生物化學檢驗常用技術課件

1、第三章 生物化學檢驗常用技術,光譜分析技 電化學分析技術 干化學分析技術 電泳分析技術 基因擴增技術,第一節(jié) 光譜分析技術,吸收光譜分析技術 發(fā)射光譜分析技術 散射光譜分析技術,一、吸收光譜分析法,4,光源,單色器,吸收池,檢測器,顯示器,鎢燈、鹵鎢燈 3501000 氫燈、氘燈 180360,濾光片 棱鏡 光柵,玻璃比色皿 石英比色皿,5,(一)、分光光度技術的基本原理,1、吸光度與透光度,A = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I,當光線通過均勻、透明的溶液時可出現(xiàn)三種情況：一部分光被散射，一部分光被吸收，另有一部分光透過溶液。設入射光強度為I0，透射光強度為I，I和I0之比稱

2、為透光度，即：,T = I/I0,T100%為T%稱為百分透光度。透光度的負對數(shù)稱為吸光度即：,6,2、Lambert-Beer定律,Lambert-Beer定律是討論溶液吸光度同溶液濃度和溶液層 厚度之間關系的基本定律，該定律是分光分析的理論基礎。,A = KLC,A 為吸光度； K 為比例常數(shù)，稱為吸光系數(shù)； L 為溶液層厚度，稱為光徑； C 為溶液濃度,Lambert-Beer定律適用于可見光、紫外光、紅外光和均勻非散射的液體,當一束平行單色光通過均勻的非散射樣品時，吸光度與溶液層厚度和溶液濃度成正比。,L,Lambert-Beer定律適用于: 可見光、紫外光、紅外光和均勻非散射的液體以

3、及分散均勻的固態(tài)或氣態(tài)樣品.,單色光 均勻介質(zhì) 吸收物質(zhì)無相互作用,3、Lambert-Beer定律的應用條件,4、Lambert-Beer定律的偏離現(xiàn)象,溶液：稀溶液、化學變化 光學; 非單色光、散射和折射 儀器; 光源、實驗條件,在分光光度法中，為消除顯色劑及樣品中各種共存有色物質(zhì)產(chǎn)生的干擾、抵消比色皿和試劑對入射光的影響而用來調(diào)節(jié)儀器百分透光率為100%的溶液。,5、空白溶液的選擇,蒸餾水,試劑,樣品,不含待測元素,不顯色,1、溶劑空白：不加樣品和任何試劑，用純?nèi)軇ㄈ缯麴s水或其他有機溶劑）作參比溶液。 選擇原則：當顯色劑及其它試劑均無色，被測試樣中又無其他有色離子時，選用溶劑參比。,2

4、、試劑空白：用不加樣品，而顯色劑和其他試劑都相同的溶液作參比溶液。 選擇原則：當顯色劑本身有顏色或其它試劑有顏色，被測試樣中又無其他有色離子時，選用試劑參比。,3、樣品空白：用不加顯色劑的樣品溶液作參比溶液。 選擇原則：當試樣溶液有顏色，而試劑、顯色劑均無顏色時，選用樣品空白。,4、平行操作空白：按樣品分析完全相同的操作步驟，用不含待測元素的樣品進行平行操作， 以消除操作過程中引入干擾雜質(zhì)所帶來的誤差。 選擇原則：當操作過程中由于試劑、器皿、水和氣等因素引入了一定量的被測試樣組分的干擾離子,5、不顯色空白：可將一份試樣加入適當?shù)难诒蝿?，將被測組分掩蔽起來，使之不再與顯色劑作用，而顯色劑 和其它

5、試劑均按照操作手續(xù)加入，以此作為參比溶液，這樣可以消除顯色劑和一些共存組分的干擾。 選擇原則：當顯色劑和被測試樣均有顏色時，可選用此法。,(二)、分光光度法在生化檢驗中的應用,靈敏度高、操作簡便、應用廣泛,1、對未知化合物進行定性分析,2、對待測物質(zhì)進行定量測定,定性依據(jù)：,最大吸收波長max和摩爾吸光系數(shù),標準曲線法和比較法,11,(1).標準曲線法,根據(jù)Lambert-Beer定律，液體的濃度在一定范圍內(nèi)與吸光度成正比關系。配制一系列濃度的標準品溶液（濃度應包含高、中、低濃度范圍），按標本處理方法作相同處理，在特定波長下測定吸光度，以標準液濃度為橫座標，以吸光度為縱座標，將對應各點連成一條

6、通過原點的直線，這條直線稱為標準曲線。待測溶液測定吸光度后，從標準曲線上可查出其相應的濃度。,方法：,5.標準溶液設置的濃度范圍足夠大。,13,2比較法,CR=(AR Cs)/As,己知濃度的標準品和標本作同樣處理，使用相同的空白，同時測定標準管和標本的吸光度，根據(jù)測定的吸光度及標準品濃度，可直接計算出標本的濃度，計算公式為：,二、發(fā)射光譜分析法,處于激發(fā)態(tài)的待測元素，原子回到基態(tài)時以輻射的形式釋放出能量，由此而產(chǎn)生的光譜稱為發(fā)射光譜，對元素進行定性與定量分析的方法。,發(fā)射光譜是指樣品本身產(chǎn)生的光譜被檢測器接收；吸收光譜是光源發(fā)射的光譜被樣品吸收了一部分，剩下的那部分光譜被檢測器接收。,火焰光

7、度法,熒光光度法,火焰光度法是以火焰為激發(fā)光源，用光電檢測系統(tǒng)測量被測元素所發(fā)射的輻射強度來進行定量分析的方法。 它是一種簡化的發(fā)射光譜分析法,（一）、火焰光度法,FP640火焰光度計,火焰光度法分析示意圖,火焰光度法的特點,應用范圍窄,靈敏,快速,準確,設備簡單,試樣溶液于數(shù)分鐘內(nèi)可完成測定,火焰光源穩(wěn)定性高，干擾少，誤差為25，可用于微量分析和常量分析,分析堿金屬與堿土金屬，絕對靈敏度可達0110106 g,被測試樣易被火焰激發(fā)，產(chǎn)生的譜線較簡單，且均在可見光區(qū)，故使譜線分離和測量的設備簡單,主要用于堿金屬和部分堿土金屬的測定,1、激發(fā)條件,影響火焰光度分析的因素,2、試樣的種類和組成,3

8、、試液中共存離子對測定有影響,4、儀器的質(zhì)量,火焰溫度要適當，溫度過低靈敏度下降，溫度太高則堿金屬電離嚴重，影響測量的線性關系。,（二）、熒光分光光度法,化學物質(zhì)能從外界吸收并儲存能量（如光能、化學能等）而進入激發(fā)態(tài)，當其從激發(fā)態(tài)再回復到基態(tài)時，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。,利用物質(zhì)吸收較短波長的光能后發(fā)射較長波長特征光譜的性質(zhì)，對物質(zhì)定性或定量分析的方法。,熒光的定義：,某些物質(zhì)受紫外光或可見光照射激發(fā)后能發(fā)射出比激發(fā)光波長較長的光。,熒光產(chǎn)生的原理：,熒光分光光度法,分析測定蛋白質(zhì)、核酸、維生素等; 對某些激素及其代謝產(chǎn)物的測定;,當化合物含量太少,一般分析方法靈敏度不夠時

9、,使用熒光分析技術就能解決測定問題。,三、散射光譜分析法,透射比濁與散射比濁是免疫比濁的常見的兩種方法，其反應的原理一樣，只是檢測的光信號與儀器的檢測器有區(qū)別。 1、透射比濁操作簡便，適用于普通的自動生化分析儀和普通的分光光度計，幾乎所有的實驗室均能開展。不足的是靈敏度和精密度均不夠理想，所需的抗血清量大，檢測的周期較長。 2、散射比濁的優(yōu)點是靈敏度、精密度均較高，檢測快速。其缺點是需特定的分析儀器，試劑價格高。,光的散射,用單色光照射透明溶液時，大部分按原來方向透射，而一小部分則按不同的角度散射開來。,散射光譜分析法,利用懸浮顆?；鞚嵋旱纳⑸涔鈴姸然?qū)θ肷涔鉁p弱的原理進行定量分析的方法。,第

10、二節(jié) 電化學分析技術,一、電位分析法 ISE,利用電極電位與濃度的關系測定物質(zhì)含量的電化學分析方法。,電位分析法,一類用特殊敏感膜制成，對溶液中某種特定離子有選擇性響應的電化學傳感器,離子選擇電極 ISE,電解質(zhì)溶液中參與電化學反應的離子的有效濃度,離子選擇性電極的類型和品種很多，外形也差異很大；但基本結構都包括：對特定離子有選擇性響應的薄膜(敏感膜或傳感膜)、內(nèi)參比溶液與內(nèi)參比電極。 敏感膜將內(nèi)側參比溶液與外側的待測離子溶液分開，是電極的關鍵部位。,ISE基本結構,電極電位,電極電位測量,在電位分析中，構成電池的兩個電極，其中一個，其電位值隨待測離子濃(活)度的變化而變化，能指示待測離子的濃

11、(活)度，稱為指示電極，或離子選擇性電極。,指示電極,而另一個電極，其電位不受試液組成變化的影響，具有較恒定的數(shù)值，只是作為測量電位的標準，稱為參比電極(參考電極)。,參比電極,離子選擇性電極：電位法測定溶液中某種定離子活度的指示電極；能在多種離子存在的混合液中，選擇性地響應該特定離子，指示出這種離子活度變化情況，測定離子的活度或濃度。, 選擇性好 在多數(shù)情況下，共存的離子干擾小，對組成復雜的試樣往往不需要分離處理就可直接測定。 靈敏度高 電位法的檢出限為10-510-8 mol/L，適于微量組分的測定，電位滴定法適于常量分析。 快速 儀器設備簡單、操作方便、分析快速、測定范圍寬、不破壞試液，

12、易于實現(xiàn)分析自動化。 缺點 需要有專用的離子選擇性電極。,電位分析法的特點：,3、離子選擇性電極的分類和主要類型 根據(jù)國際純粹及應用化學聯(lián)合會（IUPAC）的建議，離子選擇性電極一般采用如下分類：,根據(jù)國際純粹及應用化學聯(lián)合會(IUPAC)的建議，離子選擇性電極一般采用如下分類：,常用的離子選擇電極,玻璃膜電極,氣敏電極,如，二氧化碳氣敏電極：微孔氣體滲透膜憎水但能透氣(由醋酸纖維、聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯等材料制成)。測定時，CO2氣體通過微孔滲透膜與中介溶液接觸(中介液是0.001mol/L的NaHCO3)；由于CO2與H2O結合生成碳酸，從而影響到碳酸氫鈉的電離平衡。,氣敏電極通過界面發(fā)生

13、化學反應進行工作的，離子電極用來指示中介液中某一離子活度的變化。溶解在水溶液中的氣體，只要能生成可用離子選擇性電極檢出的離子，均可用氣敏電極測定。,用pH玻璃電極間接測定CO2的含量,氣敏電極是一種氣體傳感器，測定溶液中的氣體含量。,原理：利用待測氣體對某一化學平衡的影響，使平衡中某特定離子的活度發(fā)生變化，來測定試液中被測氣體的分壓(含量)。,在氣敏電極的中介溶液中放入玻璃電極。測量時，控制試液的酸堿度，使CO2通過氣透膜擴散加入氣敏電極；引起中介溶液pH的改變。測定中介溶液的pH值，即可計算出試液中CO2的濃度。,CO2 + H2O = HCO3- + H+ NH3 + H2O = NH4+

14、 + OH- SO2 + H2O = HSO3- + H+ 2NO2 + H2O = NO3- + NO2- + H+ H2S + H2O = HS- + H3O+ HCN + H2O = H3O+ + CN- HF + H2O = H3O+ + F-,凡是溶于水釋放H+的反應，都可以用pH玻璃電極檢出；而后三種分別可以用S2-、CN-、F-等離子選擇性電極來檢測。,可用電極測定的氣體,酶的催化反應專一強；酶電極有極高的選擇性。作為一種生物傳感器，酶電極特別適用于生物醫(yī)學、生物化學等領域。,酶電極,選擇適合的指示電極 制成具有催化活性的水不溶性酶膜 把酶膜固定在電極的表面(酶的固定化),酶電極

15、的制作過程,將生物酶涂布在離子選擇性電極或其它傳感器的敏感膜上，通過酶催化作用，使待測物質(zhì)產(chǎn)生能在該電極上響應的離子或化合物，間接測定該物質(zhì)。,脲酶催化分解尿素產(chǎn)生NH3、CO2，溶于水可得到不同產(chǎn)物NH3、CO2、NH4+、HCO3-等，可用相應的離子選擇性電極來檢測它們，間接得到尿素的含量。,常用的固定化技術有：吸附、試劑交聯(lián)、共價鍵合、 包埋法(酶與載體聚丙酰胺混合后直接包在電極敏感部分形成酶凝膠層)。,幾種酶電極的品種與性能,標準曲線法 標準比較法 標準加入法,離子選擇性電極的分析方法,1、直接法：,2、間接法：,樣品不經(jīng)稀釋，直接由電極測量離子活度。,樣品經(jīng)緩沖溶液稀釋后由電極測量離

16、子活度。,用測定離子的純物質(zhì)配制一系列已知活度或濃度的標準溶液，用離子計測定，繪制電極電位與活度對數(shù)的關系曲線；然后在相同條件下測定樣品，由標準曲線查得濃度。,將已知的小體積標準溶液，加入已知較大體積的待測液中，根據(jù)加入前后電位值變化，求得待測液中被測離子得濃度。,二、電導分析法,電導分析法,在外電場作用下，以電解質(zhì)溶液中正負離子遷移為基礎的電化學分析法。,什麼是電導？ 衡量電解液導電能力的量度值 這里所說的電導是指電解質(zhì)溶液中正、負離子在外電場作用下的遷移而產(chǎn)生的電流傳導 導電能力與溶液中正負離子的數(shù)目、離子所帶的電荷量、離子在溶液中遷移的速率等因素有關,利用電解質(zhì)溶液的電導值來確定物質(zhì)含量

17、的分析方法,利用溶液的電導與溶液中離子數(shù)目的相關性建立分析方法,第三節(jié) 干化學分析技術,將液體檢測樣品直接加到含有試劑的固相載體上發(fā)生反應，依照反應結果定量測定樣品中特定成分的濃度或活動的一項技術。,干化學分析技術是以酶法為基礎的一類分析方法，又有干試劑化學或固相化學之稱。,干化學分析,一、干化學分析技術的基本原理,根據(jù)多層膜測定方法不同，可將多層膜分為3種類型：,反射光度法,差示電位法,熒光反射光度法,熒光技術 競爭免疫技術,反射光度法,漫反射光是指從光源發(fā)出的光進入樣品內(nèi)部，經(jīng) 過多次反射、折射、散射及吸收后返回樣品表面的光,朗伯定律描述入射光和吸收光之間的關系,KubelkaMunk 理

18、論描述一束單色光入射到一種既能吸收光，又能反射光的物體上的光學關系。,差示電位法,二、干化學分析技術在臨床檢驗中的應用,反射光度法系統(tǒng),膠片涂層技術,袋式分析儀,儀器檢測:,三、干化學分析技術的影響因素,反射光度計 標準灰色試劑條 離子選擇電極干式化學分析儀 標準條,校準頻度:,質(zhì)控物:,干片試劑的儲存與使用:,溫度和濕度:,第三節(jié) 電泳分析技術,帶電荷的溶質(zhì)或粒子在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動的現(xiàn)象,電泳：,電泳技術:利用電泳現(xiàn)象將多組分樣品分離、分析的技術,電泳儀:可以實現(xiàn)電泳分離技術的儀器,一、電泳分析技術的基本原理,溶液中粒子的帶電狀態(tài),兩性電離及兩性電解質(zhì):,等電點時蛋白

19、質(zhì)分子在電場中不會移動。 溶液的pH值離等電點越遠，顆粒所帶的電荷越多，電泳速度也越快。,等電點pI :,某一溶液中粒子所帶的正、負電荷相等，即凈電荷為零時溶液的pH值。,電泳遷移率,影響電泳的因素,1、分子的形狀和性質(zhì),2、電場強度,電場強度大，速度快，產(chǎn)熱多，變性； 電場強度小，速度慢，產(chǎn)熱少，區(qū)帶模糊,47,3、電泳緩沖溶液,維持電泳介質(zhì)pH恒定,并起導電作用,溶液的酸堿度決定被分離物質(zhì)的解離程度和帶電性質(zhì)及所帶凈電荷量。pH與pI差值越大，粒子帶電量越多。,緩沖溶液不能過酸過堿，以免使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，pH一般4.5-9.0為宜。,緩沖溶液的離子強度影響緩沖容量、電泳速度和產(chǎn)熱效應,兼顧

20、上述效應將緩沖溶液離子強度設置在一個合適的范圍，一般設在0.050.1mol/L為宜,4、支持介質(zhì),紙的吸附作用最大，醋酸纖維素膜的吸附作用較小。,吸附作用和電滲作用,5、蒸發(fā),二、常用電泳技術及應用,按電泳方式分類,1. 移動界面電泳,2. 區(qū)帶電泳,3. 穩(wěn)態(tài)電泳,帶電分子的移動速率通過觀察界面的移動來測定,帶電荷的分子在具有滲透能力的介質(zhì)上的遷移,分子顆粒的電泳遷移在一定時間后達到穩(wěn)態(tài),按電泳支持物分類,(五) 等電聚焦電泳 (IEF),第五節(jié) 基因擴增技術,在體外將微量的目的基因片段大量擴增，以得到足量的DNA供研究分析和檢測鑒定用的技術,聚 合 酶 鏈 反 應Polymerase C

21、hain Reaction（PCR）,一、PCR反應基本原理,含Mg2+的緩沖液,dNTPs,耐熱DNA聚合酶 Tag DNA聚合酶,特異性引物 一對分別與待擴增DNA序列兩端互補的寡核苷酸片段。,模板DNA,PCR反應體系,PCR基本反應步驟,變性 95C,延伸 72C,退火 Tm-5C,循環(huán) 2530 次,使模板DNA完全變性成單鏈。同時引物自身和引物之間存在的局部雙鏈得以消除,使引物和模板DNA退火結合,此溫度下DNA聚合酶以dNTP 為底物催化DNA鏈的延長,三個步驟為一個循環(huán)， 每次循環(huán)產(chǎn)物作為下一輪模板進入下一輪循環(huán),第一輪循環(huán),引物A,引物B,變性（95）,退火（60）,延伸（72）,DN