T-BPMA 30-2024 畜禽肉中食源性興奮劑和孕激素的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

ICS67.120CCSX04BPMADeterminationoffood-bornestimulantdrugsandprogestinsinmeat—Liquidchromatography-tandemmassspectrometrymethodIT/BPMA30—2024本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由北京市科學技術(shù)研究院分析測試研究所（北京市理化分析測試中心）提出。本文件由北京預防醫(yī)學會歸口。本文件起草單位：北京市科學技術(shù)研究院分析測試研究所（北京市理化分析測試中心北京市疾病預防控制中心，北京市延慶區(qū)疾病預防控制中心。本文件主要起草人：馮月超、劉艷、王建鳳、郭巧珍、姚凱、張晶、林強、李晶晶、蘇東霞。1T/BPMA30—2024本文件描述了畜禽肉中40種食源性興奮劑和5種孕激素含量測定的液質(zhì)聯(lián)用測定方法。本文件適用于畜禽肉中40種食源性興奮劑和5種孕激素含量的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4方法原理樣品中的被測物經(jīng)0.5%乙酸乙腈溶液振蕩提取，加入氯化鈉和無水硫酸鎂脫水離心。上清液采用乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA）、十八烷基鍵合硅膠（C18）、中性氧化鋁和無水硫酸鎂凈化。采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定，內(nèi)標法定量。5試劑和材料5.1試劑除另有說明外，所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。5.1.1甲醇（CH3OH）：色譜純。5.1.2乙腈（CH3CN）：色譜純。5.1.3無水硫酸鎂（MgSO4）。5.1.4氯化鈉（NaCl）。5.1.5冰乙酸（CH3COOH）：優(yōu)級純。5.1.6甲酸（HCOOH）：色譜純，純度≥88%。5.1.7乙酸銨（CH3COONH4）：優(yōu)級純。5.1.8中性氧化鋁（Al2O30.15mm~0.30mm（100~200目層析用。5.1.9提取液：取5mL冰乙酸加入乙腈，并用乙腈定容于1000mL，混勻。5.1.100.1%甲酸-5mmol/L乙酸銨水溶液：稱取0.385g乙酸銨用水溶解，加入1.0mL甲酸，用水定容至1000mL。5.1.11復溶溶液：取0.1%甲酸-5mmol/L乙酸銨水溶液（5.1.10）90mL，加入10mL甲醇混勻。5.1.12標準品：45種被測化合物和9種內(nèi)標物的中英文名稱和CAS號信息見附錄A，純度≥95%。2T/BPMA30—20245.1.13標準儲備溶液：準確稱取附錄A中的標準品適量（相當于各被測物的有效成分10mg），精密稱定，分別用甲醇適量使溶解并定容于10mL，配制成濃度為1.0mg/mL的標準儲備溶液。-18℃以下避光儲存，其中利尿劑（氨苯喋啶、螺內(nèi)酯、坎利酮）保質(zhì)期為3個月，其余有效期為6個月。5.1.14混合標準儲備溶液：依據(jù)化合物的類別將被測物分成A~G共7組，見附錄B，其中A-F組為外標，G組為內(nèi)標。用甲醇配制成7個混合標準儲備溶液，配制濃度見附錄B。-18℃以下避光儲存3個月。5.1.15內(nèi)標混合標準中間溶液：取G組內(nèi)標混合標準儲備液適量，用甲醇配制成0.1μg/mL~0.4μg/mL的內(nèi)標混合中間溶液，見附錄B。5.1.16外標混合標準中間溶液：臨用前分別取上述A~G組混合儲備溶液1.00mL，用甲醇定容于10mL容量瓶，配制成外標混合中間溶液，濃度范圍時0.1μg/mL~0.4μg/mL，見附錄B。5.1.17溶劑標準工作溶液：分別移取0mL、0.1mL、0.2mL、0.5mL、0.8mL、1.0mL外標混合中間液于10mL容量瓶，均加入0.1mL內(nèi)標混合標準中間液，用復溶溶液（5.1.11）定容至刻度，混勻。5.2材料5.2.1乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA）：粒徑40μm~60μm。5.2.2十八烷基鍵合硅膠（C18）：粒徑40μm~60μm。5.2.3凈化管：分別稱取吸附材料PSA（5.2.1）、C18（5.2.2）、中性氧化鋁（5.1.8）各165mg，無水硫酸鎂（5.1.3）900mg于10mL螺蓋離心管中。5.2.4微孔濾膜：尼龍，0.22μm。6儀器和設備6.1液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源（ESI）。6.2離心機：轉(zhuǎn)速不低于8000r/min。6.3氮氣吹干儀。6.4超聲波清洗器。6.5多管渦旋混勻儀。6.6渦旋混合器。6.7分析天平：感量0.01g和0.00001g。7試樣制備和保存7.1試樣制備取500g畜禽肉樣品，絞碎均質(zhì)后的供試樣品，作為供試樣品。7.2試樣保存-18℃以下保存。8測定步驟3T/BPMA30—20248.1樣品的處理8.1.1提取稱取粉碎均質(zhì)后的試樣5.0g（精確至0.01g）于50mL螺蓋離心管中，加入40μL內(nèi)標混合標準中間溶液（5.1.15），加入5mL水，渦旋10s后，準確加入20mL提取液（5.1.9），于多管渦旋混勻儀8000r/min離心5min，上清液待凈化。8.1.2凈化移取上清液10mL于裝入凈化劑的凈化管（5.2.3）中，振蕩10min，8000r/min離心5min。移取上層凈化液5mL于試管中，置于氮氣吹干儀上于45℃以下吹干，加入1.0mL復溶溶液（5.1.11），渦旋復溶，用0.22μm微孔濾膜（5.2.4）過濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。8.2基質(zhì)標準工作溶液的制備稱取6份不含被測物的陰性樣品5.0g（精確至0.01g不加內(nèi)標，按照8.1.1和8.1.2的方法提取凈化，吹干，加入1.0mL溶劑標準工作溶液（5.1.17），渦旋復溶30s，用微孔濾膜（5.2.4）過濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。8.3空白試驗除不加試樣外，按8.1中描述的步驟做空白實驗。8.4儀器分析條件8.4.1液相色譜條件液相色譜參考條件如下：a)色譜柱：C18反相液相色譜柱（2.1mm×100mm,1.7μm）或等效柱；b)柱溫：30℃;c)進樣量：5μL；d)流動相：A為甲醇（5.1.1），B為0.1%甲酸-5mmol/L乙酸銨水溶液（5.1.10）。梯度洗脫條件見表1。表1液相色譜梯度洗脫條件5500558.4.2質(zhì)譜條件質(zhì)譜參考條件如下：4T/BPMA30—2024a)電離源：電噴霧離子源；b)掃描方式：正離子掃描；c)檢測方式：多重反應監(jiān)測（MRM）；d)毛細管電壓：0.5kV；e)離子源溫度：150℃;f)脫溶劑溫度：450℃;g)脫溶劑氣流量：650L/h；h)錐孔氣流量：50L/h；i)碰撞氣體：氬氣；j)45種被測物及9種內(nèi)標物色譜峰的保留時間及質(zhì)譜參數(shù)見附錄C。8.5定性判定在相同試驗條件下，試樣溶液譜圖中應呈現(xiàn)定量離子對和定性離子對的色譜峰，被測物質(zhì)的質(zhì)量色譜峰保留時間與標準溶液中對應物質(zhì)的色譜峰保留時間偏差在±2.5%之內(nèi)；試樣色譜圖中所選擇的監(jiān)測離子對的相對豐度與相當濃度標準溶液的離子相對豐度比的偏差不超過表2規(guī)定范圍，則可判斷試樣中存在對應的被測質(zhì)。表2定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差±20±308.6定量測定試樣溶液和基質(zhì)標準工作溶液（8.2），注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，以被測物濃度為橫坐標，以基質(zhì)標準工作溶液中被測物峰面積與對應內(nèi)標峰面積比為縱坐標，繪制標準工作曲線，做單點或多點校準。試樣溶液與標準溶液中待測物的響應值均應在儀器線性范圍內(nèi)。被測物和內(nèi)標物標準溶液的特征離子質(zhì)量色譜圖見附錄D。如果有陽性檢出應采用現(xiàn)行有效的國家標準檢測方法進一步確證。9結(jié)果計算和表述試樣中各被測物含量按照式（1）計算：式中:X——樣品中待測組分的含量，單位為微克每千克(μg/kg）；c——從標準曲線計算得到的被測物的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；vf——加入復溶溶液的體積，單位為毫升（mLvt——加入提取液的體積，單位為毫升（mL）；5T/BPMA30—2024vj——移取凈化液的體積，單位為毫升（mLm——試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；1000——換算系數(shù)。計算結(jié)果需扣除空白值，測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均值表示，保留一位小數(shù)。10方法準確度、精密度、檢出限和定量限10.1檢出限和定量限本方法各被測物的檢出限、定量限見附錄B。10.2準確度和精密度本方法對雞肉進行加標回收率實驗，不同添加水平下的平均回收率和相對標準偏差數(shù)據(jù)見附錄E。6T/BPMA30—2024表A.1為被測物及內(nèi)標物中英文名稱和CAS號。表A.1被測物及內(nèi)標物中英文名稱和CAS號1C12H18Cl2N2O2C12H18ClNO3bambuterolC18H29N3O54C11H16Cl2N2O5penbuterolC18H29NO26C14H20Cl2N2O7mabuterolC13H18ClF3N2O8brombuterolC12H18Br2N2O9C12H17N3OC11H17NO3C13H21NO3C14H19N3O2ractopamineC18H23NO3C25H37NO4C14H22N2O3propranololC16H21NO2metoprololC15H25NO3C12H11N7C24H32O4SC22H28O3C19H28O2C18H26O2C20H28O2boldenoneC19H26O2C18H22O2C19H26O2prasteroneC19H28O2methyltestosteroneC20H30O27T/BPMA30—2024表A.1被測物及內(nèi)標物中英文名稱和CAS號（續(xù)）C20H32O2mestanoloneC20H32O2C21H32N2OC22H29FO5hydrocortisoneC21H30O5prednisoloneC21H28O5C21H28O5prednisoneC21H26O5C24H30F2O6C21H29FO5beclomethasoneC22H29ClO5progesteroneC21H30O2C25H32O4medroxyprogesteroneaceC24H34O4C21H30O3C22H30O3C12H9D9Cl2N2O/C18H19D5ClNO3C13H19D3NO3methyltestosterone-C20H27D3O2testosterone-D3C19H25D3O2boldenone-D3C19H23D3O2progesterone-D9C21H21D9O2C21H27D3O5C22H24D5FO58T/BPMA30—2024本方法被測物和內(nèi)標物混合標準儲備溶液、混合中間溶液分組、配制濃度見表B.1。表B.1混合標準儲備溶液和混合標準中間溶液分組、配制濃度和方法的檢出限、定量限序號11A21A31A42A51A61A72A81A92A1A1A1A1A1A1A1B1B1B2C2C2C2D2D2D2D2D2D9T/BPMA30—2024表B.1混合標準儲備溶液和混合標準中間溶液分組、配制濃度和方法的檢出限、定量限（續(xù)）儲備液2D2D8D2D2D4E4E4E4E4E4E4E4E2F2F2F2F2F1——G—1——G—1——G—2——G—2——G—2——G—2——G—4——G—4——G—T/BPMA30—2024本方法被測物及內(nèi)標物的保留時間及主要質(zhì)譜參數(shù)的參考值見表C.1。表C.1被測物及內(nèi)標物的保留時間及主要質(zhì)譜參數(shù)參考值14.78234567894.724.38T/BPMA30—2024表C.1被測物及內(nèi)標物的保留時間及主要質(zhì)譜參數(shù)（續(xù)）4.984.612688T/BPMA30—2024表C.1被測物及內(nèi)標物的保留時間及主要質(zhì)譜參數(shù)（續(xù)）88622424.7564.368T/BPMA30—2024