生物化學(xué)檢驗(yàn)常用技術(shù)課件

1、第三章 生物化學(xué)檢驗(yàn)常用技術(shù),光譜分析技 電化學(xué)分析技術(shù) 干化學(xué)分析技術(shù) 電泳分析技術(shù) 基因擴(kuò)增技術(shù),第一節(jié) 光譜分析技術(shù),吸收光譜分析技術(shù) 發(fā)射光譜分析技術(shù) 散射光譜分析技術(shù),一、吸收光譜分析法,4,光源,單色器,吸收池,檢測(cè)器,顯示器,鎢燈、鹵鎢燈 3501000 氫燈、氘燈 180360,濾光片 棱鏡 光柵,玻璃比色皿 石英比色皿,5,(一)、分光光度技術(shù)的基本原理,1、吸光度與透光度,A = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I,當(dāng)光線通過(guò)均勻、透明的溶液時(shí)可出現(xiàn)三種情況：一部分光被散射，一部分光被吸收，另有一部分光透過(guò)溶液。設(shè)入射光強(qiáng)度為I0，透射光強(qiáng)度為I，I和I0之比稱

2、為透光度，即：,T = I/I0,T100%為T%稱為百分透光度。透光度的負(fù)對(duì)數(shù)稱為吸光度即：,6,2、Lambert-Beer定律,Lambert-Beer定律是討論溶液吸光度同溶液濃度和溶液層 厚度之間關(guān)系的基本定律，該定律是分光分析的理論基礎(chǔ)。,A = KLC,A 為吸光度； K 為比例常數(shù)，稱為吸光系數(shù)； L 為溶液層厚度，稱為光徑； C 為溶液濃度,Lambert-Beer定律適用于可見(jiàn)光、紫外光、紅外光和均勻非散射的液體,當(dāng)一束平行單色光通過(guò)均勻的非散射樣品時(shí)，吸光度與溶液層厚度和溶液濃度成正比。,L,Lambert-Beer定律適用于: 可見(jiàn)光、紫外光、紅外光和均勻非散射的液體以

3、及分散均勻的固態(tài)或氣態(tài)樣品.,單色光 均勻介質(zhì) 吸收物質(zhì)無(wú)相互作用,3、Lambert-Beer定律的應(yīng)用條件,4、Lambert-Beer定律的偏離現(xiàn)象,溶液：稀溶液、化學(xué)變化 光學(xué); 非單色光、散射和折射 儀器; 光源、實(shí)驗(yàn)條件,在分光光度法中，為消除顯色劑及樣品中各種共存有色物質(zhì)產(chǎn)生的干擾、抵消比色皿和試劑對(duì)入射光的影響而用來(lái)調(diào)節(jié)儀器百分透光率為100%的溶液。,5、空白溶液的選擇,蒸餾水,試劑,樣品,不含待測(cè)元素,不顯色,1、溶劑空白：不加樣品和任何試劑，用純?nèi)軇ㄈ缯麴s水或其他有機(jī)溶劑）作參比溶液。 選擇原則：當(dāng)顯色劑及其它試劑均無(wú)色，被測(cè)試樣中又無(wú)其他有色離子時(shí)，選用溶劑參比。,2

4、、試劑空白：用不加樣品，而顯色劑和其他試劑都相同的溶液作參比溶液。 選擇原則：當(dāng)顯色劑本身有顏色或其它試劑有顏色，被測(cè)試樣中又無(wú)其他有色離子時(shí)，選用試劑參比。,3、樣品空白：用不加顯色劑的樣品溶液作參比溶液。 選擇原則：當(dāng)試樣溶液有顏色，而試劑、顯色劑均無(wú)顏色時(shí)，選用樣品空白。,4、平行操作空白：按樣品分析完全相同的操作步驟，用不含待測(cè)元素的樣品進(jìn)行平行操作， 以消除操作過(guò)程中引入干擾雜質(zhì)所帶來(lái)的誤差。 選擇原則：當(dāng)操作過(guò)程中由于試劑、器皿、水和氣等因素引入了一定量的被測(cè)試樣組分的干擾離子,5、不顯色空白：可將一份試樣加入適當(dāng)?shù)难诒蝿?，將被測(cè)組分掩蔽起來(lái)，使之不再與顯色劑作用，而顯色劑 和其它

5、試劑均按照操作手續(xù)加入，以此作為參比溶液，這樣可以消除顯色劑和一些共存組分的干擾。 選擇原則：當(dāng)顯色劑和被測(cè)試樣均有顏色時(shí)，可選用此法。,(二)、分光光度法在生化檢驗(yàn)中的應(yīng)用,靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、應(yīng)用廣泛,1、對(duì)未知化合物進(jìn)行定性分析,2、對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定,定性依據(jù)：,最大吸收波長(zhǎng)max和摩爾吸光系數(shù),標(biāo)準(zhǔn)曲線法和比較法,11,(1).標(biāo)準(zhǔn)曲線法,根據(jù)Lambert-Beer定律，液體的濃度在一定范圍內(nèi)與吸光度成正比關(guān)系。配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液（濃度應(yīng)包含高、中、低濃度范圍），按標(biāo)本處理方法作相同處理，在特定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫座標(biāo)，以吸光度為縱座標(biāo)，將對(duì)應(yīng)各點(diǎn)連成一條

6、通過(guò)原點(diǎn)的直線，這條直線稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測(cè)溶液測(cè)定吸光度后，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出其相應(yīng)的濃度。,方法：,5.標(biāo)準(zhǔn)溶液設(shè)置的濃度范圍足夠大。,13,2比較法,CR=(AR Cs)/As,己知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本作同樣處理，使用相同的空白，同時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)本的吸光度，根據(jù)測(cè)定的吸光度及標(biāo)準(zhǔn)品濃度，可直接計(jì)算出標(biāo)本的濃度，計(jì)算公式為：,二、發(fā)射光譜分析法,處于激發(fā)態(tài)的待測(cè)元素，原子回到基態(tài)時(shí)以輻射的形式釋放出能量，由此而產(chǎn)生的光譜稱為發(fā)射光譜，對(duì)元素進(jìn)行定性與定量分析的方法。,發(fā)射光譜是指樣品本身產(chǎn)生的光譜被檢測(cè)器接收；吸收光譜是光源發(fā)射的光譜被樣品吸收了一部分，剩下的那部分光譜被檢測(cè)器接收。,火焰光

7、度法,熒光光度法,火焰光度法是以火焰為激發(fā)光源，用光電檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量被測(cè)元素所發(fā)射的輻射強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行定量分析的方法。 它是一種簡(jiǎn)化的發(fā)射光譜分析法,（一）、火焰光度法,FP640火焰光度計(jì),火焰光度法分析示意圖,火焰光度法的特點(diǎn),應(yīng)用范圍窄,靈敏,快速,準(zhǔn)確,設(shè)備簡(jiǎn)單,試樣溶液于數(shù)分鐘內(nèi)可完成測(cè)定,火焰光源穩(wěn)定性高，干擾少，誤差為25，可用于微量分析和常量分析,分析堿金屬與堿土金屬，絕對(duì)靈敏度可達(dá)0110106 g,被測(cè)試樣易被火焰激發(fā)，產(chǎn)生的譜線較簡(jiǎn)單，且均在可見(jiàn)光區(qū)，故使譜線分離和測(cè)量的設(shè)備簡(jiǎn)單,主要用于堿金屬和部分堿土金屬的測(cè)定,1、激發(fā)條件,影響火焰光度分析的因素,2、試樣的種類和組成,3

8、、試液中共存離子對(duì)測(cè)定有影響,4、儀器的質(zhì)量,火焰溫度要適當(dāng)，溫度過(guò)低靈敏度下降，溫度太高則堿金屬電離嚴(yán)重，影響測(cè)量的線性關(guān)系。,（二）、熒光分光光度法,化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲(chǔ)存能量（如光能、化學(xué)能等）而進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時(shí)，過(guò)剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。,利用物質(zhì)吸收較短波長(zhǎng)的光能后發(fā)射較長(zhǎng)波長(zhǎng)特征光譜的性質(zhì)，對(duì)物質(zhì)定性或定量分析的方法。,熒光的定義：,某些物質(zhì)受紫外光或可見(jiàn)光照射激發(fā)后能發(fā)射出比激發(fā)光波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光。,熒光產(chǎn)生的原理：,熒光分光光度法,分析測(cè)定蛋白質(zhì)、核酸、維生素等; 對(duì)某些激素及其代謝產(chǎn)物的測(cè)定;,當(dāng)化合物含量太少,一般分析方法靈敏度不夠時(shí)

9、,使用熒光分析技術(shù)就能解決測(cè)定問(wèn)題。,三、散射光譜分析法,透射比濁與散射比濁是免疫比濁的常見(jiàn)的兩種方法，其反應(yīng)的原理一樣，只是檢測(cè)的光信號(hào)與儀器的檢測(cè)器有區(qū)別。 1、透射比濁操作簡(jiǎn)便，適用于普通的自動(dòng)生化分析儀和普通的分光光度計(jì)，幾乎所有的實(shí)驗(yàn)室均能開(kāi)展。不足的是靈敏度和精密度均不夠理想，所需的抗血清量大，檢測(cè)的周期較長(zhǎng)。 2、散射比濁的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度、精密度均較高，檢測(cè)快速。其缺點(diǎn)是需特定的分析儀器，試劑價(jià)格高。,光的散射,用單色光照射透明溶液時(shí)，大部分按原來(lái)方向透射，而一小部分則按不同的角度散射開(kāi)來(lái)。,散射光譜分析法,利用懸浮顆?；鞚嵋旱纳⑸涔鈴?qiáng)度或?qū)θ肷涔鉁p弱的原理進(jìn)行定量分析的方法。,第

10、二節(jié) 電化學(xué)分析技術(shù),一、電位分析法 ISE,利用電極電位與濃度的關(guān)系測(cè)定物質(zhì)含量的電化學(xué)分析方法。,電位分析法,一類用特殊敏感膜制成，對(duì)溶液中某種特定離子有選擇性響應(yīng)的電化學(xué)傳感器,離子選擇電極 ISE,電解質(zhì)溶液中參與電化學(xué)反應(yīng)的離子的有效濃度,離子選擇性電極的類型和品種很多，外形也差異很大；但基本結(jié)構(gòu)都包括：對(duì)特定離子有選擇性響應(yīng)的薄膜(敏感膜或傳感膜)、內(nèi)參比溶液與內(nèi)參比電極。 敏感膜將內(nèi)側(cè)參比溶液與外側(cè)的待測(cè)離子溶液分開(kāi)，是電極的關(guān)鍵部位。,ISE基本結(jié)構(gòu),電極電位,電極電位測(cè)量,在電位分析中，構(gòu)成電池的兩個(gè)電極，其中一個(gè)，其電位值隨待測(cè)離子濃(活)度的變化而變化，能指示待測(cè)離子的濃

11、(活)度，稱為指示電極，或離子選擇性電極。,指示電極,而另一個(gè)電極，其電位不受試液組成變化的影響，具有較恒定的數(shù)值，只是作為測(cè)量電位的標(biāo)準(zhǔn)，稱為參比電極(參考電極)。,參比電極,離子選擇性電極：電位法測(cè)定溶液中某種定離子活度的指示電極；能在多種離子存在的混合液中，選擇性地響應(yīng)該特定離子，指示出這種離子活度變化情況，測(cè)定離子的活度或濃度。, 選擇性好 在多數(shù)情況下，共存的離子干擾小，對(duì)組成復(fù)雜的試樣往往不需要分離處理就可直接測(cè)定。 靈敏度高 電位法的檢出限為10-510-8 mol/L，適于微量組分的測(cè)定，電位滴定法適于常量分析。 快速 儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、分析快速、測(cè)定范圍寬、不破壞試液，

12、易于實(shí)現(xiàn)分析自動(dòng)化。 缺點(diǎn) 需要有專用的離子選擇性電極。,電位分析法的特點(diǎn)：,3、離子選擇性電極的分類和主要類型 根據(jù)國(guó)際純粹及應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC）的建議，離子選擇性電極一般采用如下分類：,根據(jù)國(guó)際純粹及應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)的建議，離子選擇性電極一般采用如下分類：,常用的離子選擇電極,玻璃膜電極,氣敏電極,如，二氧化碳?xì)饷綦姌O：微孔氣體滲透膜憎水但能透氣(由醋酸纖維、聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯等材料制成)。測(cè)定時(shí)，CO2氣體通過(guò)微孔滲透膜與中介溶液接觸(中介液是0.001mol/L的NaHCO3)；由于CO2與H2O結(jié)合生成碳酸，從而影響到碳酸氫鈉的電離平衡。,氣敏電極通過(guò)界面發(fā)生

13、化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行工作的，離子電極用來(lái)指示中介液中某一離子活度的變化。溶解在水溶液中的氣體，只要能生成可用離子選擇性電極檢出的離子，均可用氣敏電極測(cè)定。,用pH玻璃電極間接測(cè)定CO2的含量,氣敏電極是一種氣體傳感器，測(cè)定溶液中的氣體含量。,原理：利用待測(cè)氣體對(duì)某一化學(xué)平衡的影響，使平衡中某特定離子的活度發(fā)生變化，來(lái)測(cè)定試液中被測(cè)氣體的分壓(含量)。,在氣敏電極的中介溶液中放入玻璃電極。測(cè)量時(shí)，控制試液的酸堿度，使CO2通過(guò)氣透膜擴(kuò)散加入氣敏電極；引起中介溶液pH的改變。測(cè)定中介溶液的pH值，即可計(jì)算出試液中CO2的濃度。,CO2 + H2O = HCO3- + H+ NH3 + H2O = NH4+

14、 + OH- SO2 + H2O = HSO3- + H+ 2NO2 + H2O = NO3- + NO2- + H+ H2S + H2O = HS- + H3O+ HCN + H2O = H3O+ + CN- HF + H2O = H3O+ + F-,凡是溶于水釋放H+的反應(yīng)，都可以用pH玻璃電極檢出；而后三種分別可以用S2-、CN-、F-等離子選擇性電極來(lái)檢測(cè)。,可用電極測(cè)定的氣體,酶的催化反應(yīng)專一強(qiáng)；酶電極有極高的選擇性。作為一種生物傳感器，酶電極特別適用于生物醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)等領(lǐng)域。,酶電極,選擇適合的指示電極 制成具有催化活性的水不溶性酶膜 把酶膜固定在電極的表面(酶的固定化),酶電極

15、的制作過(guò)程,將生物酶涂布在離子選擇性電極或其它傳感器的敏感膜上，通過(guò)酶催化作用，使待測(cè)物質(zhì)產(chǎn)生能在該電極上響應(yīng)的離子或化合物，間接測(cè)定該物質(zhì)。,脲酶催化分解尿素產(chǎn)生NH3、CO2，溶于水可得到不同產(chǎn)物NH3、CO2、NH4+、HCO3-等，可用相應(yīng)的離子選擇性電極來(lái)檢測(cè)它們，間接得到尿素的含量。,常用的固定化技術(shù)有：吸附、試劑交聯(lián)、共價(jià)鍵合、 包埋法(酶與載體聚丙酰胺混合后直接包在電極敏感部分形成酶凝膠層)。,幾種酶電極的品種與性能,標(biāo)準(zhǔn)曲線法 標(biāo)準(zhǔn)比較法 標(biāo)準(zhǔn)加入法,離子選擇性電極的分析方法,1、直接法：,2、間接法：,樣品不經(jīng)稀釋，直接由電極測(cè)量離子活度。,樣品經(jīng)緩沖溶液稀釋后由電極測(cè)量離

16、子活度。,用測(cè)定離子的純物質(zhì)配制一系列已知活度或濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用離子計(jì)測(cè)定，繪制電極電位與活度對(duì)數(shù)的關(guān)系曲線；然后在相同條件下測(cè)定樣品，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得濃度。,將已知的小體積標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入已知較大體積的待測(cè)液中，根據(jù)加入前后電位值變化，求得待測(cè)液中被測(cè)離子得濃度。,二、電導(dǎo)分析法,電導(dǎo)分析法,在外電場(chǎng)作用下，以電解質(zhì)溶液中正負(fù)離子遷移為基礎(chǔ)的電化學(xué)分析法。,什麼是電導(dǎo)？ 衡量電解液導(dǎo)電能力的量度值 這里所說(shuō)的電導(dǎo)是指電解質(zhì)溶液中正、負(fù)離子在外電場(chǎng)作用下的遷移而產(chǎn)生的電流傳導(dǎo) 導(dǎo)電能力與溶液中正負(fù)離子的數(shù)目、離子所帶的電荷量、離子在溶液中遷移的速率等因素有關(guān),利用電解質(zhì)溶液的電導(dǎo)值來(lái)確定物質(zhì)含量

17、的分析方法,利用溶液的電導(dǎo)與溶液中離子數(shù)目的相關(guān)性建立分析方法,第三節(jié) 干化學(xué)分析技術(shù),將液體檢測(cè)樣品直接加到含有試劑的固相載體上發(fā)生反應(yīng)，依照反應(yīng)結(jié)果定量測(cè)定樣品中特定成分的濃度或活動(dòng)的一項(xiàng)技術(shù)。,干化學(xué)分析技術(shù)是以酶法為基礎(chǔ)的一類分析方法，又有干試劑化學(xué)或固相化學(xué)之稱。,干化學(xué)分析,一、干化學(xué)分析技術(shù)的基本原理,根據(jù)多層膜測(cè)定方法不同，可將多層膜分為3種類型：,反射光度法,差示電位法,熒光反射光度法,熒光技術(shù) 競(jìng)爭(zhēng)免疫技術(shù),反射光度法,漫反射光是指從光源發(fā)出的光進(jìn)入樣品內(nèi)部，經(jīng) 過(guò)多次反射、折射、散射及吸收后返回樣品表面的光,朗伯定律描述入射光和吸收光之間的關(guān)系,KubelkaMunk 理

18、論描述一束單色光入射到一種既能吸收光，又能反射光的物體上的光學(xué)關(guān)系。,差示電位法,二、干化學(xué)分析技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用,反射光度法系統(tǒng),膠片涂層技術(shù),袋式分析儀,儀器檢測(cè):,三、干化學(xué)分析技術(shù)的影響因素,反射光度計(jì) 標(biāo)準(zhǔn)灰色試劑條 離子選擇電極干式化學(xué)分析儀 標(biāo)準(zhǔn)條,校準(zhǔn)頻度:,質(zhì)控物:,干片試劑的儲(chǔ)存與使用:,溫度和濕度:,第三節(jié) 電泳分析技術(shù),帶電荷的溶質(zhì)或粒子在電場(chǎng)中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象,電泳：,電泳技術(shù):利用電泳現(xiàn)象將多組分樣品分離、分析的技術(shù),電泳儀:可以實(shí)現(xiàn)電泳分離技術(shù)的儀器,一、電泳分析技術(shù)的基本原理,溶液中粒子的帶電狀態(tài),兩性電離及兩性電解質(zhì):,等電點(diǎn)時(shí)蛋白

19、質(zhì)分子在電場(chǎng)中不會(huì)移動(dòng)。 溶液的pH值離等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，顆粒所帶的電荷越多，電泳速度也越快。,等電點(diǎn)pI :,某一溶液中粒子所帶的正、負(fù)電荷相等，即凈電荷為零時(shí)溶液的pH值。,電泳遷移率,影響電泳的因素,1、分子的形狀和性質(zhì),2、電場(chǎng)強(qiáng)度,電場(chǎng)強(qiáng)度大，速度快，產(chǎn)熱多，變性； 電場(chǎng)強(qiáng)度小，速度慢，產(chǎn)熱少，區(qū)帶模糊,47,3、電泳緩沖溶液,維持電泳介質(zhì)pH恒定,并起導(dǎo)電作用,溶液的酸堿度決定被分離物質(zhì)的解離程度和帶電性質(zhì)及所帶凈電荷量。pH與pI差值越大，粒子帶電量越多。,緩沖溶液不能過(guò)酸過(guò)堿，以免使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，pH一般4.5-9.0為宜。,緩沖溶液的離子強(qiáng)度影響緩沖容量、電泳速度和產(chǎn)熱效應(yīng),兼顧

20、上述效應(yīng)將緩沖溶液離子強(qiáng)度設(shè)置在一個(gè)合適的范圍，一般設(shè)在0.050.1mol/L為宜,4、支持介質(zhì),紙的吸附作用最大，醋酸纖維素膜的吸附作用較小。,吸附作用和電滲作用,5、蒸發(fā),二、常用電泳技術(shù)及應(yīng)用,按電泳方式分類,1. 移動(dòng)界面電泳,2. 區(qū)帶電泳,3. 穩(wěn)態(tài)電泳,帶電分子的移動(dòng)速率通過(guò)觀察界面的移動(dòng)來(lái)測(cè)定,帶電荷的分子在具有滲透能力的介質(zhì)上的遷移,分子顆粒的電泳遷移在一定時(shí)間后達(dá)到穩(wěn)態(tài),按電泳支持物分類,(五) 等電聚焦電泳 (IEF),第五節(jié) 基因擴(kuò)增技術(shù),在體外將微量的目的基因片段大量擴(kuò)增，以得到足量的DNA供研究分析和檢測(cè)鑒定用的技術(shù),聚 合 酶 鏈 反 應(yīng)Polymerase C

21、hain Reaction（PCR）,一、PCR反應(yīng)基本原理,含Mg2+的緩沖液,dNTPs,耐熱DNA聚合酶 Tag DNA聚合酶,特異性引物 一對(duì)分別與待擴(kuò)增DNA序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸片段。,模板DNA,PCR反應(yīng)體系,PCR基本反應(yīng)步驟,變性 95C,延伸 72C,退火 Tm-5C,循環(huán) 2530 次,使模板DNA完全變性成單鏈。同時(shí)引物自身和引物之間存在的局部雙鏈得以消除,使引物和模板DNA退火結(jié)合,此溫度下DNA聚合酶以dNTP 為底物催化DNA鏈的延長(zhǎng),三個(gè)步驟為一個(gè)循環(huán)， 每次循環(huán)產(chǎn)物作為下一輪模板進(jìn)入下一輪循環(huán),第一輪循環(huán),引物A,引物B,變性（95）,退火（60）,延伸（72）,DN