DB12T 200-2004 鮮番茄及番茄制品中轉(zhuǎn)基因成分的定性檢測(cè)方法

備案號(hào)：鮮番茄及番茄制品中轉(zhuǎn)基因成分的定性檢測(cè)方法infreshtomatoandtomatoprocessedproducts天津市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDMIF-GEN-TIBI、DMIF-GEN-T1B2、DMIF-GEN-T1B3、DMIF-GE本標(biāo)準(zhǔn)由天津市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：天津市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心、中華人民共和國遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：金紅、趙昕、王永、程奕、鄭貴忠。1鮮番茄及番茄制品中轉(zhuǎn)基因成分的定性檢測(cè)方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了鮮番茄和番茄制品中轉(zhuǎn)基因成分的定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(簡稱為PCR)檢測(cè)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于對(duì)新鮮番茄果實(shí)和以番茄果實(shí)加工而成的番茄醬、番茄沙司和番茄汁等制品中轉(zhuǎn)基因成分的定性PCR檢測(cè)。適用于轉(zhuǎn)基因番茄Nema282F品系的鑒定。2規(guī)范性引用文件修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法SN/T1193基因檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求SN/T1194植物及其產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的抽樣和制樣方法SN/T1204植物及其加工產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢驗(yàn)方法下列術(shù)語、定義和縮略語適用于本標(biāo)準(zhǔn)。物種本身不具有的、而是來源于其他物種的功模板基因序列先經(jīng)高溫變性成為單鏈，在DNA聚合酶作用和適宜的反應(yīng)條件下，根據(jù)模板序列設(shè)計(jì)的兩條引物分別與模板DNA兩條鏈上相應(yīng)的一段互補(bǔ)序列發(fā)生退火而相互結(jié)合，接著在DNA聚合酶的作用下以四種脫氧核糖核酸(dNTPs)為底物，使引物得以延伸，然后不斷重復(fù)變性、退火和延伸這一循環(huán)，使欲擴(kuò)增的基因片段以幾何倍數(shù)擴(kuò)增。對(duì)樣品中轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行檢測(cè)，以判定該樣品是否為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。3.4.1GMO:geneticallymodifi3.4.2PCR:polymerasechainreaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。3.4.3DNA:deoxyribonucleicacid,脫氧核糖核酸。3.4.4dNTPs:deoxyribonucleosidetriphosphate,脫氧核甘三磷酸。3.4.5CaMV35S:35Spromoterfromcauliflowermosaicvirus,花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子。3.4.8PG:polygalacturonase,多聚半乳糖醛酸酶3.4.9Nema282F:美國Zeneca公司的獲準(zhǔn)商品化啟動(dòng)子、NOS終止子和neo基因及人工合成反義PG基因等。24防污染措施檢測(cè)過程中防止交叉污染的措施按照SN/T1193中的規(guī)定執(zhí)行。5抽樣和制樣按照SN/T1194中規(guī)定的方法進(jìn)行。6.1原理番茄原料所插入的外源基因設(shè)計(jì)引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，特異性擴(kuò)增外源基因的DNA片斷，根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果，判斷該樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分。6.2主要儀器6.2.1電子天平(感量分別為0.01g和0.0001g)。6.2.2恒溫水浴裝置。6.2.3低溫超速離心機(jī)，臺(tái)式冷凍離心機(jī)。6.2.8高溫干燥箱。6.2.9微量移液器(0.1~2.5HL,1~10HL,10~100HL,100~1000HL)。6.2.12凝膠成像分析系統(tǒng)或紫外透射分析儀。6.2.17紫外分光光度計(jì)6.3試劑和材料實(shí)驗(yàn)用水為I級(jí)。6.3.2三羥甲基氨基甲烷(Tris)。6.3.3二水乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na·2H?O)。6.3.4聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。6.3.8三氯甲烷：異戊醇=24:1(體積比)。6.3.970%乙醇。g,PVP20g,用濃鹽酸調(diào)pH值至8.0。36.3.12氯化鈉溶液(1.2mol/L):1000ml水中溶解70g。6.3.13乙酸鈉溶液(3mol/L):800ml水中溶解408.1g三水乙酸鈉，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.2,加水定容至1L。6.3.14Tris-HCI溶液(0.1mo/L,pH8.0):800ml水中溶解12.114gTris,冷卻至室溫，用濃鹽酸調(diào)pH值至8.0,定容至1L。6.3.15TE緩沖液：Tris0.010mol/L,Na?EDTA1.0mmol/L,用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0。6.3.18dNTP(dATP,dCTP,dGTP,dUTP)溶液6.3.19Taq酶：2U/HL。6.3.20實(shí)驗(yàn)用水：按GB/T6682規(guī)定執(zhí)行。6.3.21溴化乙錠(EB):10m6.3.26Nema282F轉(zhuǎn)基因番茄陽性樣品。6.3.28濾芯吸頭(10L,20HL,100L,200HL,1000HL)。6.3.29PCR反應(yīng)管(200H)。6.3.31引物：轉(zhuǎn)基因番茄的內(nèi)源基因和外源基因檢測(cè)時(shí)所用的引物序列見表1。檢測(cè)基因擴(kuò)增片斷長度基因性質(zhì)內(nèi)源基因外源基因aatcctgttgccggtcttg-3'’tatcctagttgcgcgcta-3’外源基因gatccttagaagcatctagt-3’人工合成基因品系鑒定外源基因外源基因*:轉(zhuǎn)基因番茄時(shí)擴(kuò)增出383bp和180bp兩個(gè)不同大小的DNA片段，非轉(zhuǎn)基因番茄只能擴(kuò)增出383bp6.4.1樣品的DNA提取取番茄醬等液態(tài)加工樣品50mL,室溫10000r/min離心15min,棄上清，取沉淀3g轉(zhuǎn)入預(yù)冷的4研缽中，置于冰上研細(xì)，全部轉(zhuǎn)入50mL離心管中。用0.1molLTris-HCI(6.3.14)溶液反復(fù)洗滌樣品三次，方法為加入30mL0.1mol/LTris-HCl溶液(6.3.14),反復(fù)搖勻，于4℃10000r/min離心15min,棄上清，留沉淀用于DNA提取。取鮮番茄樣品2g,置預(yù)冷研缽中，加入液氮(6.3.30)研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)入2mL離心管中，用取經(jīng)預(yù)處理的樣品加入10mL經(jīng)65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液(6.3.10),混勻。65℃水浴1小時(shí)，期間每隔10min輕輕顛倒混勻一次加入等體積的豐氯甲烷+異戊醇(6.3.8)緩慢顛倒搖勻5min,于10000r/min離心10min,取上清，搖勻，室溫靜置1小時(shí)，12000r/min離心10min,棄上清，沉淀加入1.2mol/LNaCl溶液(6.3.12)1mL溶解沉淀，室溫靜置5min,加入等體積三氯甲烷+異戊醇(6.3.8)顛倒搖勻1min,于12000r/min離心10min,取上清，加入10%的3mol/L乙酸鈉(6.3.13)和等體積的冷異丙醇(6.3.7),緩慢混勻，4℃靜置過夜，14000r/min離心15min,棄上清，加入400HL70%冷乙醇(6.3.9)洗滌沉淀，除去殘留的乙醇，待沉淀干燥后，加入30HL滅菌的去離子水(6.3.20)溶解從番茄加工制品提取的DNA沉淀，加入100HLTE(6.3.15)溶解從鮮番茄提取的DNA沉淀，均置-20℃保存?zhèn)溆谩?.4.2樣品中DNA產(chǎn)量和質(zhì)量的鑒定采用紫外分光光度法對(duì)從鮮番茄中提取的DNA進(jìn)行產(chǎn)量和質(zhì)量的鑒定。紫外分光光度法檢測(cè)核酸的最佳范圍是2wg/mL~50Hg/mL,OD值應(yīng)該在0.05~1的區(qū)間內(nèi)。將DNA溶液做適當(dāng)?shù)南♂?，放入紫外分光光度?jì)的比色皿中，于260nm處測(cè)定其鏈DNA。PCR級(jí)DNA溶液的OD2采用內(nèi)源基因擴(kuò)增法鑒定從番茄加工制品中提取的DNA的質(zhì)量。通過PCR技術(shù)，擴(kuò)增番茄內(nèi)源6.4.3定性PCR檢測(cè)6.4.3.1PCR反應(yīng)體系檢測(cè)鮮番茄和以番茄果實(shí)為原料的番茄加工制品中內(nèi)源基因和外源基因采用的PCR檢測(cè)體系見表2。反應(yīng)體系中各試劑的量根據(jù)反應(yīng)體系的總體積進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。每個(gè)反應(yīng)稱10×PCR反應(yīng)緩dNTP溶液(正向引物(1反向引物(D水對(duì)進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí)反應(yīng)體系必須設(shè)置陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。陽性對(duì)照：用Nema282F轉(zhuǎn)基因番茄材料中提取的DNA作為PCR反應(yīng)體系的DNA模板；陰性對(duì)照：用非轉(zhuǎn)基因番茄材料中提取6.4.3.3樣品中內(nèi)源基因和外源基因的檢測(cè)5檢測(cè)鮮番茄和以番茄果實(shí)為原料的番茄加工制品中的內(nèi)源基因和外源基因的PCR檢測(cè)的參考反應(yīng)條件見表3。反應(yīng)條件需根據(jù)檢測(cè)儀器的性能做相應(yīng)調(diào)整。被擴(kuò)增的擴(kuò)增最后延伸SSNptI(215b緩沖液制備2%的瓊脂糖凝膠(凝膠融化后晾至60℃合適的DNA分子量標(biāo)記物，選擇合適的電壓(3V/cm~5V/cm)6.4.3.5凝膠成像分析(照相)電泳結(jié)束后，將球脂糖凝膠置于凝膠成像儀上或紫外透射儀上成像。根據(jù)DNA分子量標(biāo)記判斷擴(kuò)增出的目的條帶的大小，將電泳結(jié)果形成電子文件存檔或用照相系統(tǒng)拍照。6.4.4結(jié)果分析與判定對(duì)于番茄特異性內(nèi)源基因PG34片段的檢測(cè)，如果陰性對(duì)照、待測(cè)樣品和陽性對(duì)照的PCR產(chǎn)物都出現(xiàn)383bp的條帶，則表明提取的待測(cè)樣品DNA符合PCR反應(yīng)的要求，能用于外源基因的檢測(cè)；否則不能用于檢測(cè)外源基因，應(yīng)該重新提取待測(cè)樣品DNA,直到能擴(kuò)增出383bp的條帶，防止檢測(cè)中產(chǎn)對(duì)待測(cè)樣品DNA提取液進(jìn)