醫(yī)藥學類文獻雙語版：漢譯英

1、介導的shRNA能抑制肺癌細胞livin沉默基因的表達，促進SGC-7901細胞的凋亡背景由于腫瘤細胞抑制細胞凋亡和增殖，抑制細胞凋亡的特定因子將為開發(fā)新的治療策略提供合理的途徑。Livin是凋亡抑制蛋白家族的成員，在各種惡性腫瘤的表達中具有重要意義。然而，沒有關(guān)于胃癌的可用數(shù)據(jù)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)了livin基因在人胃癌中的表達，并研究了shRNA能抑制肺癌細胞中l(wèi)ivin沉默基因的表達，從而促進SGC-7901細胞的凋亡。方法用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應和蛋白質(zhì)印跡法分析livin基因的表達。小干擾核糖核酸真核表達載體具體采用基因重組和核酸測序的方法獲得livin基因。然后將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染蛋白200

2、0轉(zhuǎn)染到SGC-7901細胞中。經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應和蛋白質(zhì)印跡試驗證實的livin基因使沉默基因在SGC-7901細胞中有效。用G418篩選獲得的穩(wěn)定拷貝。用流式細胞儀檢測細胞凋亡。用MTT比色法測定細胞生長狀態(tài)、5-FU和順鉑的50%抑制濃度。結(jié)果40例中，19例(47.5%)為胃癌和SGC 7901細胞。在腫瘤和良性胃潰瘍病變的鄰近組織中未發(fā)現(xiàn)livin基因表達。livin基因的表達與腫瘤的微分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移一致(p005)。四種小干擾RNA的真核表達載體對基因重組livin基因的建立具有特異性。其中一種能有效降低livin基因的表達，抑制基因不低于70%(P 0.01)。提取重組質(zhì)粒并

3、轉(zhuǎn)染到胃癌細胞中。通過G418篩選獲得的穩(wěn)定拷貝被放大且精致。livin基因沉默時，胃癌細胞的生殖活性明顯低于對照組(P 0.05)。研究還表明，在胃癌細胞治療中，5-氟尿嘧啶和順鉑對IC50可通過shRNA減少和刺激這些細胞(5-氟尿嘧啶促凋亡和順鉑)。結(jié)論：livin基因在胃癌中的過度表達與腫瘤分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，是胃癌治療的分子預后因素之一。ShRNA能抑制SGC-7901細胞中l(wèi)ivin基因的表達，誘導細胞凋亡。Livin可作為治療胃癌細胞凋亡的新靶點。1導言胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一。大多數(shù)患者在早期被診斷患有這種疾病，錯過了在最佳時機手術(shù)治愈的機會。盡管有了很大的改善，晚期

4、胃癌化療患者的總生存率仍然很低。癌細胞對化療的耐藥性可能導致手術(shù)失敗。在耐藥的原因中，抑制細胞凋亡起著重要的作用。癌細胞通常以抗凋亡生長為特征1，其介導由不同抗性刺激的凋亡，如DNA損傷、缺氧和營養(yǎng)損失2，3。此外，在臨床實踐中，凋亡抵抗被認為是腫瘤手術(shù)失敗的主要原因，因此許多化療藥物和/或放療都是通過誘導凋亡腫瘤的死亡來實現(xiàn)的4。酶抑制劑(IAPs)是一個新的凋亡蛋白抑制基因家族5，6，包括病毒感染、化療藥物、生長因子和腫瘤壞死因子-(腫瘤壞死因子-凋亡信號通路)/Fas信號通路7-9。IAPs由一組凋亡相關(guān)蛋白10組成，可能在預防腫瘤細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，是近年來的研究熱點。這個家族的新

5、成員是M1-IAP/livin/KIAP/BIRC7(以下簡稱livin)，它有兩種，livin和livin11-14。有證據(jù)表明，livin的過表達可以防止各種刺激誘導的細胞凋亡12。有趣的是，發(fā)現(xiàn)livin基因在腫瘤細胞中限制性表達，但在正常人組織中不存在或少量存在11-15，并通過允許惡性細胞避免凋亡而導致腫瘤形成。因此，抑制livin基因表達可能是一種有趣的治療策略。在本研究中，我們研究了livin在胃癌及其鄰近組織中的表達。分析livin表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。此外，我們還探討了shRNA抑制livin基因表達的可行性，以及shRNA介導的凋亡細胞livin基因沉默對胃癌易感性的影

6、響。2患者和方法2.1患者和腫瘤樣本收集40例胃癌和13例胃癌患者行胃切除術(shù)(患者年齡29-77歲)。其中良性胃潰瘍(慢性淺表性胃炎)患者13例，年齡33 77歲。這些病例均來自南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院。胃癌患者被診斷為TNM 1-4期(UICC，2002)。手術(shù)后，立即將腫瘤標本冷凍在液氮中，并在-80下保存直至使用。這是在所有患者知情同意的情況下獲得的。2.2逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應技術(shù)規(guī)程根據(jù)制造商的說明，從冷凍組織中提取總核糖核酸(2毫克)進行反轉(zhuǎn)錄，最終2微升的體積是100微升的寡核苷酸(dT)15和200微升的MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(promega，美國)。在聚合酶鏈反應緩沖液容器中擴增250微

7、升對應于等分試樣的cDNA，最后50微升含有25摩爾/毫升的處理劑和1U聚合酶。每個循環(huán)擴增35次，30秒內(nèi)變性曲線達到94。熱處理在30秒內(nèi)從59(livin和b-actin)擴展到30秒內(nèi)的72。無核糖核酸的病例作為陰性對照納入逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應。一系列常用的livin和-肌動蛋白治療劑如下：livin/下游；5 -TCCAACAGGTGCAGGACT-3 ；-肌動蛋白上游，5 -ACGGCAAAGACGATGGAC-3 -肌動蛋白下游，5 -AGCGCAAGTATCCGTGG-3 .產(chǎn)品大小為livin/ 312/258 bp和-肌動蛋白501bp。2.3蛋白質(zhì)印跡技術(shù)分析病理學同質(zhì)性和

8、脈沖緩沖液50mM tris-HCl (ph 7.5)、250 mm NaCl、0.1% np40和5mM EGTA含有50mM氟化鈉、60mM -甘油磷酸酯、0.5mM釩酸鈉、0.1mM芐基磺酰氟10g/ml亮胃蛋白酶。蛋白質(zhì)含量用考馬斯亮藍微盤比色法測定。蛋白質(zhì)樣品在10%變性SDS凝膠上電泳，并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上(美國羅氏公司)。膜是一種特異性的主要抗體，與過氧化物酶二級抗體反應(細胞信號技術(shù)，美國)，最后通過增強化學熒光實現(xiàn)可視化(細胞信號技術(shù)，美國)。單克隆抗體livin (1:250)和肌動蛋白(1:400)，由Alexesis(美國)和Santa Cruz生物技術(shù)公司(美國)購

9、買24細胞系和細胞培養(yǎng)我們選擇了一個人胃腺癌細胞系進行這項研究。SGC-7901(上海細胞研究所，上海，中國)是一個人細胞系，附有中度分化的胃腺。該細胞系是胃癌細胞的上皮細胞，并生長成貼壁細胞RPMI 1640 (Hyclone公司，美國)，含有10-Life Technologies公司，每毫升100單位青霉素和每毫升100微克鏈霉素。SGC-7901細胞保存在含5%CO2空氣的37潮濕培養(yǎng)箱中。將溶解的順鉑和氟尿嘧啶(中國齊魯制藥廠)儲存在4的二甲基亞砜中。2.5 .ShRNA的合成及PGPU/GFP /Neo/livin質(zhì)粒的制備Livin的ShRNA序列是由siRNASequence-

10、Selector軟件(中國上海生物技術(shù)股份有限公司集團公司)設計合成的。序列如下(表1)，然后插入到pGPU/GFP/Neo(上?；蛑扑幱邢薰?中國)BbsI和BamH地址生成pgpu/GFP/neo/livin和pgpu/GFP/neo/對照質(zhì)子。2.6建立穩(wěn)定表達pgpu/GFP/neo/livin和pgpu/GFP/neo/對照轉(zhuǎn)染實驗，將SGC-7901細胞接種到6孔板(3105孔密度)中，并在用96孔板(1 104孔密度)和12孔板(1.5 105孔密度)轉(zhuǎn)染前培養(yǎng)24小時。根據(jù)制造商的說明，這些細胞用4毫克/孔的PgPu/GFP/Neo/載體、pGPU/GFP/Neo/livi

11、n或PgPu/GFP/Neo/對照質(zhì)粒與Li-PoFeckamine 2000(life technology ComPaNY，Oshima，ny)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48小時后，將這些細胞轉(zhuǎn)移至1:15 (v/v)并用遺傳霉素(G418) 1000 g/ml培養(yǎng)4周。取出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆，并儲存在400 g/ml G418的培養(yǎng)基容器中，用于進一步研究。2.7細胞生長依賴于貼壁細胞的測定將親代細胞和穩(wěn)定表達pgpu/GFP/neo/載體的細胞，以及pgpu/GFP/neo/livin或pgpu/GFP/neo/對照種植在6孔板中。每隔一天收集三孔細胞。手機號碼是由一個計數(shù)器(庫爾特電子公司，邁阿密，佛羅

12、里達州)確定的。種植幾天后，用平均標準差記錄每孔細胞數(shù)。2.8兆噸化驗細胞毒性用MTT法測定。將幾何生長的細胞置于密度為10000個細胞/孔的96孔板上24小時。接下來，這些細胞用不同濃度的藥物處理48小時。向每個孔中加入100微升的MTT溶液(1毫克/毫升)，并將這些細胞在37下培養(yǎng)。四個小時。在上清液中使用異丙醇代替溶解有色甲.微量酶聯(lián)免疫吸附法測得的吸光度波長為595納米(SLT)。處理過的細胞的吸光度相當于計算對照細胞的吸光度并顯示細胞死亡的百分比。2.9流式細胞術(shù)收集細胞，在PBS緩沖液中加入冰冷的70%乙醇，并在-4下保存直至使用。懸浮后，在37下培養(yǎng)100毫升核糖核酸酶(1毫克/

13、毫升)和100毫升聚酰亞胺(400微克/毫升)，并用流式細胞儀分析。2.10統(tǒng)計分析應該使用至少三種不同的實驗SD方法來顯示數(shù)據(jù)。實驗結(jié)果通過學生的T檢驗進行分析，當P 0.05時，認為有統(tǒng)計學意義。3個結(jié)果3.1 .livin在胃腸癌中的表達在本研究中，我們首次證實了反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應和蛋白質(zhì)印跡技術(shù)在40例胃癌、13例癌組織和13例胃粘膜良性病變中的存在。19/40(47.5%)的癌組織顯示出mRNA和livin和livin蛋白表達(圖1和2)。Livin表達與預后變量有關(guān)，如組織學惡性腫瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但包括年齡、性別、分期和腫瘤細胞浸潤程度(表2)。3.2 .前列腺素/綠色熒光蛋白/新

14、蛋白/livin和前列腺素/綠色熒光蛋白/新蛋白/對照的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和表達我們建立了SGC-7901，用任何pGPU/GFP/Neo/livin、pGPU/GFP/Neo/對照質(zhì)?；蚩盏膒GPU/GFP/Neo/載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(圖3)。蛋白質(zhì)印跡技術(shù)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應技術(shù)用于選擇每個轉(zhuǎn)染的克隆，并分析和測定livin基因和蛋白表達。其他的被選擇作為延伸和附加研究。(如圖4和5所示)，在SGC-7901 GPU/GFP/Neo/livin 2轉(zhuǎn)染中，livin mRNA和蛋白水平降低了90%以上。pGPU/GFP/Neo/livin1轉(zhuǎn)染和陰性對照中未發(fā)現(xiàn)Livin表達抑制。因此，SGC-7901前

15、列腺素pu/綠色熒光蛋白/Neo/livin2被用于隨后的實驗。3.3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染中細胞生長的抑制SGC-7901的生長速率均顯著抑制轉(zhuǎn)染。如圖所示，SGC-7901細胞數(shù)量明顯減少。轉(zhuǎn)染后72小時至96小時進行平板培養(yǎng)(p001)，而陰性對照組和親本細胞。3.4 .凋亡因子很容易刺激穩(wěn)定轉(zhuǎn)染我們認為SGC-7901基因轉(zhuǎn)染和陰性對照細胞的生長速率明顯受到細胞毒性順鉑的抑制。圖6顯示，在培養(yǎng)后72小時和96小時，與陰性對照和親代細胞相比，SGC-7901 pGPU/GFP/Neo/livin2轉(zhuǎn)染細胞的數(shù)量顯著減少。pgpu的Mtt分析顯示SGC-7901 /Neo/livin2/GFP對順鉑和氟

16、尿嘧啶的轉(zhuǎn)染比陰性對照親代細胞更敏感(圖7A、6B)。順鉑和5-氟尿嘧啶誘導的凋亡細胞數(shù)量比順鉑/綠色熒光蛋白/新生血管生成素/凋亡配體2增加了約2.5-3倍，控制了細胞數(shù)量(P0.001第7C條。).此外，與對照細胞相比，它更容易進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染而不發(fā)生自發(fā)凋亡(P0.05)。圖7C)凋亡刺激。討論在這項研究中，我們表明，推薦的新成員，一個新的IAP家族成員，被認為與非癌性胃組織的表達不一致，僅在胃癌患者的比例中(47.5%)。這也表明自發(fā)凋亡和抑制SGC-7901細胞生長是抑制Livin表達或功能的原因，這使得細胞更容易受到凋亡的刺激。據(jù)信有兩種活細胞亞型，即A和B，盡管這兩種亞型在體外阻止腫瘤壞死因子誘導的凋亡參與-A和抗CD95，但它們顯示出一些不同的抗凋亡特征。在阻斷由脫氧核糖核酸損傷劑誘導的細胞凋亡方面，活乙肝似乎比活乙肝更有效。對livin在某些組織中分布的研究表明，最近在心臟、胎盤、肺、脾和卵巢中發(fā)現(xiàn)了A和B兩種亞型，而在腦、骨骼肌和外周血淋巴細胞中檢測到了Livin，尤其是在胎兒組織和成人腎中11-14。此外，盡管在一些種類的癌細胞