重組DNA技術(shù)的基本工具-高二生物課件（人教版2019選擇性必修3）2

第3章

基因工程第1節(jié)重組DNA技術(shù)的基本工具新課程標(biāo)準(zhǔn)核心素養(yǎng)1.簡(jiǎn)述重組DNA技術(shù)所需的三種基本工具及其作用。2.認(rèn)同基因工程的誕生和發(fā)展離不開(kāi)理論研究和技術(shù)創(chuàng)新。3.進(jìn)行DNA的粗提取與鑒定。1.科學(xué)思維——模擬重組DNA分子的操作過(guò)程，說(shuō)出合成新DNA分子的基本原理。2.社會(huì)責(zé)任——關(guān)注基因工程的社會(huì)議題，參與討論基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展如何催生了基因工程。1．基因工程的誕生和發(fā)展(1)基因工程的誕生①1944年，艾弗里等人通過(guò)肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證明了遺傳物質(zhì)是________，還證明了DNA可以在同種生物的不同個(gè)體之間轉(zhuǎn)移。②1953年，沃森和克里克建立了___________________模型并提出了遺傳物質(zhì)自我復(fù)制的假說(shuō)。③1961年，尼倫伯格和馬太破譯了第一個(gè)編碼氨基酸的____________。④20世紀(jì)70年代初，多種限制酶、_____________酶和逆轉(zhuǎn)錄酶被相繼發(fā)現(xiàn)，為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創(chuàng)造了條件。⑤1973年，科學(xué)家證明__________可以作為基因工程的載體，構(gòu)建____________，使外源基因在原核細(xì)胞中成功表達(dá)，并實(shí)現(xiàn)物種間的基因交流。DNADNA雙螺旋結(jié)構(gòu)密碼子DNA連接質(zhì)粒重組DNA一、基因工程的誕生與發(fā)展(2)基因工程的發(fā)展①1982年，第一個(gè)基因工程藥物___________________被批準(zhǔn)上市。②1984年，我國(guó)科學(xué)家朱作言領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)培育出世界上第一條

_______________。③1985年，穆里斯等人發(fā)明______，為獲取目的基因提供了有效手段。④1990年，__________計(jì)劃啟動(dòng)。2003年，該計(jì)劃的測(cè)序任務(wù)順利完成。⑤21世紀(jì)以來(lái)，科學(xué)家發(fā)明了多種_________________，可以實(shí)現(xiàn)低成本測(cè)定大量核酸序列，加速了人們對(duì)基因序列的了解。⑥2013年，華人科學(xué)家張鋒及其團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道利用最新的__________技術(shù)編輯了哺乳動(dòng)物基因組。重組人胰島素轉(zhuǎn)基因魚(yú)PCR人類(lèi)基因組高通量測(cè)序技術(shù)基因組編輯項(xiàng)目具體內(nèi)容操作對(duì)象基因原理_________操作環(huán)境操作水平_________結(jié)果獲得_____________的新的生物類(lèi)型和生物產(chǎn)品優(yōu)點(diǎn)克服_______________的障礙;_________生物性狀基因重組分子水平符合人們需要遠(yuǎn)緣雜交不親和定向改造2.基因工程的概念生物體外思考討論：蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。讓細(xì)菌的毒蛋白基因在棉花細(xì)胞中表達(dá)，可培育出抵抗棉鈴蟲(chóng)害的抗蟲(chóng)棉。想一想需要做哪些關(guān)鍵工作？普通棉花抗蟲(chóng)棉？一、限制性核酸內(nèi)切酶

——“分子手術(shù)刀”1、來(lái)源：主要從原核生物中分離純化出來(lái)

2、種類(lèi)：現(xiàn)在已經(jīng)從約300種微生物中分離出了約4000種限制性?xún)?nèi)切酶(限制酶)。3、作用特點(diǎn)：具有專(zhuān)一性，表現(xiàn)在以下兩個(gè)方面4、作用部位:特定切點(diǎn)上的磷酸二酯鍵5'3'5'3'TAGGTATCCA磷酸二酯鍵①能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中特定的核苷酸序列。②能夠切割特定序列中的特定位點(diǎn)。5、兩種常用的限制酶：限制酶的命名是根據(jù)細(xì)菌種類(lèi)而定，以EcoRI為例:

E：Escherichia(屬)

co：coli(種)

R：RY13(品系)

I：首先發(fā)現(xiàn)在此類(lèi)細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的順序EcoRⅠ：大腸桿菌（Escherichiacoli）R型菌株中分離出的第一個(gè)限制酶；SmaⅠ：粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratiamarcescens）中分離出的第一個(gè)限制酶。EcoRⅠ和SmaⅠ黏性末端黏性末端（1）EcoRI限制酶的切割:被限制酶切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。只能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開(kāi)。中軸線（2）SmaI限制酶的作用只能識(shí)別CCCGGG序列，并在C和G之間切開(kāi)。當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處切開(kāi)時(shí)，切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。在C和G之間切開(kāi)6、結(jié)果：產(chǎn)生黏性末端或平末端思考討論1：仔細(xì)觀察以下四種限制酶識(shí)別的特定序列有何特點(diǎn)？EcoRⅠ……G-A-A-T-T-C…………C-T-T-A-A-G……HindⅢ……A-A-G-C-T-T…………T-T-C-G-A-A……BamHⅠ……G-G-A-T-C-C…………C-C-T-A-G-G……TaqⅠ………T-C-G-A………………A-G-C-T………限制酶所識(shí)別的序列的特點(diǎn)是：呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對(duì)稱(chēng)，無(wú)論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ(chēng)重復(fù)排列的，稱(chēng)為回文序列。思考討論2：

原核生物很容易受到自然界中外源DNA的入侵，但是長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，這些原核生物卻沒(méi)有因?yàn)橥庠碊NA的入侵而滅絕。你推測(cè)這其中的原因是？

原核生物細(xì)胞中的限制酶會(huì)將外源DNA切割掉，使之失效，以保證自身的安全，但是不會(huì)切割自身的DNA，這是原核生物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的一套防御機(jī)制?！瑿TACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAA…………GATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT…………CTACGATG……GATGCTACTTAAAATTCCCTAA……GGGATT……AATTCCGTAGGGCATCTTAA黏性末端目的基因練習(xí)：使用EcoRI剪切目的基因1.要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性(平)末端？要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性(平)末端。2.如果把兩種來(lái)源不同的DNA用同一種限制酶來(lái)切割，會(huì)怎樣呢？會(huì)產(chǎn)生相同的黏性(平)末端，然后讓兩者的黏性(平)末端黏合起來(lái)，就似乎可以合成重組的DNA分子了。思考討論3：G

AA

TT

CC

TT

AA

GG

AA

TT

CC

TT

AA

GG

C

TT

AA

AA

TT

C

GGC

TT

AA

AA

TT

C

G用同種限制酶切割(EcoRⅠ)3.把兩種來(lái)源不同的DNA進(jìn)行重組，應(yīng)該怎樣處理？

缺口怎么辦？G

C

TT

AA

AA

TT

C

GGCTTAA

AA

TT

C

G二、DNA連接酶——分子縫合針1.作用：將雙鏈DNA片段“縫合”起來(lái)，恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵?？砂佯ば阅┒酥g的縫隙“縫合”起來(lái)，2.種類(lèi)：類(lèi)型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來(lái)源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點(diǎn)差別DNA連接酶DNA連接酶DNA連接酶ATAGTCCGAATT連接兩個(gè)DNA片段3.與DNA聚合酶區(qū)別：CAATTDNA聚合酶GAGTATCDNA聚合酶連接單個(gè)脫氧核苷酸形成單鏈DNA連接酶DNA聚合酶相同作用實(shí)質(zhì)化學(xué)本質(zhì)不同點(diǎn)模板作用對(duì)象作用結(jié)果 用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)

不需要需要DNA的一條鏈作模板形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復(fù)制只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵3.與DNA聚合酶區(qū)別：根據(jù)所學(xué)知識(shí)，完成以下填空：①限制酶②解旋酶③DNA連接酶④DNA聚合酶⑤RNA聚合酶baA.切斷a處的酶為_(kāi)______

B.連接a處的酶為_(kāi)______C.切斷b處的酶為_(kāi)______①③④②a：磷酸二酯鍵；b：氫鍵練習(xí)：質(zhì)粒（最常用）將外源基因送入受體細(xì)胞。1.作用：動(dòng)植物病毒λ噬菌體的衍生物2.種類(lèi)：質(zhì)粒三、基因進(jìn)入細(xì)胞的載體——分子運(yùn)輸車(chē)

質(zhì)?！懵兜?、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。3、運(yùn)載體需具備的條件（1）能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存（2）有一個(gè)至多個(gè)限制酶切點(diǎn)（3）有某些標(biāo)記基因（4）對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害、易分離能進(jìn)入受體細(xì)胞并在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并表達(dá)；便于與不同目的基因結(jié)合便于鑒定和篩選有標(biāo)記基因的存在，可用含青霉素的培養(yǎng)基鑒別。有切割位點(diǎn)能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制實(shí)際上自然存在的質(zhì)粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進(jìn)行人工改造后才能用于基因工程操作。補(bǔ)：標(biāo)記基因?qū)χ亟MDNA的鑒定和選擇原理標(biāo)記基因通常有:①抗生素的抗性基因，如:抗氨芐青霉素基因(ampr)、抗四環(huán)素基因(tetr)②熒光蛋白基因，如:綠色熒光蛋白基因(GFP)、紅色熒光蛋白基因(RFP)重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞不是100%，而且導(dǎo)入率較低質(zhì)粒的特點(diǎn)質(zhì)粒是基因工程中最常用的運(yùn)載體最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的質(zhì)粒細(xì)胞染色體外能自主復(fù)制的小型環(huán)狀DNA分子存在于許多細(xì)菌及酵母菌等生物中質(zhì)粒的存在對(duì)宿主細(xì)胞無(wú)影響質(zhì)粒的復(fù)制只能在宿主細(xì)胞內(nèi)完成4、質(zhì)粒的特點(diǎn)：真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過(guò)人工改造的

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC……TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG…目的基因…

TCCTAG…

AGGATCTTAAAATTCCATAC…

GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGGTATG…實(shí)例：重組DNA分子的模擬操作AATTCGGCATAC……TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATG目的基因…

TCCTAG…

AGGATCTTAAAATTCCATAC…

GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGGGTATG…GCCGTATG…【典例】圖甲是含有目的基因的外源DNA片段，圖乙是用于將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的質(zhì)粒（陰影部分表示抗生素抗性基因），相關(guān)限制酶的作用部位如圖所示，現(xiàn)欲培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因抗病植株，回答下列問(wèn)題。（1）上述操作中不宜選用SmaI，原因是SmaI會(huì)破壞__________和_____________。（2）在基因工程的操作中，不宜選用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，__________________________________________________。目的基因抗性基因目的基因只有一側(cè)含有黏性末端，不能插入到質(zhì)粒中1、選目的基因兩端和運(yùn)載體都有的酶切位點(diǎn)；2、所選酶切位點(diǎn)不能破壞目的基因以及標(biāo)記基因。方法總結(jié)：---選擇酶切位點(diǎn)的原則(1)限制性?xún)?nèi)切核酸酶均能特異性地識(shí)別6個(gè)核苷酸序列()(2)DNA連接酶能將兩堿基間通過(guò)氫鍵連接起來(lái)(

)(3)E.coliDNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端(

)(4)限制酶和解旋酶的作用部位相同(

)(5)質(zhì)粒是雙鏈環(huán)狀DNA分子，是基因工程常用的載體。()××××√【基礎(chǔ)過(guò)關(guān)】【典例1】如表為常用的限制酶及其識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，據(jù)表分析以下說(shuō)法正確的是(

)限制酶BamHⅠEcoRⅠHindⅡ識(shí)別序列和切割位點(diǎn)G↓GATCCG↓AATTCGTY↓RAC限制酶KpnⅠSau3AⅠSmaⅠ識(shí)別序列和切割位點(diǎn)GGTAC↓C↓GATCCCC↓GGG(注：Y表示C或T，R表示A或G)DA.一種限制酶只能識(shí)別一種脫氧核苷酸序列B.限制酶的切割位點(diǎn)一定位于識(shí)別序列的內(nèi)部C.不同限制酶切割后一定形成不同的黏性末端D.限制酶切割后形成的不一定都是黏性末端【典例2】下列關(guān)于質(zhì)粒的敘述，正確的是（）A.質(zhì)粒是廣泛存在于細(xì)菌細(xì)胞中的一種顆粒狀細(xì)胞器B.質(zhì)粒是細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中能自主復(fù)制的小型環(huán)狀DNA分子C.質(zhì)粒只有在侵入宿主細(xì)胞后在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制D.細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制過(guò)程一定是在宿主細(xì)胞外獨(dú)立進(jìn)行E.質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體B【典例3】用限制酶EcoRⅤ單獨(dú)切割某質(zhì)粒，可產(chǎn)生1個(gè)14kb(1kb即1000個(gè)堿基對(duì))的長(zhǎng)鏈，而同時(shí)用限制酶EcoRⅤ、MboⅠ聯(lián)合切割該質(zhì)粒，可得到三種長(zhǎng)度的DNA片段，見(jiàn)下圖(其中*表示EcoRⅤ切割后的一個(gè)黏性末端)。若用MboⅠ單獨(dú)切割該質(zhì)粒，則產(chǎn)生的DNA片段的長(zhǎng)度為(

)A.2.5kb和5.5kb B.2.5kb和6kbC.5.5kb和8kb D.6kb和8kbD限制酶DNA連接酶載體①對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害；②有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)；③有特殊的標(biāo)記基因；④能自我復(fù)制或能整合到宿主DNA上。質(zhì)粒、λ噬菌體衍生物

、動(dòng)植物病毒基因工程的