色譜-質(zhì)譜聯(lián)用.ppt

1、1,色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)及其應(yīng)用,2,授課內(nèi)容,色譜技術(shù) 質(zhì)譜技術(shù) 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),3,概述,色譜：化合物分離 質(zhì)譜：純物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用：結(jié)合共同優(yōu)點 GC-MS；LC-MS；CE-MS 關(guān)鍵點：接口技術(shù),4,色譜法由俄國植物學(xué)家茨維特分離植物色素時采用。 將植物葉子的萃取物倒入填有碳酸鈣的直立玻璃管內(nèi)，加入石油醚使其自由流下，結(jié)果色素中各組分互相分離形成各種不同顏色的譜帶，因此得名為色譜法。以后此法逐漸應(yīng)用于無色物質(zhì)的分離，“色譜”二字雖已失去原來含義，但仍被人們沿用至今。,一 色譜技術(shù),5,色譜的原理,定義：色譜是一種把混合物中多組分分離的實驗技術(shù)。 即利用物質(zhì)的物理化學(xué)

2、性質(zhì)建立的分離分析方法。 實質(zhì)：分離 目的：定性或定量分析,從20世紀(jì)30年代始,6,固定相和流動相,填入玻璃管或不銹鋼管內(nèi)靜止不動的一相（固體或液體）稱為固定相； 自上而下運動的一相（一般是氣體或液體）稱為流動相； 裝有固定相的管子（玻璃管或不銹鋼管）稱為色譜柱。 當(dāng)流動相中樣品混合物經(jīng)過固定相時，就會與固定相發(fā)生作用，由于各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相相互作用的類型、強(qiáng)弱也有差異，因此在同一推動力的作用下，不同組分在固定相滯留時間長短不同，從而按先后不同的次序從固定相中流出。,7,按分離機(jī)理分類,分配色譜：利用在流動相和固定相中分配系數(shù)的不同分離； 吸附色譜：利用物理吸附性能的差異分

3、離； 離子交換色譜：利用離子交換能力的差別分離； 空間排阻色譜：利用排阻作用力的不同分離,在常用的色譜中，常是幾種分離機(jī)制共同作用的結(jié)果。,注意,8,9,色譜法的流出曲線及有關(guān)術(shù)語,10,色譜峰所能提供的重要信息,1 樣品中所含組分的最少個數(shù) 2 保留值-定性分析 3 色譜峰面積（或峰高）-定量分析 4 色譜峰的保留值和區(qū)域?qū)挾?評價色譜柱的分離效能 5 根據(jù)相鄰色譜峰之間的距離來選擇合適的色譜分離條件,11,二 質(zhì)譜技術(shù),質(zhì)譜分析法是通過對被測樣品離子質(zhì)荷比（m/z）的測定來進(jìn)行分析的一種方法。 被分析的樣品首先要離子化，然后利用不同離子在電場或磁場運動行為的不同，把離子按m/z分開而得到質(zhì)

4、譜，并得到樣品的定性定量結(jié)果。,12,2.1 質(zhì)譜的發(fā)展,40年代,同位素測定和無機(jī)元素分析,50年代,有機(jī)物分析,60年代,氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用,80年代,新的質(zhì)譜技術(shù),接口技術(shù)（基質(zhì)輔助激光解吸電離源，電噴霧電離源，大氣壓化學(xué)電離源）,新質(zhì)譜儀（液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，富立葉變換質(zhì)譜儀等）,目前質(zhì)譜分析法已廣泛地應(yīng)用于化學(xué)、化工、材料、環(huán)境、藥物、刑偵、生命科學(xué)、運動醫(yī)學(xué)等各個領(lǐng)域。,1911年 世界第一臺質(zhì)譜裝置（J.J.Thomson）,70年代,計算機(jī)技術(shù)引入,13,2.2 質(zhì)譜特點,14,質(zhì)譜儀是通過對樣品電離后產(chǎn)生的具有不同的 m/z 的離子來進(jìn)行分離分析的。 質(zhì)譜儀包括進(jìn)樣系統(tǒng)、電

5、離系統(tǒng)、質(zhì)量分析系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。,2.3 質(zhì)譜儀的基本結(jié)構(gòu),15,質(zhì)譜儀的離子產(chǎn)生及經(jīng)過系統(tǒng)必須處于高真空狀態(tài)。若真空度過低，則會造成離子源燈絲損壞、本底增高、圖譜復(fù)雜化、干擾離子源的調(diào)節(jié)、加速極放電等問題。 一般質(zhì)譜儀都采用機(jī)械泵預(yù)抽真空后，再用高效率擴(kuò)散泵連續(xù)地運行以保持真空?，F(xiàn)代質(zhì)譜儀采用分子泵可獲得更高的真空度。,2.3.1 真空系統(tǒng),二級真空系統(tǒng)！,16,真空系統(tǒng)為早期的維護(hù)反饋提供數(shù)字化控制,雙分子渦輪泵可快速抽真空和進(jìn)行穩(wěn)定操作,17,進(jìn)樣系統(tǒng)目的是高效重復(fù)地將樣品引入到離子源中并且不能造成真空度的降低。 進(jìn)樣方式： 1 直接進(jìn)樣 2 儀器聯(lián)用的進(jìn)樣 （GC、LC、CE）,2.3

6、.2 進(jìn)樣系統(tǒng),18,離子源的作用是將欲分析樣品電離，得到帶有樣品信息的離子。,2.3.3 離子源,Note： 質(zhì)譜檢測的是離子； 離子源=接口,19,電子轟擊電離 Electron Impact Ionization, EI 化學(xué)離子化 Chemical Ionization, CI 場電離，場解吸 Field Ionization FI, Field Desorption FD 快原子轟擊 Fast Atom Bombardment, FAB 基質(zhì)輔助激光解析電離 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization, MALDI 電噴霧電離 Electr

7、ospray Ionization, ESI 大氣壓化學(xué)電離 Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI,離子化方法,20,電子轟擊電離 EI,EI源應(yīng)用最為廣泛，它主要用于揮發(fā)性樣品的電離。 原理：由GC或直接進(jìn)樣桿進(jìn)入的樣品，以氣體形式進(jìn)入離子源，由燈絲發(fā)出的電子與樣品分子發(fā)生碰撞使樣品分子電離。 所有的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖都是在70 eV下做出的。有機(jī)物分子可能被打掉一個電子形成分子離子，也可能會發(fā)生化學(xué)鍵的斷裂形成碎片離子。 由分子離子可以確定化合物分子量，由碎片離子可以得到化合物的結(jié)構(gòu)信息。,21,22,有些化合物穩(wěn)定性差，用EI方式不易得到分

8、子離子； 為了得到分子量可以采用CI電離方式。,特點： 最強(qiáng)峰為準(zhǔn)分子離子； 譜圖簡單； 不適用難揮發(fā)試樣；,化學(xué)電離（CI）,23,化學(xué)電離 CI,反應(yīng)氣體可以是甲烷、異丁烷、氨等。 以CH4為例：,CI源工作過程中要引進(jìn)一種反應(yīng)氣體。氣體經(jīng)過電子轟擊，產(chǎn)生離子，再與試樣相互碰撞，產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子。,24,M + CH5+ MH + + CH4,M + C2H5+ MH + + C2H4,M + C2H5+ MH + + C2H6,加合離子與樣品分子反應(yīng)：準(zhǔn)分子離子QM +,生成的M+H +和 M-H +比樣品分子M多一個H或少一個H，稱為準(zhǔn)分子離子?；瘜W(xué)電離源是一種軟電離方式，有 些用EI方

9、式得不到分子離子的樣品，改用CI后可以得到準(zhǔn)分子離子，因而可以求得分子量。,25,場致電離,特點： 強(qiáng)電場將分子中拉出一個電子； 分子離子峰強(qiáng)； 碎片離子峰少； 不適合化合物結(jié)構(gòu)鑒定；,不足：要求樣品分子處于氣態(tài)，靈敏度不高，應(yīng)用逐漸減少。,以場電離Field Ionization（FI）為例,26,快原子轟擊（FAB）,氬氣在電離室依靠放電產(chǎn)生氬離子，高能氬離子經(jīng)電荷交換得到高能氬原子流，氬原子打在樣品上產(chǎn)生樣品離子。電離過程中不必加熱氣化，因此適合于分析大分子量、難氣化、熱穩(wěn)定性差的樣品。例如肽類、低聚糖、天然抗生素等。,FAB源主要用于 磁式雙聚焦質(zhì)譜儀,FAB是目前廣泛使用的軟電離技術(shù)

10、，得到的質(zhì)譜不僅有較強(qiáng)的準(zhǔn)分子離子峰，而且有較豐富的結(jié)構(gòu)信息。,27,MALDI可使熱敏感或不揮發(fā)的化合物由固相直接得到離子。,待測物質(zhì)的溶液與基質(zhì)的溶液混合后蒸發(fā)，使分析物與基質(zhì)成為晶體或半晶體，用一定波長的脈沖式激光進(jìn)行照射時，基質(zhì)分子能有效的吸收激光的能量，使基質(zhì)分子和樣品分子進(jìn)入氣相并得到電離。,MALDI適用于生物大分子，如肽類，核酸類化合物?？傻玫綔?zhǔn)分子離子峰，碎片離子和多電荷離子較少.,基質(zhì)輔助激光解析電離 (MALDI),28,ESI是近年來出現(xiàn)的一種新的電離方式。它主要應(yīng)用于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。流出液在高電場下形成帶電噴霧，在電場力作用下穿過氣簾；從而霧化、蒸發(fā)溶劑、阻止中

11、性溶劑分子進(jìn)入后端檢測。,電噴霧電離（ESI）,29,ESI是一種軟電離方式，即便是分子量大，穩(wěn)定性差的化合物，也不會在電離過程中發(fā)生分解，它適合于分析極性強(qiáng)的有機(jī)化合物。 ESI的最大特點是容易形成多電荷離子。目前采用電噴霧電離，可以測量大分子量的蛋白質(zhì)。,30,大氣壓化學(xué)電離源(APCI),APCI噴嘴的下游放置一個針狀放電電極，通過放電電極的高壓放電，使空氣中某些中性分子電離，產(chǎn)生H3O+，N2+，O2+ 和O+ 等離子，溶劑分子也會被電離，這些離子與分析物分子進(jìn)行離子-分子反應(yīng)，使分析物分子離子化。,31,32,各種離子源的相對適用性,33, 質(zhì)量分析器是質(zhì)譜儀的核心, 質(zhì)量分析器的作

12、用是將離子源產(chǎn)生的離子按m/z順序分開并排列。, 不同類型的質(zhì)量分析器構(gòu)成不同類型的質(zhì)譜儀。, 不同類型的質(zhì)譜儀其功能，應(yīng)用范圍，原理， 實驗方法均有所不同。,2.3.4 質(zhì)量分析器,34,單聚焦磁場分析器,在一定的B、V下，不同m/z 的離子其R不同，由離子源產(chǎn)生的離子，經(jīng)過分析器后可實現(xiàn)質(zhì)量分離。,離子進(jìn)入分析器后，由于磁場的作用，其運動軌道發(fā)生偏轉(zhuǎn)改作圓周運動。其運動軌道半徑R可由下式表示：,上式中， m -離子質(zhì)量 Z -離子電荷量 V -離子加速電壓 B -磁感應(yīng)強(qiáng)度,35,單雙聚焦質(zhì)譜儀體積大； 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀器的發(fā)展及儀器小型化（臺式）需要 體積小的質(zhì)量分析器：,四極桿質(zhì)量分析

13、器 飛行時間質(zhì)量分析器 離子阱質(zhì)量分析器,體積小，操作簡單； 分辨率中等；,36,四極桿質(zhì)量分析器,四極桿質(zhì)譜結(jié)構(gòu)簡單，價廉，體積小，易操作，掃描速度快，適合于GC-MS, LC-MS。,37,飛行時間質(zhì)譜儀（Time of Flight MS, TOF-MS）,TOF-MS的核心部分是一個無場的離子漂移管；,加速后的離子具有相同的動能,m/z小的離子，漂移運動的速度快，最先通過漂移管; m/z大的離子，漂移運動的速度慢，最后通過漂移管。 適合于生物大分子，靈敏度高，掃描速度快，結(jié)構(gòu)簡單，分辨率隨m/z的增大而降低。,38, FT-MS的核心為分析室，分析室由三對平行的極 板構(gòu)成。磁力線沿z軸

14、方向，離子的回旋運動垂直于z軸， 在與x軸方向垂直的兩極板上施加激發(fā)射頻，在與y軸方 向垂直的兩極板上檢測信號。,(Fourier Transform ion cyclotron resonance Mass Spectrometer, FTICR-MS),傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀,39,離子阱質(zhì)量分析器,特定m/z離子在阱內(nèi)一定軌道上穩(wěn)定旋轉(zhuǎn)，改變端電極電壓，不同m/z離子飛出阱到達(dá)檢測器；,40,2.3.5 檢測系統(tǒng),質(zhì)量分析器分離并加以聚焦的離子束， 按m/z的大小依次通過狹縫，到達(dá)收集器, 經(jīng)接收放大后被記錄。,41,質(zhì)譜儀的檢測主要使用電子倍增器，也有的使用光電倍增管。由倍增器出

15、來的電信號被送入計算機(jī)儲存，這些信號經(jīng)計算機(jī)處理后可以得到色譜圖，質(zhì)譜圖及其它各種信息。,42,2.4 質(zhì)譜術(shù)語,基峰： RI 100,質(zhì)荷比： m / z , z = 1, z = 2;,m的計算：組成離子的各元素同位素的質(zhì)子和中子之和。,精確質(zhì)量: 基于天然豐度最大的同位素的精確原子量 如： 1H 1.007825 、 12C 12.000000、 14N 14.003074 、 16O 15.994915 精確度與質(zhì)譜計的分辨率有關(guān)。,43,橫坐標(biāo)為離子的質(zhì)荷比，縱坐標(biāo)為離子相對強(qiáng)度或相對豐度。,質(zhì)譜圖,44,原子,質(zhì)量,相對豐度,質(zhì)量,相對豐度,質(zhì)量,相對豐度,分類,氫,1.0078,

16、100,A,碳,12.0000,100,13.0034,1.1,A+1,氮,14.0031,100,15.0001,0.37,A+1,氧,15.9949,100,17.9992,0.2,A+2,硅,27.9769,100,28.9865,5.1,29.9738,3.4,A+2,磷,30.9738,100,A,硫,31.9720,100,32.9715,0.8,33.9679,4.4,A+2,氯,34.9989,100,36.9659,32.5,A+2,溴,78.9183,100,80.9163,98,A+2,碘,126.9045,100,A,鈉 22.9898 100 A,鉀 38.9637

17、100 0.01 40.9618 7.2 A+2,原子定義,45, 分子離子: M+ , M - e M+ ,z=1時， 其m/z等于天然豐度最大的同位素的原子量之和。, 碎片離子：廣義上指除分子離子以外的所有離子。, 母離子與子離子：任何一個離子進(jìn)一步裂解為質(zhì)荷比較小 的離子，前者是后者的母離子或前體離 子，后者是前者的子離子。,質(zhì)譜中的離子, 準(zhǔn)分子離子： M+H+, M-H -,46, 偶電子離子EE+： 帶雙電荷的離子，如 B+, D+ , E+, 多電荷離子： 如 z=2的離子，存在于穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)中。, 重排離子：經(jīng)過重排，斷裂一個以上化學(xué)鍵所生成的離子。,47,三 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

18、技術(shù),氣相色譜法是一種分離揮發(fā)性有機(jī)混合物很好的方法，但它定性能力較差，特別是遇到分析完全未知的欲定性組分，就更困難了。 GC/MS儀集氣相色譜及質(zhì)譜的所長，分離、定性一氣呵成。 目前從事檢驗、有機(jī)物分析的實驗室?guī)缀醵及袵C/MS作為主要的定性確認(rèn)手段之一。,48,GC-MS聯(lián)用儀器 hyphenated technology of GC-MS,49,儀器結(jié)構(gòu),色譜-四極桿質(zhì)譜儀結(jié)構(gòu)示意圖,50,GC-MS得到的信息,總離子色譜圖的橫坐標(biāo)是出峰時間, 縱坐標(biāo)是峰高。 圖中每個峰表示樣品的一個組份,由每個峰可以得到相應(yīng)化合物的質(zhì)譜圖。 峰面積和該組份含量成正比,可用于定量。,總離子色譜圖 （TI

19、C）,51,得到質(zhì)譜圖后可以通過計算機(jī)檢索對未知化合物進(jìn)行定性。檢索結(jié)果可以給出幾個可能的化合物。并以匹配度大小順序排列出這些化合物的名稱、分子式、分子量和結(jié)構(gòu)式等。使用者可以根據(jù)檢索結(jié)果和其它的信息，對未知物進(jìn)行定性分析。 目前的GC-MS聯(lián)用儀有幾種數(shù)據(jù)庫。應(yīng)用最為廣泛的有NIST庫和Willey庫，前者目前有標(biāo)準(zhǔn)化合物譜圖13萬張，后者有近30萬張。此外還有毒品庫，農(nóng)藥庫等專用譜庫。,庫檢索,52,氣/質(zhì)聯(lián)用是解決復(fù)雜樣品全組分定性定量分析的有力工具。在分析檢測和研究的領(lǐng)域中起著越來越重要的作用，特別是在有機(jī)化合物常規(guī)檢測工作中幾乎成為一種必備的手段。 如石化、化工、食品、環(huán)保、藥物研究

20、、生產(chǎn)、質(zhì)控以及進(jìn)出口許多領(lǐng)域的眾多環(huán)節(jié)中都要用到GC/MS；法庭醫(yī)學(xué)中各類案件的現(xiàn)場采集物分析（嘔吐液、血液等）、毒藥、毒品檢驗與鑒定；甚至體育競技運動中，國際公認(rèn)用GC/MS對運動員進(jìn)行興奮劑檢測數(shù)據(jù)可靠。,氣/質(zhì)聯(lián)用的應(yīng)用,53,Excellence through Evolution,四 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,54,安捷倫液相色譜/離子阱質(zhì)譜系統(tǒng),在線真空脫氣機(jī),二元或四元梯度液相泵,自動進(jìn)樣器,柱溫箱,二極管陣列檢測器,55,安捷倫1100 系列 LC/MSD: 易懂,易用,圖型化的液相和質(zhì)譜控制及分析軟件,56,LC-MS (四極桿)聯(lián)用儀器結(jié)構(gòu)示意圖,57,LC-MS (離子阱)

21、聯(lián)用儀器結(jié)構(gòu)示意圖,58,安捷倫的專利技術(shù) 交叉直角噴霧接口,提高靈敏度 減少污染 降低毛細(xì)管被堵塞 對非揮發(fā)性緩沖液的忍耐能力強(qiáng),59,大氣壓化學(xué)離子源(APCI),電噴霧離子源(ESI),60,大氣壓光離子化源 (APPI),新的大氣壓離子化技術(shù) 使用紫外光代替corona放電方法進(jìn)行氣態(tài)化合物離子化 采用高輸出通量的氣體放電管輸出紫外光,Capillary,HPLC inlet,Nebulizer,Vaporizer (heater),Drying gas,UV Lamp,61,多環(huán)芳烴的液質(zhì)分析結(jié)果,62,哪一種檢測模式最好?,不知道要分析的化合物的性質(zhì)是酸性或堿性 要分析的化合物中同

22、時包含酸性和堿性化合物 酸性和堿性化合物的濃度不同,63,離子阱的核心,環(huán)電極(ring electrode): 781 KHz 0-12,000 Vpp 質(zhì)譜分析用 端 帽（end caps): 0-781 KHz 0-20 V pp 用來做質(zhì)譜分離，CID，在質(zhì)譜分析中的非線形共振噴射 為了捕集、CID和提高質(zhì)譜分辨率，阱里的氦氣通過碰撞來減弱離子的運動,64,離子阱中碰撞誘導(dǎo)分解 (CID) 的變量,碎裂電壓:作用于帽端的電壓 (通常 1 V) 增加離子的動能，其頻率為分離離子的共振頻率 碎裂時間: 碎裂電壓作用的時間 (通常 20ms) 碰撞氣: 氦氣是碰撞氣,65,調(diào)節(jié)碎裂電壓使CI

23、D最大,碎裂電壓有一個電壓范圍(例如0.3 3 V)。 在此范圍內(nèi)波動，確保所有的離子在碎裂時間內(nèi)(例如 20 ms)都經(jīng)過CID， (注意碎裂較電壓波動快，因此離子在碎裂之前不會被噴射出。),碎裂電壓,相對強(qiáng)度,電壓太高-離子在CID之前噴射出 電壓太低-沒有足夠的動能使離子碎裂,66,離子阱上MSn 能力,什么是 MSn ? 該方式是表明多級離子分離和碎裂步驟可產(chǎn)生離子質(zhì)譜圖。 n = 分離和碎裂步驟數(shù)目，最小是1（最后一步是全掃描). e.g. MS3 意義 1) 一個母離子的分離和碎裂 2) 由前級碎裂得到的子離子的分離和碎裂 3) 全掃描質(zhì)譜分析,67,MS3的圖解,累積 第一級離子分離 第一級離子碎裂 第二級離子分離 第二級離子碎裂 第三級質(zhì)譜分析Mass,A +,A1+ A2+ A3+ A4+,A2+,A11+ A21+ A31+ A41+,A11+ A21+ A31+ A41+,MS1 MS2 MS3,68,MS5 范例,69,在高階MSn 信號水平的損失,假設(shè)每一步碎裂產(chǎn)生3個強(qiáng)度相同的離子,70,Agilent 1100 LC/MS TRAP 應(yīng)用范圍,在蛋白質(zhì)及多肽分析中的應(yīng)用