DB36T-飼料及飼料原料中黃曲霉毒素B1的快速篩查-膠體金快速定量法

ICS?FORMTEXT點(diǎn)擊此處添加ICS號(hào)FORMTEXT點(diǎn)擊此處添加中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)分類號(hào)FORMTEXT?????DB36DB36/TFORMTEXTXXX—FORMTEXTXXXXFORMTEXT?????FORMTEXT飼料及飼料原料中黃曲霉毒素B1的快速篩查膠體金快速定量法FORMTEXTScreeningofaflatoxininanimalfeedingstuffs——RapidQuantitativeMethodofColloidalGoldTechniqueFORMTEXT點(diǎn)擊此處添加與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識(shí)FORMDROPDOWNFORMTEXT?????FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX發(fā)布FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX實(shí)施江西省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局???發(fā)布DBXX/TXXX—XXXX前??言 II1范圍 12規(guī)范性引用文件 13原理 14試劑和材料 15儀器和設(shè)備 26試樣制備與保存 27分析步驟 28結(jié)果表述 29重復(fù)性 3附錄A（資料性附錄）膠體金快速定量檢測(cè)產(chǎn)品性能評(píng)價(jià)要求 4前??言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由江西省飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：江西省獸藥飼料監(jiān)察所、北京勤邦生物技術(shù)有限公司、拜發(fā)分析系統(tǒng)銷售(北京)有限公司、雙胞胎（集團(tuán)）股份有限公司、江西正邦科技股份有限公司。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：楊琳芬、符金華、李瑾瑾、曹東山、張穎、宋灝、廖豐、劉世寧、賀麗麗。飼料及飼料原料中黃曲霉毒素B1的快速篩查膠體金快速定量法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用膠體金免疫層析法快速篩查測(cè)定飼料及飼料原料中黃曲霉毒素，為定量篩查方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于玉米、小麥、大米、黃豆、豆粕、花生粕、DDGS等原料及以玉米粉，小麥粉為主要基質(zhì)的飼料成品中黃曲霉毒素的快速定量篩查。定量檢測(cè)限為4μg/kg(ppb)，檢測(cè)范圍為4μg/kg(ppb)—100μg/kg(ppb)。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T20195動(dòng)物飼料試樣的制備原理本方法應(yīng)用了免疫層析原理。將氯金酸用還原法制成一定直徑的金溶膠顆粒，標(biāo)記針對(duì)黃曲霉毒素的單克隆抗體，用噴金法固定于硝酸纖維素（NC）膜上，同時(shí)，在硝酸纖維素（NC）膜的顯色區(qū)域有兩個(gè)條帶：質(zhì)控帶和檢測(cè)帶，質(zhì)控條帶上包被有黃曲霉毒素抗原，檢測(cè)條帶上包被有抗黃曲霉毒素單克隆抗體的二抗。試樣提取液中的黃曲霉毒素與檢測(cè)條中膠體金微粒上的單克隆抗體發(fā)生反應(yīng)，形成氯金酸-抗體-抗原聚合物，此聚合物和剩余的氯金酸-抗體聚合物在側(cè)流作用下移動(dòng)，當(dāng)?shù)竭_(dá)質(zhì)控線時(shí)，質(zhì)控條帶上包被的抗原與剩余的氯金酸-抗體聚合物結(jié)合發(fā)生呈色反應(yīng)，顏色深淺與試樣中黃曲霉毒素毒素含量負(fù)相關(guān)，而氯金酸-抗體-抗原聚合物繼續(xù)在側(cè)流作用下移動(dòng)，到達(dá)檢測(cè)條帶后，與檢測(cè)條帶上的二抗形成氯金酸-抗體-抗原&二抗的聚合物，此條帶的顏色同試樣中的黃曲霉毒素含量正相關(guān)。由于試樣中的黃曲霉毒素的含量一定，質(zhì)控帶的顏色和檢測(cè)帶的顏色此消彼長(zhǎng)，等試驗(yàn)反應(yīng)平衡后，用讀數(shù)儀掃描檢測(cè)條上顯色區(qū)域內(nèi)檢測(cè)條帶和質(zhì)控條帶顏色深淺，根據(jù)顏色深淺和讀數(shù)儀內(nèi)置曲線計(jì)算出試樣中黃曲霉毒素含量。試劑和材料除非另有說(shuō)明，本法所用試劑均為分析純，水為去離子水，符合GB/T6682二級(jí)水的規(guī)定。膠體金免疫層析快速篩查組件（參見(jiàn)附錄A）。黃曲霉毒素殘留檢測(cè)試紙條。樣本稀釋液。甲醇。氫氧化鈉（NaOH1mol/L）：稱取40g氫氧化鈉，加水定容至1000ml，混勻。鹽酸溶液（HCL，1mol/L）：量取83.33mLρ=1.18g/mL的鹽酸，加水定容至1000mL，混勻。70%甲醇：量取70mL甲醇，加入30mL水，混勻。儀器和設(shè)備天平：感量0.01g。渦旋儀。離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥3000r/min。微量移液器：20μL～200μL。聚苯乙烯離心管：2mL，50mL。讀數(shù)儀：可測(cè)定并顯示膠體金定量檢測(cè)條的測(cè)定結(jié)果。試樣制備與保存試樣制備按GB/T20195要求制備試樣。試樣保存將試樣于-10℃～-20℃下避光保存。分析步驟試樣提取稱取(5.00±0.01)g谷物樣品至50mL聚苯乙烯離心管中，加入10mL70%甲醇（4.5），將瓶塞蓋緊，渦動(dòng)3min，室溫3000r/min以上離心5min，取100μL上清液加入200μL樣本稀釋液（4.1.2），混勻，待測(cè)。非谷物基質(zhì)，如果上清液pH值小于6或大于8，則需要用1mol/L氫氧化鈉（4.3）溶液或1mol/L鹽酸溶液（4.4）調(diào)節(jié)pH至7左右，然后取100μL此溶液加入200μL樣本稀釋液（4.1.2），混勻，待測(cè)不同廠家的黃曲霉毒素膠體金快速定量條所用的樣品制備方法不同，如提供黃曲霉毒素膠體金快速定量檢測(cè)條使用說(shuō)明，則按照使用說(shuō)明中規(guī)定的方法進(jìn)行操作。試樣篩查將膠體金檢測(cè)條（4.1.1）從冷藏狀態(tài)（2℃-8℃）取出放置至最適試驗(yàn)溫度23℃-25℃。將讀數(shù)儀（5.6）打開(kāi)，按照提示輸入樣品，檢測(cè)人員，檢測(cè)項(xiàng)目，方法等相關(guān)信息。將比色卡平放于桌面，用讀數(shù)儀掃描比色卡上的二維碼，等待檢測(cè)。準(zhǔn)確移取100μL待測(cè)溶液（7.1），加入檢測(cè)條加樣孔中，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)5分鐘。孵育5min后，用讀數(shù)儀掃描檢測(cè)卡，按下讀取鍵，幾秒鐘讀數(shù)儀的屏幕上即可顯示測(cè)試樣中黃曲霉毒素的含量信息。如結(jié)果顯示：invalid,如果檢測(cè)條上質(zhì)控線（C線）無(wú)色，測(cè)試線（T線）上顏色肉眼可見(jiàn)很深，則表明試樣中黃曲霉毒素含量非常高，可將試樣提高稀釋倍數(shù)，重新進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表述黃曲霉毒素含量以ppb(μg/kg微克每千克）表示，由讀數(shù)儀直接顯示和讀取。重復(fù)性在同一實(shí)驗(yàn)室，由同一操作者使用相同儀器，按相同的測(cè)定方法，并在短時(shí)間內(nèi)對(duì)同一被測(cè)試對(duì)象相互獨(dú)立進(jìn)行測(cè)試獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值大于算術(shù)平均值20%的情況不超過(guò)5%。

（資料性附錄）

膠體金快速定量檢測(cè)產(chǎn)品性能評(píng)價(jià)要求樣本稀釋液配制（能達(dá)到相當(dāng)效果者均可）磷酸二氫鉀0.2g十二水合磷酸氫二鈉2.9g氯化鈉8.0g氯化鉀0.2g加水定容至1000mL?；疽蠊ぷ鳝h(huán)境要求氣溫：23℃～25℃?？乖簏S曲霉毒素半抗原與載體蛋白進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)，能夠達(dá)到包被要求?？贵w要求用黃曲霉毒素抗原免疫小鼠，制備針對(duì)黃曲霉毒素的特異性單克隆抗體，能夠達(dá)到檢測(cè)要求原材料要求樣品墊：玻璃纖維或無(wú)紡布。金釋放墊：玻璃纖維片，免疫金釋放時(shí)間小于10min，釋放效率大于90%。反應(yīng)膜：硝酸纖維素膜，孔徑為0.45μm，4cm浸潤(rùn)時(shí)間不小于140s。吸水紙。塑料卡盒：丙烯腈、丁二烯和苯乙烯的三元共聚物。性能要求準(zhǔn)確度采用10μg/kg（10ppb）、20μg/kg（20ppb）和50μg/kg（50ppb）三個(gè)濃度水平的陽(yáng)性樣品，每個(gè)濃度水平測(cè)定不低于6次，通過(guò)偏差來(lái)表達(dá)，3個(gè)濃度水平的6次重復(fù)的偏差均應(yīng)控制在-20%～+20%之間。精密度采用10μg/kg（10ppb）濃度水平的實(shí)際樣品，測(cè)定不低于6次，通過(guò)批內(nèi)變異系數(shù)來(lái)表達(dá)，變異系數(shù)應(yīng)≤20%。定量檢測(cè)限計(jì)算20份陰性樣品測(cè)定均值加10倍標(biāo)準(zhǔn)差，其結(jié)果應(yīng)小于或等于產(chǎn)品靈敏度標(biāo)示值。批間穩(wěn)定性采用20μg/kg（20ppb）左