T∕CACM 012-2016 金錢白花蛇快速 PCR 鑒定

ICS:11.120.99C10/29團(tuán)體標(biāo)T/CACM0122016金錢白花蛇快速PCR鑒定QulicklypcRidentificationofBulngarulsparvuls2016-12-12發(fā)布2016-12-12實(shí)施中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)發(fā)布前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 5儀器設(shè)備 6試劑和溶液配制 7檢驗(yàn)程序 8結(jié)果判定 9結(jié)果報(bào)告 附錄A(資料性附錄)金錢白花蛇快速PCR鑒定體系的建立 本標(biāo)準(zhǔn)的全部技術(shù)內(nèi)容為推薦性。本標(biāo)準(zhǔn)是對(duì)《中華人民共和國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)充。本標(biāo)準(zhǔn)由中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位:中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心、廣東省食品藥品檢驗(yàn)所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人:袁媛、黃璐琦、李華、蔣超、楊志業(yè)、趙玉洋、何雅莉。請(qǐng)注意本標(biāo)準(zhǔn)的某些內(nèi)容有可能涉及專利,本標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布機(jī)構(gòu)不應(yīng)承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。1金錢白花蛇快速PCR鑒定本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了使用快速PCR鑒定金錢白花蛇藥材和飲片的通用方法和要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于金錢白花蛇藥材和飲片鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件,其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件,其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》(2015年版)GB/T6682《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》GB/T23632《進(jìn)境植物檢疫截獲有害生物鑒定復(fù)核規(guī)程》GB/T27403《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)》3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。按一定規(guī)則取自某一整體的一個(gè)或多個(gè)部分,并能反映該整體的相關(guān)信息,可以作為判斷該整體的基礎(chǔ)。從樣品提取出DNA的方法。通過一定技術(shù)使一段特定的DNA片段拷貝數(shù)增加的過程,可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreaction(PCR)模板DNA先經(jīng)高溫變性為單鏈,兩條引物分別與模板DNA兩條鏈上相應(yīng)的一段互補(bǔ)序列發(fā)生退火,在DNA聚合酶的作用下,以四種脫氧核糖核酸(dNTP)為底物,使退火引物得以延伸,然后不斷重復(fù)變性、退火和延伸這一循環(huán),使位于兩段已知序列之間的DNA片段拷貝數(shù)呈幾何倍數(shù)擴(kuò)增。其擴(kuò)增產(chǎn)物可通過多種特異性和敏感性好的方法進(jìn)行分析。一般使用對(duì)照藥材代替送檢樣品同法DNA提取、靶核酸擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)過程,用于證明鑒定過程可獲得目標(biāo)核酸片段的操作。使用常見偽品藥材代替送檢樣品同法DNA提取、靶核酸擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)過程。以水代替送檢樣品同法DNA提取、靶核酸擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)過程,用以證明提取過程中沒有核酸2污染。金錢白花蛇快速PCR鑒定應(yīng)采用抽取有代表性的送檢樣品與對(duì)照藥材比較的驗(yàn)證方式,即依據(jù)金錢白花蛇特異性DNA序列進(jìn)行鑒定。利用堿裂解法提取金錢白花蛇模板DNA,以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,熒光檢測(cè)或瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。5儀器設(shè)備所有制備樣品使用的器具在使用前應(yīng)滅菌處理。使用前應(yīng)進(jìn)行溫度校準(zhǔn)。5.1.2手持式紫外燈5.1.3連續(xù)可調(diào)微量移液槍5.1.4保溫設(shè)備6試劑和溶液配制除另有規(guī)定外,實(shí)驗(yàn)試劑為不含DNA和DNase的分析純或生化試劑;實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T6682的要求;所配制的試劑均應(yīng)滅菌后保存,并在容器上注明試劑名稱、濃度、配制時(shí)間、保存條件、失效日期和配制者姓名;PCR試劑應(yīng)小量分裝保存以減少污染;材料及試劑的保存都應(yīng)有防污染措施。含有0.5mol/L氫氧化鈉(NaOH)、1%聚乙烯吡咯烷酮-40(PVP-40)、1%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX100)溶液:在800mL去離子水中溶解26.2中和緩沖液含有0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸(Tris-HCl)溶液,pH值為8.0:在800mL去離子水中溶解12.1g三羥甲基氨基甲烷(Tris),冷卻至室溫后用濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0,加水定容至1L,分裝后高壓滅菌。6.3dNTP混合液6.520%PVP溶液在80mL去離子水中溶解20.0gPVP-40,加水定容至100mL,分裝后過濾除菌,冷卻后-20益保存。在80mL去離子水中溶解1.0g牛血清白蛋白(BSA),加水定容至100mL,分裝后過濾除菌,冷卻后-20益保存。時(shí)置冰上操作。36.8金錢白花蛇檢測(cè)用引物對(duì)序列2EDTA·2H2O,加入醋酸,充分混勻,加去離子水定容至1L,室溫保存,使用時(shí)用去離子水50倍稀釋。在80mL去離子水中溶解溴酚藍(lán)250mg,二甲苯青250mg,蔗糖250mg,加水定容至100mL,分裝。7檢驗(yàn)程序?yàn)榉乐菇徊嫖廴?收樣、取樣、粉碎、DNA提取、核酸擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)應(yīng)在不同操作間或在同一操作間不同隔離區(qū)域進(jìn)行,進(jìn)入各區(qū)域應(yīng)嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行,即樣品制備區(qū)寅核酸制備區(qū)寅擴(kuò)增區(qū)寅檢測(cè)區(qū)。送檢樣品抽樣方法參照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部藥材和飲片取樣法(通則0211)進(jìn)行取樣。送檢樣品應(yīng)可分成2批,每批可分為同樣的3份,總量不應(yīng)少于20g。收樣時(shí)應(yīng)檢查包裝的完整性,并在樣品袋上貼上標(biāo)簽,填寫采集數(shù)據(jù)表。對(duì)商品包裝和送樣說明進(jìn)行拍照記錄,照片隨樣品一起備檔。去除藥材和飲片表面附著物,依次使用75%乙醇和無菌雙蒸水擦拭表面后晾干。取送檢樣品置乳缽、勻漿機(jī)或球磨粉碎儀中充分研磨粉碎,必要時(shí)加適量液氮研磨。800滋L中和緩沖液,充分混勻;12000r/min離心1min800滋L中和緩沖液,充分混勻;12000r/min離心1min或靜置5min;轉(zhuǎn)移500滋L上清液至一新的EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(1),作)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(5mL離),為DNA)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(心管),模板)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(加入5),待測(cè)或)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(滋),0)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(L),益)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(中),保)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(和),存)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(緩),備)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(沖),用)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(充),個(gè))EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(分),送)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(混),檢)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(勻),樣)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(1),品)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(2000r/),必須重)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(離心),次)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(1m),每)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(n或靜置5m),1次從送檢樣)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(轉(zhuǎn)),提)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(移),取)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(上),核)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(清),酸)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(液),的)過程都必須設(shè)置1個(gè)提取空白對(duì)照。注:使用堿裂解法提取的金錢白花蛇DNA可在4益下保存3天或-20益下保存7天,不宜長(zhǎng)期保存。7.4核酸擴(kuò)增首次使用本方法時(shí),應(yīng)校對(duì)PCR儀溫控準(zhǔn)確性,并使用陽性對(duì)照和陰性對(duì)照以核對(duì)使用的Taq聚合酶的適用性。7.4.1對(duì)照試驗(yàn)PCR檢測(cè)應(yīng)重復(fù)2次,并設(shè)置陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。7.4.2PCR反應(yīng)體系EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(在),液)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(0滋L),10m)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(PC),L)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(管中),1滋L)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(反應(yīng)),引物)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(體),0滋)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(2),L)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(L),各)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(應(yīng)),滋L)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(系),T)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(包括10伊PCR),qDNA聚合酶)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(緩),1滋)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(沖),L)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(2),模)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(5滋L),板D)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(T),1)EQ\*jc3\*hps20\o\al(\s\up7(P),0)7.4.3PCR反應(yīng)參數(shù)延伸10s,30個(gè)循環(huán)。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)或置4益下保存。47.5擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)7.5.1熒光染料顯色檢測(cè)長(zhǎng)下檢測(cè)熒光,若PCR產(chǎn)物出現(xiàn)與陽性對(duì)照相同的熒光即為陽性結(jié)果,反之為陰性結(jié)果。7.5.2瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,加入6伊上樣緩沖液混勻,2%瓊脂糖凝膠電泳染色,紫外波長(zhǎng)下檢測(cè)。陰性對(duì)照和空白對(duì)照無條帶,且送檢樣品與陽性對(duì)照在500~750bp范圍內(nèi)有一條DNA條帶為陽性結(jié)果,否則為陰性結(jié)果。8結(jié)果判定在陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和空白對(duì)照結(jié)果符合規(guī)定的情況下,若送檢樣品與陽性對(duì)照一致,則判定測(cè)試結(jié)果為陽性,否則為陰性。9結(jié)果報(bào)告9.2鑒定報(bào)告樣品經(jīng)檢測(cè)后,實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體操作程序和結(jié)果做好詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)記錄,出具檢測(cè)報(bào)告。檢測(cè)報(bào)告至少包含以下內(nèi)容:送檢樣品的名稱、狀態(tài)和明確的標(biāo)識(shí);檢測(cè)依據(jù);取樣方法與日期;儲(chǔ)存條件;檢測(cè)開始和結(jié)束日期;檢測(cè)負(fù)責(zé)人和實(shí)驗(yàn)人員;陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、送檢樣品;特定方法取得的結(jié)果,結(jié)果使用的單位及計(jì)算方法;檢測(cè)結(jié)論;檢測(cè)過程觀察到的特別情況;其他需要報(bào)告的內(nèi)容。檢測(cè)結(jié)果應(yīng)來自同一實(shí)驗(yàn)室樣品的兩份送檢樣品。當(dāng)一份送檢樣品的結(jié)果為陽性,另一份為陰性時(shí),要重新測(cè)試?？梢赃m當(dāng)增加核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系中DNA模板量,使兩份樣品得到相同結(jié)果。每個(gè)樣品應(yīng)至少制備兩份DNA,必要時(shí)需檢測(cè)模板DNA的質(zhì)量,確保提取的DNA片段大于擴(kuò)增片段。核酸擴(kuò)增可設(shè)置PCR抑制劑對(duì)照。如果經(jīng)過兩次以上從核酸提取開始的重復(fù)檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果不一致,可在檢測(cè)報(bào)告中注明檢測(cè)低限,檢測(cè)低限應(yīng)符合最低含量水平。11廢棄物處理檢測(cè)過程中的廢棄物,收集后在焚燒爐中焚燒處理,有毒有害廢棄物應(yīng)經(jīng)過除害再進(jìn)行處理,處理要符合環(huán)保要求。5附錄A(資料性附錄)金錢白花蛇快速PCR鑒定體系的建立A.1金錢白花蛇及其偽品資料金錢白花蛇為2015年版《中國(guó)藥典》的收錄品種,來源于眼鏡蛇科環(huán)蛇屬動(dòng)物銀環(huán)蛇BungarusmulticinctusBlyth的幼蛇干燥體。目前藥材市場(chǎng)上金錢白花蛇偽品數(shù)目很多,質(zhì)量問題嚴(yán)重,其偽品共分為3大類:淤形態(tài)類似的其他種屬幼蛇,包括赤鏈蛇、赤鏈華游蛇、中國(guó)水蛇、鉛色水蛇、金環(huán)蛇、黃鏈蛇、黑背白環(huán)蛇等;于拼接蛇,系指使用金錢白花蛇頭,拼接其他偽品蛇的蛇身制成成品,主要有鉛色水蛇畫上橫紋拼接金錢白花蛇身,或赤鏈蛇、赤鏈華游蛇染色后接上金錢白花蛇頭制成的偽品;盂把大條的銀環(huán)蛇切開,加工成小蛇形態(tài),接上金錢白花蛇頭制成的偽品。對(duì)亳州、安國(guó)、玉林、廣州、昆明等幾個(gè)大型藥材市場(chǎng)進(jìn)行走訪調(diào)查發(fā)現(xiàn),在市場(chǎng)上見到的金錢白花蛇偽品總共有6種,分別為鉛色水蛇、中國(guó)水蛇、赤鏈蛇、赤鏈華游蛇、金環(huán)蛇、眼鏡蛇,其中最為常見的是赤鏈蛇和赤鏈華游蛇。A.2引物設(shè)計(jì)使用BioEdit軟件對(duì)正品金錢白花蛇以及黑眉錦蛇、紅點(diǎn)錦蛇、滑鼠蛇、赤鏈華游蛇、赤鏈蛇等偽品的Cytb序列進(jìn)行序列比較圖A.1金錢白花蛇正偽品序列比對(duì)及引物設(shè)計(jì)結(jié)果6A.3實(shí)驗(yàn)樣品采集不同藥材市場(chǎng)與13家不同藥房金錢白花蛇樣品進(jìn)行方法的適用性檢測(cè);采集各大藥材市場(chǎng)中存在的24種其他科屬蛇類樣品進(jìn)行特異性檢測(cè),見表A.1。表A.1蛇類樣品表物種拉丁名采集地個(gè)數(shù)1烏梢蛇安徽亳州82烏梢蛇北京同仁堂13烏梢蛇中藥資源中心14烏梢蛇北京永安堂15金錢白花蛇安徽亳州6金錢白花蛇深圳市藥品檢驗(yàn)所27金錢白花蛇河北安國(guó)17金錢白花蛇各大藥房7蘄蛇安徽亳州48蘄蛇安徽黃山19蘄蛇北京同仁堂1蘄蛇北京永安堂1蘄蛇中藥資源中心1眼鏡蛇安徽亳州3孟加拉眼鏡蛇安徽亳州1中國(guó)水蛇安徽亳州2鉛色水蛇安徽亳州1鉛色水蛇河北安國(guó)1赤鏈蛇安徽亳州3竹葉青安徽亳州1王錦蛇安徽亳州3王錦蛇深圳市藥品檢驗(yàn)所1王錦蛇中國(guó)食品藥品檢定研究院1紅紋滯卵蛇安徽亳州1紅紋滯卵蛇中國(guó)食品藥品檢定研究院1灰鼠蛇安徽亳州2短尾蝮蛇安徽亳州1蝮蛇安徽亳州1黑眉錦蛇深圳市藥品檢驗(yàn)所1黑眉錦蛇江西昌北1平頦海蛇安徽亳州2三索錦蛇河北安國(guó)1百花錦蛇中國(guó)食品藥品檢定研究院1赤鏈華游蛇中國(guó)食品藥品檢定研究院1虎斑游蛇中國(guó)食品藥品檢定研究院1虎斑游蛇河北安國(guó)1山烙鐵頭蛇中國(guó)食品藥品檢定研究院17A.4PCR反應(yīng)體系的建立模板/對(duì)照DNA(10~50ng)1滋L,用無菌雙蒸水補(bǔ)足反應(yīng)體積至25滋L。將反應(yīng)液振蕩心。將PCR管置PCR儀內(nèi)進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序:94益預(yù)變性1min;94益變性10s,62益退火延伸10s,30個(gè)循環(huán),獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。取出PCR管,對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)或置4益下保存。取5滋L反應(yīng)液經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,染色后接通電源按5V/cm恒壓進(jìn)行電泳20min,電泳結(jié)束后,將凝膠置于凝膠成像儀上或紫外透射儀上成像。上述PCR各主要參數(shù)均經(jīng)過系統(tǒng)的考察。A.4.1堿裂解法提取蛇類材料總DNA使用堿裂解法提取蛇類樣品總DNA,使用通用引物Cytb-H/Cytb-L進(jìn)行擴(kuò)增,以檢測(cè)所獲得蛇類樣品總DNA是否適用于PCR擴(kuò)增。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明,利用Cytb-H/Cytb-L引物,所有樣品均獲得約400bp大小的擴(kuò)增產(chǎn)物,見圖A.2,說明堿裂解法提取的DNA可以滿足PCR反應(yīng)的要求。M1M1234567891011121314151617181920212223C圖A.2Cytb-H/Cytb-L通用引物擴(kuò)增結(jié)果M:DL2000marker;1:烏梢蛇;2:金錢白花蛇;3:蘄蛇;4:眼鏡蛇;5:孟加拉眼鏡蛇;6:中國(guó)水蛇;7:鉛色水蛇;8:鉛色水蛇;9:赤鏈蛇;10:竹葉青;11:王錦蛇;12:王錦蛇;13:王錦蛇;14:紅紋滯卵蛇;15:灰鼠蛇;16:蝮蛇;17:黑眉錦蛇;18:平頦海蛇;19:三索錦蛇;20:百花錦蛇;21:赤鏈華游蛇;22:虎斑游蛇;23:山烙鐵頭蛇;C:陰性對(duì)照A.4.2金錢白花蛇分子鑒定條件考察使用設(shè)計(jì)的金錢白花蛇快速PCR鑒定引物對(duì)不同產(chǎn)地金錢白花蛇及其混偽品進(jìn)行擴(kuò)增,并考察:淤退火溫度:58益,60益,62益,64益;于PCR循環(huán)數(shù):30,28,26,24,22個(gè)循環(huán);盂變性溫度:司),TC-512型PCR擴(kuò)增儀(TECHNE公司)。對(duì)金錢白花蛇鑒定結(jié)果進(jìn)行考察,結(jié)果表明,PCR反應(yīng)程序中,94益預(yù)變性1min后,滿足變性溫度超過88益,變性時(shí)間超過5s,退火溫度在58~64益之間,退火時(shí)間超過5s,循環(huán)數(shù)超過28個(gè)循環(huán)參數(shù)均可準(zhǔn)確鑒定金錢白花蛇,見圖A.3。為增加金錢白花蛇鑒定的穩(wěn)定性,標(biāo)準(zhǔn)制定參數(shù)均在此基礎(chǔ)上有所提高。最終確定金錢白花蛇快速PCR鑒定的反應(yīng)程序?yàn)?94益預(yù)變性1min;A.4.3方法的適用性與特異性考察采用上述確定的程序,對(duì)金錢白花蛇13批樣品及20批偽品進(jìn)行鑒定(圖A.4、圖A.5),結(jié)果表明該體系能穩(wěn)定準(zhǔn)確地鑒定金錢白花蛇。8退火溫度退火溫度變性溫度58℃60℃62℃64℃M12121212變性時(shí)間20SM1212121212循環(huán)次數(shù)PCR儀Tsq酶30C28C26C24CM121212121212121212121292℃90℃88℃86℃abCdABC退火時(shí)間20S10S10S5S5S3S3Slsls圖A.3金錢白花蛇快速PCR反應(yīng)的優(yōu)化1:金錢白花蛇;2:眼鏡蛇。A:VeritiPCR擴(kuò)增儀(AppliedBiosystems公司);B:9700型PCR擴(kuò)增儀(ABI公司);C:TC-512型PCR擴(kuò)增儀(TECHNE公司)。a:rTaq(Takara公司)MM12345678910111213141516圖A.