乙肝血清標志物檢測ppt課件.ppt

1、乙肝血清學標志物檢測及意義,山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院檢驗科 郭先鋒,1,要點,簡介 抗原組成 傳染源 傳播途徑 病原學診斷 血清學模式及臨床意義,End,2,前 言,病毒性肝炎在我國各類傳染病中發(fā)病率最高 乙型病毒性肝炎在我國危害極大 我國乙型肝炎患者近3千萬 病毒性肝炎，一般特指由嗜肝病毒感染所引起的肝炎。 HBV-屬嗜肝DNA病毒,3,A,病毒性肝炎 Hepatitis Virus,腸道傳播,腸道外傳播,F, TTV ? 其它,E,NANB,B,D,C,病毒性肝炎- 背景,4,傳染源,糞便,血液/,血源性物質(zhì)/,體液,血液/,血源性物質(zhì)/,體液,血液/,血源性物質(zhì)/,體液,糞便,傳播途徑,糞-

2、口,經(jīng)皮膚/ 經(jīng)粘膜,經(jīng)皮膚/ 經(jīng)粘膜,經(jīng)皮膚/ 經(jīng)粘膜,糞-口,慢性感染,否,是,是,是,否,病毒性肝炎類型,A,B,C,D,E,基因組類型 ssRNA dsDNA ssRNA ssRNA ssRNA,5,Hepatitis B Virus,乙型肝炎的病原體 乙型病毒性肝炎1是由乙肝病毒（HBV）引起的、以肝臟炎性病變?yōu)橹鞑⒖梢鸲嗥鞴贀p害的一種傳染病。本病廣泛流行于世界各國，主要侵犯兒童及青壯年，少數(shù)患者可轉(zhuǎn)化為肝硬化或肝癌。因此，它已成為嚴重威脅人類健康的世界性疾病，也是我國當前流行最為廣泛、危害性最嚴重的一種傳染病。,6,乙型病毒性肝炎無一定的流行期，一年四季均可發(fā) 病，但多屬散發(fā)。近

3、年來乙肝發(fā)病率呈明顯增高趨勢估計全球半數(shù)以上人口已被HBV感染過，5%的人口為HBV慢性感染. 中國：乙肝高發(fā)區(qū)，人群HBsAg的檢出率達9.8%,7,電鏡下Hepatitis B Virus,8,乙型肝炎病毒HBV,乙型肝炎病毒（HBV）為專一的嗜肝病毒，近年由于核酸分子雜交技術(shù)的進展，在肝外器官細胞也能檢出HBV-DNA。通過北京乙肝肝病毒試驗研究提供了在肝外細胞復制的證據(jù)。人HBV也可能在肝外細胞內(nèi)復制，有待深入研究。HBV感染者血清經(jīng)電鏡檢查有3種病毒顆粒. 1.大球形顆粒，完整的HBV顆粒直徑為42nm，又名Dane顆粒，分為包膜與核心的兩部分，外衣殼及包膜含有表面抗原，衣殼內(nèi)為核心

4、結(jié)構(gòu)，有核心抗原，核心抗原下面藏有e抗原。,9,乙型肝炎病毒HBV,.小球形顆粒，陽性血清中最多的顆粒，主要為表面抗原，不含核酸及成分，為不完整的 .管形顆粒，實際上是一串小球形顆粒聚合在一起的，也含有表面抗原,10,1. HBV形態(tài)結(jié)構(gòu),大球形顆粒（Dane顆粒）,小球形顆粒,管形顆粒,11,HBV virion,The infectious virion is called the DANE particle.,12,Dane顆粒（完整的病毒）形態(tài),HBsAg,HBcAg,HBV DNA,DNAP,（外膜蛋白）,（核衣殼蛋白）,13,Both comprised of HBsAg,14,H

5、BV nomenclature,HBV: hepatitis B virus HBsAg: hepatitis B virus surface antigen HBsAb: hepatitis B virus surface antibody HBcAg: hepatitis B virus core antigen HBcAb: hepatitis B virus core antibody HBeAg: hepatitis B virus e antigen HBeAb: hepatitis B virus e antibody,15,抗原組成(一)-HBsAg,位于病毒表面，是一種糖蛋白

6、(曾用名：澳抗) 出現(xiàn)時間：HBV感染后26個月（潛伏期） HBsAg有10個亞型，各亞型間存在不完全的交叉免疫。近年用亞型單克隆抗體研究表明，d和y、w和r決定簇可以同時存在于同一病毒抗原顆粒上，形成adwr、aywr、adyw和adyr復合亞型。,16,其機制為不同亞型病毒的雙重感染；單一亞型病毒感染后，有的HBV-DNA發(fā)生點突變。臨床表現(xiàn)病情反復，肝臟損害較重，因而有的HBV感染者血清中同時HBsAg陽性、抗-HBs陽性。4種亞型(adr,adw,ayr,ayw)。刺激機體產(chǎn)生保護性抗體即抗-HBs.,17,HBsAg 血清中HBsAg陽性是HBV感染的標志。本身具有抗原性，無傳染性。

7、但由于HBsAg常與HBV同時存在，故認為是傳染性標志之一。但須注意，HBV-DNA可自X基因區(qū)終點起逆向與肝細胞發(fā)生整合，整合后的S基因表達較強，不斷產(chǎn)生HBsAg，整合的HBcAg基因組被抑制，不表達HBeAg、HBcAg，在這種情況下，即使HBV已從體內(nèi)清除，而HBsAg仍可持續(xù)陽性，從理論上講，這種HBsAg陽性血液并無傳染性。,18,急性HBV感染后，血清中首先出現(xiàn)HBsAg，整個急性期均可陽性，至恢復期可滴度下降或轉(zhuǎn)陰。如HBsAg持續(xù)陽性半年以上，稱為慢性HBsAg攜帶者（無癥狀HBsAg攜帶者），可持續(xù)陽性達數(shù)年。一般認為HBsAg滴度與病變程度不成比例。肝功能正常，HBsAg

8、滴度高，肝臟可重要病變，若HBsAg陰性及DNAp陰性，表示無重要傳染性。反之，肝功能異常，HBsAg滴度不高，肝臟可有明顯病變，如有部分肝硬化、肝癌患者呈HBsAg陰性或低滴度。無癥狀HBsAg攜帶者或慢性活動性乙型肝炎均可有相同的HBsAg滴度變化不能代表病情的輕重，因此分解此不能將HBsAg滴度的變化作為判斷病情輕重和藥物治療效的指標。,19,用免疫電鏡及免疫熒光法在肝細胞漿內(nèi)證實有HBsAg,而血清中HBsAg陰性，其機制尚無確切解釋。已知原因之一是現(xiàn)用的RIA檢測法，其測試靈敏度為10-5,尚不能測出最低感染量(10-7)，因此有10%假陰性，故對HBsAg的判斷，以陽性有診斷意義，

9、陰性不能排除HBV感染。近年發(fā)現(xiàn)血清中HBV標志均陰性，而在白細胞或肝細胞內(nèi)檢出HBV-DNA，說明確定或除外HBV感染不能單憑HBsAg是否陽性，應與其他標志結(jié)合判斷。,20,HBsAg,持續(xù)時間 急性自限性肝炎：血中HbsAg大多可持續(xù)1-6周，最長可達6個月內(nèi)可消失 慢性肝炎或慢性HBsAg攜帶者：可持續(xù)陽性。,21,抗原組成(二)- HBcAg,HBcAg 為HBC復制指標.位于Dane顆粒核心部分和肝細胞核內(nèi)，在血清中不易檢出游離的HBcAg 主要成分是蛋白質(zhì) 刺激機體產(chǎn)生抗-HBc(非保護性抗體) 存在于受感染的肝細胞核內(nèi)，有很強的免疫原性，在乙肝急性期、恢復期和HBsAg攜帶者中

10、?？蓹z出抗-HBc。除非HBV C基因序列出現(xiàn)極少數(shù)變異或感染者有免疫缺陷。 抗-HBc IgM陽性提示急性期或慢性感染急性發(fā)作，抗HBc IgG出現(xiàn)較遲，但可保持多年或者終生。,22,（抗-HBs,出現(xiàn)時間：急性感染后期或HBsAg 轉(zhuǎn)陰后（數(shù)月才能檢測出）.6-12月內(nèi)逐步上升至高峰，可持續(xù)多年，但滴度會逐漸下降。 抗-HBs為保護性抗體（中和抗體）其出現(xiàn)標志著HBV感染進入恢復期 -HBs 對相同HBsAg亞型的HBV再感染有免疫力，但對不同亞型的HBV保護力不完全。,23,抗原組成(三)- HBeAg,位于HBV的核心,是一種可溶性蛋白抗原 HBeAg和Dane顆粒出現(xiàn)相平行，且與DN

11、A多聚酶在血中的消長動態(tài)相符合 血中HBeAg的出現(xiàn)可作為HBV復制及血清有感染性的指標.急性HBV感染時HBeAg的出現(xiàn)時間略晚于HBsAg，在病變極期后消失，如果HbeAg持續(xù)存在預示趨向慢性。大部分情況持續(xù)存在表示患者處于高感染低應答期。 刺激機體產(chǎn)生抗-HBe。轉(zhuǎn)換過程意味著由免疫耐受轉(zhuǎn)換為免疫激活，此時常有病變活動的激化。 抗-HBe能與受染肝細胞表面的e抗原結(jié)合,通過補體介導破壞受染的肝細胞,抗-HBe的出現(xiàn)是預后良好的征象?？笻Be陽轉(zhuǎn)后，病毒復制處于靜止狀態(tài)，傳染性降低。部分病人仍有病毒復制，肝炎活動，稱為HBeAg陰性慢性肝炎。,24,HBV DNA,是病毒復制和有傳染性最直

12、接的證據(jù),檢測方法：斑點雜交法、PCR法近年用多聚酶鏈反應（PCR）這一體外DNA擴增技術(shù)，使靈敏度提高100倍以上（10FGfg/ml），可測出極微量的病毒。HBV-DNA-p是HBV核心所具有的DNA-p，在病毒復制過程中起逆轉(zhuǎn)酶作用。DNA-p活性是表示HBV復缺點活力的重要指標。HBV-DNA及DNA-p檢測有助于判斷HBV感染者病毒復制程度及傳染性大小，較靈敏評價抗病毒藥物的療效。,乙 肝,25,抗原組成(四)- Pre-S抗原,位于HBV的外衣殼上，有兩種 刺激機體產(chǎn)生抗Pre-S1和抗Pre-S2，能阻斷HBV與肝細胞受體結(jié)合，從而起到抵抗病毒的作用 抗Pre-S1和抗Pre-S

13、2的出現(xiàn)，表示病情好轉(zhuǎn)，趨向痊愈,26,傳染源,患者 潛伏期 急性期 慢性期 無癥狀HBsAg攜帶者,27,高,中等,低/不能檢出,血液,精液,尿,血清,陰道分泌物,糞便,傷口滲出物,唾液,汗液,淚液,乳汁,各種體液中HBV的濃度,28,血源性傳播 輸血、注射、外科和牙科手術(shù)、針刺等 剃刀、牙刷和蚊蟲叮咬等 母嬰垂直傳播 宮內(nèi)傳播 分娩時微小皮損處傳播 產(chǎn)后母嬰密切接觸 性傳播,HBV 傳播途徑,29,30,病原學診斷(一)-抗原抗體檢測,項目：HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc以及抗-HBc IgM 方法 ELISA(enzyme-linked immunosorbe

14、nt assay，最常用，定性) 發(fā)光免疫分析(定量) 反相間接血凝試驗(少用),31,ELISA的基本原理,利用抗原和抗體特異性結(jié)合 主要的試劑 固相抗原或抗體 酶標記的抗原或抗體 酶的底物,32,ELISA的主要方法,間接法: 測定抗-HBs 夾心法：測定HBsAg和HBeAg 競爭法：測定抗-HBc 中和法：測定抗-HBe 捕捉法：測定抗-HBc IgM,33,病原學診斷(二)核酸檢測,核酸雜交 探針 PCR 引物,34,各項HBV血清標志物的解釋,HBsAg HBV感染的標志,可能是急性或慢性 Anti-HBs 既往感染自然免疫/接種疫苗產(chǎn)生 Anti-HBc IgM 急性HBV感染標

15、志 Anti-HBc IgG 既往或慢性HBV感染 HBeAg 病毒復制活躍，具有高度傳染性 Anti-HBe 慢性感染,病毒不再復制,低傳染性 HBV-DNA 直接測定病毒復制狀態(tài)，比HBeAg更準確；臨床主要用于監(jiān)測治療反應,35,為什么要開展乙肝“兩對半”定量檢測,乙型病毒性肝炎是世界性的傳染病，嚴重地威脅著人類的健康。我國是乙型病毒性肝炎高發(fā)病國家。據(jù)統(tǒng)計全世界無癥狀攜帶者（HBsAg攜帶者）超過2.8億，我國占1億以上，且多數(shù)無癥狀。所以乙肝的早期診斷對控制傳染源、降低發(fā)病率及疾病的治療均具有很重要的意義。酶標（ELISA）檢測始于20世紀80年代中期，它對乙肝“兩對半”定性測定在疾

16、病的診斷，病情監(jiān)測，療效觀察起到了一定的作用，但酶標檢測HbsAg靈敏度較低，不能真正意義上定量測定血清中HbsAg含量。隨著臨床醫(yī)學的發(fā)展，定性檢測已經(jīng)遠遠不能滿足臨床及患者的要求?；瘜W發(fā)光免疫分析定量測定乙肝“兩對半”大大彌補了酶標定性測定及靈敏度低的不足。,36,血清學檢測的臨床意義,HBsAg 抗-HBs HBeAg 抗-HBe 抗-HBc 臨床意義,急性或慢性感染(大三陽),+,-,+,-,+,+,+,+,乙肝后期或慢性感染(小三陽),-,-,+,+,-,-,-,潛伏期或急性乙肝早期,-,-,+,+,+,痊愈或恢復期,有免疫力,-,-,-,-,-,+,+,+,-,-,痊愈,有免疫力,

17、疫苗接種或曾經(jīng)感染過,有免疫力,37,血清學檢測的臨床意義,HBsAg 抗-HBs HBeAg 抗-HBe 抗-HBc 臨床意義,血清學檢測的臨床意義,血清學檢測的臨床意義,急性或慢性感染(傳染性弱),+,-,-,-,+,-,+,+,急性乙肝恢復期或既往感染,-,-,-,-,-,-,+,急性窗口期或既往感染康復期,-,-,-,-,-,未感染過 HBV,+,+,-,-,+,+,+,-,-,+,急性感染趨向恢復;慢性攜帶者,HBV感染已恢復,有免疫力,38,Symptoms,HBeAg,anti-HBe,Total anti-HBc,IgM anti-HBc,anti-HBs,HBsAg,0,4,

18、8,12,16,20,24,28,32,36,52,100,Acute HBV Infection with Recovery,Typical Serologic Course,Weeks after Exposure,Titre,39,IgM anti-HBc,Total anti-HBc,HBsAg,Acute (6 months),HBeAg,Chronic (Years),anti-HBe,0,4,8,12,16,20,24,28,32,36,52,Years,Weeks after Exposure,Titre,Progression to Chronic HBV Infection

19、,Typical Serologic Course,小結(jié),40,乙肝五項檢測的影響因素,1. 樣本采集與處理的影響1.1標本嚴溶血及混有紅細胞的血清易沉淀或附著在聚乙烯孔內(nèi)不易洗凈，殘留在孔內(nèi)的血紅蛋白具有過氧化物酶樣的活性，催化底物顯色造成假陽性，嚴重溶血標本禁用。1.2塑料試管能吸附抗原物質(zhì)，樣本久置在塑料管內(nèi)會使樣本內(nèi)抗原含量下降造成假陰性。最好使用一次性玻璃試管或真空管采血管；并使用非抗凝標本，肝素抗凝血漿會增加OD值，可能與高濃度肝素具有強大的負電荷能吸附酶標記物不易洗脫有關(guān)；EDTA、酶抑制劑（如NaN3）可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性。1.3標本凝固不全 ，正常血液采集

20、后1/22h開始凝固，1824h血塊完全收縮。在工作中，有時為了爭取時間快速檢測，常在血液還未開始凝固時即強行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結(jié)果；因此血液標本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標本采集時用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當?shù)拇倌齽?41,乙肝五項檢測的影響因素,2、試劑的影響2.1乙肝兩對半試劑廠家較多；不同廠家出產(chǎn)的試劑靈敏度與特異性存在一定的差別，有資料顯示，不同廠家試劑的特異性和敏感性分別為89.4%99.3%,7889%存在較大差異。有的廠家酶標板孔間A值差大于15%；標記酶的活性及顯

21、色液的穩(wěn)定比較差。使用質(zhì)劣的試劑必然導致結(jié)果的假陽性或假陰性。因此。選擇高質(zhì)量的試劑是保證結(jié)果準確的關(guān)鍵之一。2.2不同方法學的檢測試劑，會使兩對半結(jié)果出現(xiàn)一些不同。例如：在實際工作中常用ELISA檢測HBsAg結(jié)果為陰性，而電化學發(fā)光檢測為陽性。除方法學的靈敏度外；還存在使用單抗或多克隆抗體試劑的差別。單抗對變異抗原或亞型乙肝標志物檢測存在差異，建議試劑廠家對劑的制備應該考慮亞型及型濃度的問題。,42,乙肝五項檢測的影響因素,3、干擾物質(zhì)的影響有人認為大約40%的人血清標本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測結(jié)果；常見的干擾物質(zhì)有：類風濕因子、補體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)源

22、性誘導的抗鼠Ig 抗體、交叉反應物質(zhì)和其它物質(zhì)等。如RF因子可與標記二抗的FC段法結(jié)合造成假陽性，補體從C1q活化，使一抗和酶標二抗的抗體分子發(fā)生變構(gòu)，F(xiàn)c的C1q分子結(jié)合點暴露出來，則補體C1q可將二者連接起來造成假陽性，采用5630分鐘滅活補體可降低假陽性率，高濃度的AFP（如孕婦），在儲存過程中可能形成二聚體會導致本底過深影響檢測結(jié)果。,43,乙肝五項檢測的影響因素,4、藥物的影響4.1 高效價的乙肝免疫球蛋白會與HBsAg形成復合物，影響HBsAg的檢出，所以一些HBsAg陽性患者注射乙肝免疫球蛋白后，HBsAg檢測會呈陰性反應，導致乙肝兩對半少見模式的出現(xiàn)，如我們常遇到乙肝大三陽的孕

23、婦，為阻斷乙肝母嬰垂直傳播時，在孕第8、9、10月常規(guī)注射乙肝免疫球蛋白，不僅影響孕婦HBsAg的檢出；而且其所生產(chǎn)的生新兒也常出現(xiàn)HBsAg陰性，HBeAg 陽性和HBcAb陽性等少見模式、可能是乙肝免疫球蛋白屬IgG抗體能通過胎盤進入胎兒體內(nèi)與胎兒血液中的HBsAg結(jié)合形成復合物；則新生兒HBsAg檢測呈陰性；用0.5ML的鹽酸處理標本1小時可提高出率。4.2 為預防乙肝，部分HBsAg陰性人群在接種乙肝疫苗后的12周內(nèi)，血清中可檢出HBsAg成份，形成一過性HBsAg陽性，這可能是乙肝疫苗主要成分是HBsAg.，有方法能夠把它檢出；如電化學發(fā)光法，建議接種乙肝疫苗后1個月內(nèi)不應作HBsAg檢測。,44,乙肝DNA檢測的臨床意義,HBV-DNA稱為乙肝病毒脫氧核糖核酸。乙肝病毒是一種部分雙鏈DNA病毒，也就是說它的遺傳物質(zhì)是DNA，它載有病毒所有遺傳信息，乙肝病毒靠它才可以復制、增殖、繁衍后代。研究證明，乙肝病毒的裸DNA(沒有蛋白質(zhì)包裹DNA)就有感染性，完成對宿主的侵襲，造成宿主體內(nèi)出現(xiàn)完整的乙肝病毒顆粒。也就是說HBV-DNA相當于完整的乙肝病毒顆粒。因此，檢測HBV-DNA是判斷乙肝病毒