大腸桿菌XLl-blue輔助病毒VCSM13

2025/2/830cDNA制備引物設計電轉化感受態(tài)的制備輔助噬菌體的制備抗體庫制備2025/2/831結果PCR擴增人抗體基因

圖3.1λ鏈PCR擴增結果1-6泳道：VL1,VL2,VL3,VL4,VL5,VL6M：MarkerDL2,000圖3.2κ鏈PCR擴增結果11-3泳道：VK1,VK2,VK3M：MarkerDL2,0002025/2/832圖3.3重鏈分段PCR擴增結果1－3泳道：H135，H2，H4(約290bp)4－7泳道：CDR3-5,CDR3-8,CDR3-10,CDR3-12(約400bp)M：MarkerDL2,000

2025/2/833圖3.4重鏈重疊PCR擴增結果1－3泳道：CDR3-5+(H135，H2，H4)融合結果4－6泳道：CDR3-8+(H135，H2，H4)融合結果7－9泳道：CDR3-10+(H135，H2，H4)融合結果10－12泳道：CDR3-12+(H135，H2，H4)融合結果123456M789101112M2025/2/834圖3.5輕鏈和重鏈插入pComb3流程HL2025/2/835人源輕鏈抗體文庫的構建

經限制性內切酶SacI和XbaI雙酶切的人抗體輕鏈PCR產物與用相同內切酶酶切、去磷酸化的pComb3載體，16℃連接，用該連接產物進行電轉化，根據(jù)1μl和10μl菌液鋪平板所長出來的菌落數(shù)，可推算出人抗體輕鏈文庫的庫容量。κ鏈文庫的容量為5.03×106,λ鏈文庫的容量為6.8×106(屢次建庫混合后的庫容量)。從平板上隨機挑取10個菌落，涂格，過夜培養(yǎng)，菌落PCR鑒定。對于λ鏈文庫，10個克隆中有6個陽性，λ鏈文庫的插入率大約為60％；κ鏈文庫10個克隆中有7個是陽性，其插入率大約為70％。2025/2/836人源噬菌體Fab抗體半合成文庫的構建

將酶切純化的重鏈重疊PCR產物插入經酶切、并切膠回收純化的輕鏈抗體文庫中，轉化感受態(tài)細胞，在輔助噬菌體VCSM13的超感染下，繁殖出表達人抗體Fab段的噬菌體，即為抗體組合文庫。1μl和10μl轉化菌鋪平板計數(shù)，計算出κ＋Fd〔包括CDR3-5到CDR3-12的全部隨機化Fd片段〕文庫的庫容為5.89×106。隨機挑取10個菌落，涂格，過夜培養(yǎng)后菌落PCR：其中6個克隆中有輕鏈也有重鏈。雙鏈插入率為60％左右。2025/2/837以相同的程序構建λ＋Fd鏈抗體庫，庫容量為6.55×106,隨機挑取10個菌落，涂格，過夜培養(yǎng)后菌落PCR：其中有5個克隆擴增出輕鏈和重鏈片段。雙鏈插入率為50％左右。為了提高抗體庫的庫容量，在增加細菌轉化效率的同時，進行了屢次轉化，每次轉化都計算插入率。結果如表所示。2025/2/838表3.1抗體庫的庫容與抗體片段插入率

ND：未做2025/2/839混合抗體庫的鑒定

將所構建的各種Fab抗體庫混合成為最終的人源噬菌體抗體庫，理論庫容為1.97×107實際的噬菌體抗體庫滴度為3.9×1014cfu/ml。隨機挑取10個菌落進行PCR，.電泳觀察,雙鏈陽性有5個(圖3.6),單鏈〔輕鏈或者重鏈〕陽性有4個,空載體1個,Fab陽性率為50％左右。2025/2/840圖3.6半合成抗體庫Fab重組克隆的PCR鑒定

其中1，2，4，5，8五個克隆為輕重鏈雙陽性克隆M1L1H2L2H3L3H4L4H

M5L5H

6L6H

7L7H

8L8H2025/2/841討論本研究采取構建半合成抗體庫的方法，以胎兒臍帶血為材料，將基因組的VH段與人工合成的CDR3〔共4組〕拼接，在體外進行V-D-J重排，構建Fd段基因庫，再與來自胎兒臍帶血的輕鏈基因庫組合。現(xiàn)已明確人類基因組中有約50個VH基因，分7個亞群，第6和第7個亞群僅各有一個基因。我們設計了三種VH基因5’端引物，其中可擴增出第1,3,5亞群，H2擴增第2亞群，H4擴增第4亞群，第6,7亞群因基因數(shù)量少未設計專門引物，但也可分別由H135和H4擴增。2025/2/842

在進行CDR3隨機化的過程中，進行重疊PCR時難免會有錯誤。故在完成Fd鏈的融合后，對Fd基因進行了檢測，將產物克隆到T載體中，測定了5個克隆。發(fā)現(xiàn)有2個克隆在重疊區(qū)提前出現(xiàn)了終止密碼子或者缺失D區(qū)，另外3個正常，分別屬于VH1,VH2,VH4基因家族

2025/2/843為了增加抗體基因的豐度，在試驗過程中提取淋巴細胞總RNA，可以防止提取mRNA時容易降解和喪失目的基因。獲得的抗體基因需要屢次酶切、連接、轉化等步驟，所以在這些過程中要盡量提高連接效率：可采取分步雙酶切，保證切割完全，檢測連接效率。2025/2/844實驗過程中，克隆的抗體基因在細菌的培養(yǎng)過程中會有喪失現(xiàn)象發(fā)生，雙鏈陽性率會由轉化時的60％左右變成50％左右，與前人報告的情況一致?？赡茉蛴校簬в休p重鏈基因的克隆在細菌生長過程中發(fā)生缺失突變、帶有抗體基因的克隆生長緩慢、輔助噬菌體CP-III蛋白與Fab－CPIII蛋白競爭進入噬菌體過程中局部噬菌體沒有Fab－CPIII蛋白包裝在外表。2025/2/845二從噬菌體抗體庫中篩選抗Tie2抗體以Tie2為靶標，對已經建好的半合成噬菌體抗體庫進行3輪的吸附、洗脫、擴增的篩選，獲得2株能夠同Tie2抗原特異性反響的Fab噬菌體抗體。2025/2/846材料與方法材料抗原Tie2-Fc，Ang1(購自A&BSystem公司)對照抗原：BSA購自Sigma公司丙型肝炎病毒NS5—外表抗原(本室表達)IgG1標準品〔Sigma公司〕。抗體：HRP標記的抗VCSM13多克隆抗體〔購自Sigma公司〕HRP標記的抗人IgGFab抗體〔購自Sigma公司〕2025/2/847方法噬菌體滴度測定噬菌體抗體庫的淘篩，制備噬菌體抗體的抗原結合活性-夾心ELISA試驗噬菌體抗體的特異性鑒定－交叉反響性競爭抑制試驗序列測定2025/2/848結果4.1半合成抗體庫的篩選：將Tie2抗原過夜包被在酶連板中，對所得總庫進行了三輪淘篩每輪洗脫噬菌體鋪平板計數(shù)，分別是：2.8×104，

2.9×105，

2.6×106。經過三輪的吸附、洗脫、擴增的篩選，Tie2抗原對噬菌體抗體進行了特異性富集。從表4.1可以看出在三輪淘洗的過程中，噬菌體確實出現(xiàn)了特異性的富集，第三輪淘洗比第一輪的產率高出近40倍。

2025/2/849表4.1噬菌體抗體庫的富集

2025/2/8504.2噬菌體抗體的鑒定噬菌體抗體的抗原結合活性－ELISA實驗第三輪淘篩后，隨機挑取60個克隆，制備單克隆噬菌體抗體，用間接ELISA法檢測對Tie2抗原的結合活性。A490值超過0.8的有10個〔見表4.2〕。噬菌體抗體的交叉反響性鑒定和其他抗原的交叉反響性：將噬菌體抗體滴度較高的10個克隆同其他三種不同的抗原〔HCVNS5蛋白，BSA，人IgG，〕進行ELISA交叉反響，排除交叉反響抗體，剩余的抗體是特異性針對Tie2抗原的〔表4.2〕。2025/2/851表4.2篩選所得克隆與Tie2的結合活性及和其他抗原的交叉反響性2025/2/852競爭抑制試驗結果：

為進一步驗證所得噬菌體抗體對體Tie2抗原的特異性，用Ang1與陽性噬菌體抗體克隆做競爭抑制試驗，結果說明：Ang1對局部噬菌體抗體的Tie2結合活性具有抑制作用。如表4.3所示2025/2/853表4.3競爭抑制試驗結果

2025/2/854所得克隆的酶切與測序：選取交叉反響小，有競爭抑制活性的克隆進行酶切鑒定(EcoRI＋XhoI酶切如圖4.1所示)，片段大小為1.6Kb和3.7Kb大小正確。同時送局部菌株測序。2025/2/855圖

4.1pComb3-Fab酶切結果

3.7kb1.6kb

2000S1212S2S4M1M2S12,12,S2,S4Fab陽性克隆M1Λ/Ecot14M2DL20002025/2/856序列分析克隆S12測序結果與抗體胚系基因數(shù)據(jù)庫〔V-BASE〕比較，重鏈屬于VH4基因家族，與胚系基因DP-66同源性最高；D、J分別是D7-27和JH3a；輕鏈屬于Vκ1家族，來自胚系基因DPκ3，J段屬于Jκ2〔如圖4.2〕。在重鏈的CDR3區(qū)，符合最初的〔NNK〕8的隨機化設計，在CDR3前面共有人工參加的8個氨基酸，后面3個氨基酸是根本固定的。12號克隆重鏈屬于VH1家族，與DP-23同源性最高，D、J分別是DP-26和JH4d，CDR3區(qū)，符合最初的〔NNK〕12隨機化設計；輕鏈屬于VL2家族，來自胚系基因DPL11，J段屬于JL2/JL3a。在測序的克隆中，有兩個克隆測序發(fā)現(xiàn)D基因缺失。2025/2/857圖4.2S12號克隆輕鏈重鏈可變區(qū)DNA及氨基酸序列

2025/2/858討論噬菌體抗體庫展示技術的開展為不經免疫直接制備抗體成為可能；利用半合成抗體庫直接獲得人源抗體，是噬菌體展示技術中的主要方法之一。我們在本研究中從半合成抗體庫中成功篩選出抗Tie2人源抗體Fab抗體，說明這一方法是可行的。但所得的Tie2抗體是否能在體內抑制Ang1配體的結合，還需進一步的試驗。半合成抗體庫的庫容是一個重要參數(shù)，用組合感染法可以到達1010，常規(guī)的電穿孔法很難到達。我們的庫容通過屢次建庫為1.97×107。在所建庫中篩到的有些克隆VH基因不全，這和王琰的結論有相似的地方，在CDR3隨機化的過程中，由于引物合成和重疊PCR的錯誤等原因，會產生一些不完整的基因。2025/2/859總結1從胎盤組織中克隆出Tie2膜外區(qū)基因,并對基因進行了鑒