醫(yī)藥學(xué)類文獻(xiàn)雙語(yǔ)版：漢譯英

1、介導(dǎo)的shRNA能抑制肺癌細(xì)胞livin沉默基因的表達(dá)，促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞的凋亡背景由于腫瘤細(xì)胞抑制細(xì)胞凋亡和增殖，抑制細(xì)胞凋亡的特定因子將為開(kāi)發(fā)新的治療策略提供合理的途徑。Livin是凋亡抑制蛋白家族的成員，在各種惡性腫瘤的表達(dá)中具有重要意義。然而，沒(méi)有關(guān)于胃癌的可用數(shù)據(jù)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)了livin基因在人胃癌中的表達(dá)，并研究了shRNA能抑制肺癌細(xì)胞中l(wèi)ivin沉默基因的表達(dá)，從而促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞的凋亡。方法用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和蛋白質(zhì)印跡法分析livin基因的表達(dá)。小干擾核糖核酸真核表達(dá)載體具體采用基因重組和核酸測(cè)序的方法獲得livin基因。然后將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染蛋白200

2、0轉(zhuǎn)染到SGC-7901細(xì)胞中。經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)證實(shí)的livin基因使沉默基因在SGC-7901細(xì)胞中有效。用G418篩選獲得的穩(wěn)定拷貝。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。用MTT比色法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、5-FU和順鉑的50%抑制濃度。結(jié)果40例中，19例(47.5%)為胃癌和SGC 7901細(xì)胞。在腫瘤和良性胃潰瘍病變的鄰近組織中未發(fā)現(xiàn)livin基因表達(dá)。livin基因的表達(dá)與腫瘤的微分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移一致(p005)。四種小干擾RNA的真核表達(dá)載體對(duì)基因重組livin基因的建立具有特異性。其中一種能有效降低livin基因的表達(dá)，抑制基因不低于70%(P 0.01)。提取重組質(zhì)粒并

3、轉(zhuǎn)染到胃癌細(xì)胞中。通過(guò)G418篩選獲得的穩(wěn)定拷貝被放大且精致。livin基因沉默時(shí)，胃癌細(xì)胞的生殖活性明顯低于對(duì)照組(P 0.05)。研究還表明，在胃癌細(xì)胞治療中，5-氟尿嘧啶和順鉑對(duì)IC50可通過(guò)shRNA減少和刺激這些細(xì)胞(5-氟尿嘧啶促凋亡和順鉑)。結(jié)論：livin基因在胃癌中的過(guò)度表達(dá)與腫瘤分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，是胃癌治療的分子預(yù)后因素之一。ShRNA能抑制SGC-7901細(xì)胞中l(wèi)ivin基因的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Livin可作為治療胃癌細(xì)胞凋亡的新靶點(diǎn)。1導(dǎo)言胃癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。大多數(shù)患者在早期被診斷患有這種疾病，錯(cuò)過(guò)了在最佳時(shí)機(jī)手術(shù)治愈的機(jī)會(huì)。盡管有了很大的改善，晚期

4、胃癌化療患者的總生存率仍然很低。癌細(xì)胞對(duì)化療的耐藥性可能導(dǎo)致手術(shù)失敗。在耐藥的原因中，抑制細(xì)胞凋亡起著重要的作用。癌細(xì)胞通常以抗凋亡生長(zhǎng)為特征1，其介導(dǎo)由不同抗性刺激的凋亡，如DNA損傷、缺氧和營(yíng)養(yǎng)損失2，3。此外，在臨床實(shí)踐中，凋亡抵抗被認(rèn)為是腫瘤手術(shù)失敗的主要原因，因此許多化療藥物和/或放療都是通過(guò)誘導(dǎo)凋亡腫瘤的死亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的4。酶抑制劑(IAPs)是一個(gè)新的凋亡蛋白抑制基因家族5，6，包括病毒感染、化療藥物、生長(zhǎng)因子和腫瘤壞死因子-(腫瘤壞死因子-凋亡信號(hào)通路)/Fas信號(hào)通路7-9。IAPs由一組凋亡相關(guān)蛋白10組成，可能在預(yù)防腫瘤細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。這個(gè)家族的新

5、成員是M1-IAP/livin/KIAP/BIRC7(以下簡(jiǎn)稱livin)，它有兩種，livin和livin11-14。有證據(jù)表明，livin的過(guò)表達(dá)可以防止各種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡12。有趣的是，發(fā)現(xiàn)livin基因在腫瘤細(xì)胞中限制性表達(dá)，但在正常人組織中不存在或少量存在11-15，并通過(guò)允許惡性細(xì)胞避免凋亡而導(dǎo)致腫瘤形成。因此，抑制livin基因表達(dá)可能是一種有趣的治療策略。在本研究中，我們研究了livin在胃癌及其鄰近組織中的表達(dá)。分析livin表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。此外，我們還探討了shRNA抑制livin基因表達(dá)的可行性，以及shRNA介導(dǎo)的凋亡細(xì)胞livin基因沉默對(duì)胃癌易感性的影

6、響。2患者和方法2.1患者和腫瘤樣本收集40例胃癌和13例胃癌患者行胃切除術(shù)(患者年齡29-77歲)。其中良性胃潰瘍(慢性淺表性胃炎)患者13例，年齡33 77歲。這些病例均來(lái)自南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院。胃癌患者被診斷為TNM 1-4期(UICC，2002)。手術(shù)后，立即將腫瘤標(biāo)本冷凍在液氮中，并在-80下保存直至使用。這是在所有患者知情同意的情況下獲得的。2.2逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)規(guī)程根據(jù)制造商的說(shuō)明，從冷凍組織中提取總核糖核酸(2毫克)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，最終2微升的體積是100微升的寡核苷酸(dT)15和200微升的MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(promega，美國(guó))。在聚合酶鏈反應(yīng)緩沖液容器中擴(kuò)增250微

7、升對(duì)應(yīng)于等分試樣的cDNA，最后50微升含有25摩爾/毫升的處理劑和1U聚合酶。每個(gè)循環(huán)擴(kuò)增35次，30秒內(nèi)變性曲線達(dá)到94。熱處理在30秒內(nèi)從59(livin和b-actin)擴(kuò)展到30秒內(nèi)的72。無(wú)核糖核酸的病例作為陰性對(duì)照納入逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)。一系列常用的livin和-肌動(dòng)蛋白治療劑如下：livin/下游；5 -TCCAACAGGTGCAGGACT-3 ；-肌動(dòng)蛋白上游，5 -ACGGCAAAGACGATGGAC-3 -肌動(dòng)蛋白下游，5 -AGCGCAAGTATCCGTGG-3 .產(chǎn)品大小為livin/ 312/258 bp和-肌動(dòng)蛋白501bp。2.3蛋白質(zhì)印跡技術(shù)分析病理學(xué)同質(zhì)性和

8、脈沖緩沖液50mM tris-HCl (ph 7.5)、250 mm NaCl、0.1% np40和5mM EGTA含有50mM氟化鈉、60mM -甘油磷酸酯、0.5mM釩酸鈉、0.1mM芐基磺酰氟10g/ml亮胃蛋白酶。蛋白質(zhì)含量用考馬斯亮藍(lán)微盤比色法測(cè)定。蛋白質(zhì)樣品在10%變性SDS凝膠上電泳，并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上(美國(guó)羅氏公司)。膜是一種特異性的主要抗體，與過(guò)氧化物酶二級(jí)抗體反應(yīng)(細(xì)胞信號(hào)技術(shù)，美國(guó))，最后通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)熒光實(shí)現(xiàn)可視化(細(xì)胞信號(hào)技術(shù)，美國(guó))。單克隆抗體livin (1:250)和肌動(dòng)蛋白(1:400)，由Alexesis(美國(guó))和Santa Cruz生物技術(shù)公司(美國(guó))購(gòu)

9、買24細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)我們選擇了一個(gè)人胃腺癌細(xì)胞系進(jìn)行這項(xiàng)研究。SGC-7901(上海細(xì)胞研究所，上海，中國(guó))是一個(gè)人細(xì)胞系，附有中度分化的胃腺。該細(xì)胞系是胃癌細(xì)胞的上皮細(xì)胞，并生長(zhǎng)成貼壁細(xì)胞RPMI 1640 (Hyclone公司，美國(guó))，含有10-Life Technologies公司，每毫升100單位青霉素和每毫升100微克鏈霉素。SGC-7901細(xì)胞保存在含5%CO2空氣的37潮濕培養(yǎng)箱中。將溶解的順鉑和氟尿嘧啶(中國(guó)齊魯制藥廠)儲(chǔ)存在4的二甲基亞砜中。2.5 .ShRNA的合成及PGPU/GFP /Neo/livin質(zhì)粒的制備Livin的ShRNA序列是由siRNASequence-

10、Selector軟件(中國(guó)上海生物技術(shù)股份有限公司集團(tuán)公司)設(shè)計(jì)合成的。序列如下(表1)，然后插入到pGPU/GFP/Neo(上海基因制藥有限公司.中國(guó))BbsI和BamH地址生成pgpu/GFP/neo/livin和pgpu/GFP/neo/對(duì)照質(zhì)子。2.6建立穩(wěn)定表達(dá)pgpu/GFP/neo/livin和pgpu/GFP/neo/對(duì)照轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，將SGC-7901細(xì)胞接種到6孔板(3105孔密度)中，并在用96孔板(1 104孔密度)和12孔板(1.5 105孔密度)轉(zhuǎn)染前培養(yǎng)24小時(shí)。根據(jù)制造商的說(shuō)明，這些細(xì)胞用4毫克/孔的PgPu/GFP/Neo/載體、pGPU/GFP/Neo/livi

11、n或PgPu/GFP/Neo/對(duì)照質(zhì)粒與Li-PoFeckamine 2000(life technology ComPaNY，Oshima，ny)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1:15 (v/v)并用遺傳霉素(G418) 1000 g/ml培養(yǎng)4周。取出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆，并儲(chǔ)存在400 g/ml G418的培養(yǎng)基容器中，用于進(jìn)一步研究。2.7細(xì)胞生長(zhǎng)依賴于貼壁細(xì)胞的測(cè)定將親代細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá)pgpu/GFP/neo/載體的細(xì)胞，以及pgpu/GFP/neo/livin或pgpu/GFP/neo/對(duì)照種植在6孔板中。每隔一天收集三孔細(xì)胞。手機(jī)號(hào)碼是由一個(gè)計(jì)數(shù)器(庫(kù)爾特電子公司，邁阿密，佛羅

12、里達(dá)州)確定的。種植幾天后，用平均標(biāo)準(zhǔn)差記錄每孔細(xì)胞數(shù)。2.8兆噸化驗(yàn)細(xì)胞毒性用MTT法測(cè)定。將幾何生長(zhǎng)的細(xì)胞置于密度為10000個(gè)細(xì)胞/孔的96孔板上24小時(shí)。接下來(lái)，這些細(xì)胞用不同濃度的藥物處理48小時(shí)。向每個(gè)孔中加入100微升的MTT溶液(1毫克/毫升)，并將這些細(xì)胞在37下培養(yǎng)。四個(gè)小時(shí)。在上清液中使用異丙醇代替溶解有色甲.微量酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)得的吸光度波長(zhǎng)為595納米(SLT)。處理過(guò)的細(xì)胞的吸光度相當(dāng)于計(jì)算對(duì)照細(xì)胞的吸光度并顯示細(xì)胞死亡的百分比。2.9流式細(xì)胞術(shù)收集細(xì)胞，在PBS緩沖液中加入冰冷的70%乙醇，并在-4下保存直至使用。懸浮后，在37下培養(yǎng)100毫升核糖核酸酶(1毫克/

13、毫升)和100毫升聚酰亞胺(400微克/毫升)，并用流式細(xì)胞儀分析。2.10統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)該使用至少三種不同的實(shí)驗(yàn)SD方法來(lái)顯示數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)學(xué)生的T檢驗(yàn)進(jìn)行分析，當(dāng)P 0.05時(shí)，認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3個(gè)結(jié)果3.1 .livin在胃腸癌中的表達(dá)在本研究中，我們首次證實(shí)了反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和蛋白質(zhì)印跡技術(shù)在40例胃癌、13例癌組織和13例胃粘膜良性病變中的存在。19/40(47.5%)的癌組織顯示出mRNA和livin和livin蛋白表達(dá)(圖1和2)。Livin表達(dá)與預(yù)后變量有關(guān)，如組織學(xué)惡性腫瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但包括年齡、性別、分期和腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)程度(表2)。3.2 .前列腺素/綠色熒光蛋白/新

14、蛋白/livin和前列腺素/綠色熒光蛋白/新蛋白/對(duì)照的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和表達(dá)我們建立了SGC-7901，用任何pGPU/GFP/Neo/livin、pGPU/GFP/Neo/對(duì)照質(zhì)?；蚩盏膒GPU/GFP/Neo/載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(圖3)。蛋白質(zhì)印跡技術(shù)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)用于選擇每個(gè)轉(zhuǎn)染的克隆，并分析和測(cè)定livin基因和蛋白表達(dá)。其他的被選擇作為延伸和附加研究。(如圖4和5所示)，在SGC-7901 GPU/GFP/Neo/livin 2轉(zhuǎn)染中，livin mRNA和蛋白水平降低了90%以上。pGPU/GFP/Neo/livin1轉(zhuǎn)染和陰性對(duì)照中未發(fā)現(xiàn)Livin表達(dá)抑制。因此，SGC-7901前

15、列腺素pu/綠色熒光蛋白/Neo/livin2被用于隨后的實(shí)驗(yàn)。3.3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染中細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制SGC-7901的生長(zhǎng)速率均顯著抑制轉(zhuǎn)染。如圖所示，SGC-7901細(xì)胞數(shù)量明顯減少。轉(zhuǎn)染后72小時(shí)至96小時(shí)進(jìn)行平板培養(yǎng)(p001)，而陰性對(duì)照組和親本細(xì)胞。3.4 .凋亡因子很容易刺激穩(wěn)定轉(zhuǎn)染我們認(rèn)為SGC-7901基因轉(zhuǎn)染和陰性對(duì)照細(xì)胞的生長(zhǎng)速率明顯受到細(xì)胞毒性順鉑的抑制。圖6顯示，在培養(yǎng)后72小時(shí)和96小時(shí)，與陰性對(duì)照和親代細(xì)胞相比，SGC-7901 pGPU/GFP/Neo/livin2轉(zhuǎn)染細(xì)胞的數(shù)量顯著減少。pgpu的Mtt分析顯示SGC-7901 /Neo/livin2/GFP對(duì)順鉑和氟

16、尿嘧啶的轉(zhuǎn)染比陰性對(duì)照親代細(xì)胞更敏感(圖7A、6B)。順鉑和5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞數(shù)量比順鉑/綠色熒光蛋白/新生血管生成素/凋亡配體2增加了約2.5-3倍，控制了細(xì)胞數(shù)量(P0.001第7C條。).此外，與對(duì)照細(xì)胞相比，它更容易進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染而不發(fā)生自發(fā)凋亡(P0.05)。圖7C)凋亡刺激。討論在這項(xiàng)研究中，我們表明，推薦的新成員，一個(gè)新的IAP家族成員，被認(rèn)為與非癌性胃組織的表達(dá)不一致，僅在胃癌患者的比例中(47.5%)。這也表明自發(fā)凋亡和抑制SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)是抑制Livin表達(dá)或功能的原因，這使得細(xì)胞更容易受到凋亡的刺激。據(jù)信有兩種活細(xì)胞亞型，即A和B，盡管這兩種亞型在體外阻止腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的凋亡參與-A和抗CD95，但它們顯示出一些不同的抗凋亡特征。在阻斷由脫氧核糖核酸損傷劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡方面，活乙肝似乎比活乙肝更有效。對(duì)livin在某些組織中分布的研究表明，最近在心臟、胎盤、肺、脾和卵巢中發(fā)現(xiàn)了A和B兩種亞型，而在腦、骨骼肌和外周血淋巴細(xì)胞中檢測(cè)到了Livin，尤其是在胎兒組織和成人腎中11-14。此外，盡管在一些種類的癌細(xì)胞