課題2　土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù) (11).ppt

1、土壤中分解尿素的細菌的 分離與計數(shù),課題2,課題目的,土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù),尿素簡介,從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌,對分解尿素的細菌的計數(shù) （統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣細菌）,尿素分子的立體結(jié)構(gòu),1.土壤取樣 2.制備培養(yǎng)基 3.微生物的培養(yǎng)與觀察 4.細菌的計數(shù),怎樣分離？,怎樣計數(shù)？,研究思路,（一）篩選菌株,水生耐熱細菌Taq ( Thermus aquaticus ) 耐高溫的Taq DNA聚合酶 美國微生物學科布魯克（T.Brock) 1966年發(fā)現(xiàn)耐熱細菌,選擇培養(yǎng)基 在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。,KH

2、2PO4 1.4g Na2HP04 2.1g MgS047H20 0.2g 葡萄糖 10g 尿素 1g 瓊脂 3g,稀釋涂布平板法,當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。也就是 說平板上一個菌落 代表一個活菌。,（也叫活菌計數(shù)法）,（二）分解尿素的細菌的計數(shù),原理：,系列稀釋操作,涂布平板操作,第一位同學在該濃度下涂布了一個平板，統(tǒng)計菌落數(shù)目為230。 第二位同學在該濃度下涂布了三個平板，統(tǒng)計菌落數(shù)分別為：21、212、256。該同學以這三個平板上菌落數(shù)的平均值163作為統(tǒng)計結(jié)果。,你認為這兩位同學的實驗需要改進嗎？如果需要如何改進？,兩位同學用稀釋涂

3、布平板法測定同一土壤樣品細菌數(shù)，在對應稀釋倍數(shù)為106倍的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計結(jié)果：,統(tǒng)計記錄,（二）分解尿素的細菌的計數(shù),第一位同學只涂布了一個平板，沒有設(shè)置重復組，因此結(jié)果不具有說服力。,第二位同學考慮到設(shè)置重復組的問題，涂布了3個平板，但是，其中1個平板的計數(shù)結(jié)果與另2個相差太遠，說明在操作過程中可能出現(xiàn)了錯誤，因此，不能簡單地將3個平板的計數(shù)值用來求平均值。,（二）分解尿素的細菌的計數(shù),在設(shè)計實驗時，一定要至少涂布三個平板，作為重復組，才能增強實驗的說服力與準確性。在分析實驗結(jié)果時，一定要考慮所設(shè)置的重復組的結(jié)果是否一致，結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需要重新實驗。,（二）分解尿素

4、的細菌的計數(shù),101,（二）分解尿素的細菌的計數(shù),為了保證結(jié)果準確，一般選擇菌落數(shù)在30-300的平板進行計數(shù),恰當?shù)南♂尪仁浅晒y(tǒng)計菌落數(shù)目的關(guān)鍵。,稀釋涂布平板法,土壤稀釋,平板上的菌落數(shù)應為30300個，便于準確計數(shù)。,（二）分解尿素的細菌的計數(shù),1g土樣,9ml 無菌水,涂布接種,（二）分解尿素的細菌的計數(shù),（三）設(shè)置對照,一是由于土樣不同，二是由于培養(yǎng)基污染或操作失誤。 一種方案是可以由其他同學用與A同學一樣的土樣進行實驗，如果結(jié)果與A同學一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。 另一種方案是將A同學配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進行培養(yǎng)，作為

5、空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。通過這個事例可以看出，實驗結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。,（三）設(shè)置對照,有一位同學在稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中測得平板上菌落數(shù)的平均值為268，那么每毫升樣品中的菌落數(shù)是（涂布平板時所用稀釋液的體積為0.2毫升）多少？,每毫升樣品中的菌落數(shù)(C/V) M,C:代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù) V:代表涂布平板時所用的稀釋液的體積 M：稀釋的倍數(shù),（二）分解尿素的細菌的計數(shù),三、操作步驟,1、土壤取樣,2、樣品稀釋,3、取樣涂布,4、培養(yǎng)與觀察,過程：,三、操作步驟,細菌適宜在酸度接近中性的潮濕土壤中生長。,鏟去土壤表層目的,從肥沃、濕潤的土

6、壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。,1、土壤取樣,2、樣品稀釋,三、操作步驟,通常選用一定稀釋范圍的樣品進行培養(yǎng)，以保證獲得菌落數(shù)在30300之間、適于計數(shù)的平板。,3、取樣涂布：,按照由104106稀釋度的順序分別吸取0.1 mL進行平板涂布操作，每3個一組并分別標號。按照濃度從低到高的順序涂布平板，不必更換移液管。,三、操作步驟,4、微生物的培養(yǎng)與觀察：,細菌：30370C的溫度下培養(yǎng)12d,放線菌：25280C的溫度下培養(yǎng)57d,霉菌：25280C的溫度下培養(yǎng)34d,我們可以每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，這樣可以防止因培養(yǎng)時間不足而導致遺漏菌落的數(shù)目,培養(yǎng)溫度及時間,觀察過程,三、操作步驟,在一定的培養(yǎng)條件下（相同的培養(yǎng)基、溫度、及培養(yǎng)時間）同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的相同的菌落特征，不同的微生物菌落特征不同