（高清版）DB12∕T 651-2016 轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆G∕TS40-3-2及其衍生品種定量檢測 實時熒光PCR方法　　

B23DB12Detectionofgeneticallymodifiedplantsandderivedproducts—QuanlitativePCRmethodforherbicide-resistantso天津市市場和質(zhì)量監(jiān)督管理委員會發(fā)布I本標準起草單位：天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所、中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所、天轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆GTS40-3-2及其衍生品種定量檢測實時熒光PCR方法本標準適用于轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆GTS40-3下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和NY/T672轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測通用要求Lectin基因LectingeneGTS40-3-2轉(zhuǎn)化體特異性序列event-specificsequ進行實時熒光PCR擴增。根據(jù)標準樣品模板拷貝lec-1269P：5′-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTGTS40-3-2F：5'-CCTTTAGGATTTCAGCATCAGTGG-GTS40-3-2R：5'-GACTTGTCGCCGGGAATGGTS40-3-2P：5'-CGCAACCGCCCGCAAATCC準物質(zhì)基因組DNA，用0.1×TE或水稀釋蓋5個GTS40-3-2濃度梯度，最低濃度拷貝數(shù)小于200，最高濃度拷貝數(shù)大于40000。5.3.6.1標準樣品和試樣實時熒光P3然后取出PCR管，放入PCR儀中。運行實時熒光PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序為：95℃變—2.0μL2.0μL—25.0μL表2Lectin內(nèi)標基因PCR反應(yīng)體系—0.5μL0.5μL0.5μL2.0μL—25.0μL應(yīng)設(shè)置陰性對照和空白對照。以非轉(zhuǎn)基因大豆材料提取的DNA作為GTS40-3-2轉(zhuǎn)化體特異情況進行調(diào)整。設(shè)定閾值處，要求不同濃度梯度標準品的擴增曲線平行，而且同一樣品的不同平設(shè)定閾值后，熒光定量PCR儀的數(shù)據(jù)分析軟件自動計算每個反應(yīng)的Ct值，并記錄。5.3.7.3繪制標準曲線根據(jù)標準溶液的擴增Ct值和初始模板拷貝數(shù)的對數(shù)間的線性關(guān)系，分別繪制GTS40-3-2轉(zhuǎn)化體和Lectin內(nèi)標基因的標準曲線。標準曲線公式：式中：y—測試樣品的Ct值；a—標準曲線的斜率；x—模板拷貝數(shù)以10為底數(shù)的對數(shù)；b—標準曲線的截距。5.3.7.4數(shù)據(jù)可接受的標準GTS40-3-2陰性對照和空白對照的GTS40-3-2轉(zhuǎn)化體Ct值≥38;Lectin陰性對照和空白對照的Lectin內(nèi)標基因Ct值≥38;標準曲線的R2≥0.98,標準曲線斜率≥-3.6且≤-3.1;滿足上述條件，可以進行結(jié)果計算。否則重新進行實時熒光PCR擴增。5.3.7.5含量計算5.3.7.5.1計算試樣模板拷貝數(shù)將試樣的GTS40-3-2轉(zhuǎn)化體和Lectin內(nèi)標基因的Ct值分別帶入GTS40-3-2轉(zhuǎn)化體和Lectin內(nèi)標基因的標準曲線方程，計算GTS40-3-2轉(zhuǎn)化體和大豆內(nèi)標準基因Lectin的拷貝數(shù)。計算試樣模板拷貝數(shù)公式：式中：n—模板拷貝數(shù)y—測試樣品的Ct值；a—標準曲線的斜率；b—標準曲線的截距。5.3.7.5.2計算試樣中轉(zhuǎn)基因含量將GTS40-3-2轉(zhuǎn)化體拷貝數(shù)和Lectin內(nèi)標基因拷貝數(shù)帶入公式(3),計算出試樣中GTS40-3-2百分含量。計算試樣中GTS40-3-2轉(zhuǎn)化體百分含量的公式：式中：c—試樣中GTS40-3-2的百分含量(%);nLecin—大豆內(nèi)標準基因Lectin拷貝數(shù)。的Ct值<36，表明樣品中檢出耐除草劑大豆GTS40-3-2轉(zhuǎn)化體。表述為“樣品中檢測出GTS40-3-2轉(zhuǎn)曲線，表明樣品中未檢出耐除草劑大豆GTS40-3-2轉(zhuǎn)化體。表述為“樣品中未檢測出GTS40-3-2轉(zhuǎn)化判斷；如重復(fù)實驗GTS40-3-2轉(zhuǎn)化體出現(xiàn)典GTS40-3-2轉(zhuǎn)化體，表述為“樣品中檢測出GTS40-3-2轉(zhuǎn)化體”。驗。如重復(fù)實驗結(jié)果符合6.1-6.4的情況，依照6.1-6.4進行判斷；如重復(fù)實驗Lectin內(nèi)標基因和A.1Lectin基因?qū)崟r熒光PCR擴增產(chǎn)物核苷酸序列（AccCTTCTATGCCCCTGACACAAAAAGGCTTGCA1GCCCTCTACTCCACCCCCATCCACATTTGGGACAAAGAAACTTCTATGCC