動物細(xì)胞融合與單克隆抗體

1、,2.2.2 動物細(xì)胞融合與單克隆抗體,問題探討,“番茄馬鈴薯”（理想圖）,通過長期的實(shí)驗(yàn)，科學(xué)家們采用體細(xì)胞雜交技術(shù)獲得了“番茄馬鈴薯”植株。,如果將奶牛的細(xì)胞與植物細(xì)胞雜交，得到綠色的小奶牛，那豈不是只要曬曬太陽就可以擠出牛奶嗎？,動物細(xì)胞也能融合嗎？,一.動物細(xì)胞融合 1.動物融合的過程 請同學(xué)們閱讀課本P52動物融合,動物細(xì)胞融合也稱細(xì)胞雜交，是指兩個或多個動物細(xì)胞結(jié)合形成一個細(xì)胞的過程，融合后形成的具有原來兩個或多個細(xì)胞遺傳信息的單核細(xì)胞稱為雜交細(xì)胞。,一、動物細(xì)胞融合,細(xì)胞融合是正常的生命活動,兩個細(xì)胞正在融合,受精作用,動物細(xì)胞融合過程示意圖,不同DNA的兩個細(xì)胞,滅活的病毒,有

2、絲分裂,兩個完整的雜交細(xì)胞,細(xì)胞融合與融合誘導(dǎo)細(xì)胞融合物質(zhì)：,誘導(dǎo)劑：仙臺病毒、聚乙二醇誘導(dǎo)細(xì)胞融合的仙臺病毒必須滅活。 思考討論：為什么細(xì)胞融合過程中使用的病毒需要滅活？不滅活行嗎？,因?yàn)闇缁畹牟《灸苁辜?xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂 質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合，不滅 活的話會感染細(xì)胞，而不能誘導(dǎo)細(xì)胞融合。,細(xì)胞融合技術(shù)應(yīng)用于哪些方面？,細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)及制備單克隆抗體。,滅活病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合的原理：,病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細(xì)胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細(xì)胞互相凝聚，細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合。 滅活是指用物理或化學(xué)手段使病毒或細(xì)菌

3、失去感染能力，但并不破壞這些病原體的抗原結(jié)構(gòu)。,思考題,1.植物體細(xì)胞雜交時(shí)首先應(yīng)用什么方法去掉細(xì)胞壁？,酶解法，如纖維素酶或果膠酶,2.動物細(xì)胞融合時(shí)需要進(jìn)行去壁處理嗎？為什么？,無需，因?yàn)閯游锛?xì)胞無細(xì)胞壁,3.植物體細(xì)胞雜交誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合常用的方法有哪些？,離心、電激等物理方法；PEG等化學(xué)方法,4.動物細(xì)胞融合能利用上述兩類方法嗎？還有其他方法嗎？,能 還可以利用滅活的病毒進(jìn)行誘導(dǎo),6.你推測一下動物細(xì)胞融合有哪些方面的應(yīng)嗎？,思考題,利用動物細(xì)胞融合技術(shù)誘導(dǎo)形成雜交瘤細(xì)胞,7.在生產(chǎn)實(shí)際中雜交瘤細(xì)胞有怎樣的應(yīng)用？,生產(chǎn)單克隆抗體,5.植物體細(xì)胞雜交應(yīng)先進(jìn)行原生質(zhì)體的融合再進(jìn)行組織培養(yǎng)

4、形成完整的雜種個體，動物細(xì)胞融合后能形成雜種動物個體嗎？,不能,主要用于制備,單克隆抗體,獲得雜種植株,主要用途,物理、化學(xué)方法,（同左）,滅活的病毒,物理（離心、振動、電刺激）,化學(xué)（聚乙二醇）,誘導(dǎo)方法,使細(xì)胞分散后誘,導(dǎo)細(xì)胞融合,去除細(xì)胞壁后誘,導(dǎo)原生質(zhì)體融合,細(xì)胞融合的方法,細(xì)胞膜的流動性,細(xì)胞膜的流動性、,植物細(xì)胞全能性,細(xì)胞融合的原理,動物細(xì)胞融合,植物體細(xì)胞雜交,比較項(xiàng)目,植物體細(xì)胞雜交與動物細(xì)胞融合的比較,1.抗體是由何種細(xì)胞產(chǎn)生的？ 效應(yīng)B細(xì)胞（漿細(xì)胞）。 2.一個淋巴細(xì)胞(漿細(xì)胞)能分泌多種抗體嗎？ 每一個淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體。 3.一種抗原侵入機(jī)體之后，引起機(jī)體免

5、疫反應(yīng)產(chǎn)生的抗體只有一種嗎？ 動物在免疫反應(yīng)過程中，體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體種類可多達(dá)百萬種以上。 4. 簡述獲得抗體的傳統(tǒng)途徑？ 抗原 動物體 抗體 抗原不純 抗體不純,二、單克隆抗體,刺激,漿細(xì)胞,B淋巴細(xì)胞與抗體的關(guān)系：,B淋巴細(xì)胞受抗原刺激后，可以產(chǎn)生抗體。 動物體內(nèi)的B淋巴細(xì)胞可以產(chǎn)生百萬種以上的抗體，每種抗體對特定的抗原具有特異性免疫作用。 每一個淋巴細(xì)胞只能產(chǎn)生一種抗體。,所以傳統(tǒng)的抗體的生產(chǎn)方法及缺陷是什么？ 怎樣解決這個問題？,6.如何獲得化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體？ 體外培養(yǎng)單個淋巴細(xì)胞，提取分泌的抗體,7.體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞能無限增殖嗎?怎樣解決這個問題？,5.這種方法獲得的

6、抗體有什么缺陷？ 產(chǎn)量低，純度低，特異性差,1.設(shè)計(jì)方案： 一個B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體 小鼠骨髓瘤細(xì)胞能夠無限增殖,雜種細(xì)胞,二、單克隆抗體,2.制備過程：,如何大量生產(chǎn)單克隆抗體？,利用淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的功能 利用腫瘤細(xì)胞無限增殖的特性 利用細(xì)胞融合的技術(shù)將兩種細(xì)胞融合獲得具有淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞特性的雜交瘤細(xì)胞 利用動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞,如何篩選？,融合方式？,單克隆抗體制備過程,細(xì)胞融合、篩選,足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細(xì)胞群,單克隆抗體,免疫小鼠,培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞,融合,骨髓瘤細(xì)胞,B淋巴細(xì)胞,注射特定抗原蛋白,選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng),專一抗體檢驗(yàn)陽性,專一抗體檢驗(yàn)陽性,

7、注射到小鼠體內(nèi),體外培養(yǎng),單克隆抗體,克隆雜交細(xì)胞,分開不同雜交細(xì)胞，克隆專一抗體，檢驗(yàn)陽性細(xì)胞,單克隆抗體制備過程示意圖,多種雜交細(xì)胞,2020/10/8,19,要點(diǎn)解讀 (1)誘導(dǎo)融合的2種細(xì)胞名稱及作用 免疫過的B淋巴細(xì)胞(漿細(xì)胞)產(chǎn)生抗體; 骨髓瘤細(xì)胞無限增殖。 (2)誘導(dǎo)融合與原生質(zhì)融合的不同方法 動物細(xì)胞誘導(dǎo)融合的特有方法滅活病毒誘導(dǎo)。,2020/10/8,20,(3)2次篩選的目的及方法,在特定的選擇性培養(yǎng)基上,未融合的親本細(xì)胞 (漿細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞)和融合的具有同種核的細(xì)胞(BB融合細(xì)胞、瘤瘤融合細(xì)胞)都會死亡,只有融 合的雜種細(xì)胞(雜交瘤細(xì)胞)才能生長。這種雜種 細(xì)胞的特點(diǎn)是

8、既能迅速大量繁殖,又能產(chǎn)生單一的特異性抗體。,2020/10/8,21,經(jīng)選擇性培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞并非都是能分泌所需抗體的細(xì)胞(很多種雜交瘤細(xì)胞),需經(jīng)克隆化培養(yǎng)和抗體檢測,經(jīng)多次篩選后就可獲得足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的細(xì)胞。 (4)2個培養(yǎng)提取場所 體外培養(yǎng)培養(yǎng)液提取。 體內(nèi)小鼠腹腔中培養(yǎng)小鼠腹水中提取。,3.單克隆抗體的應(yīng)用：,在基礎(chǔ)理論研究中具有重要意義,在疾病診斷、治療和預(yù)防方面，具有,生物導(dǎo)彈,二、單克隆抗體,特異性強(qiáng)、靈敏度高 等優(yōu)越性。,3、單克隆抗體的應(yīng)用,與常規(guī)抗體相比，單克隆抗體產(chǎn)量高，特異性強(qiáng)，靈敏度高，優(yōu)越性十分明顯。,應(yīng)用主要有：,1、臨床診斷,2、作為載體，運(yùn)載抗癌藥

9、物，形成“生物導(dǎo)彈”治療腫瘤,資料：目前世界各國已經(jīng)研制出數(shù)以百計(jì)的單克隆抗體。許多缺乏良好診斷手段的傳染病、免疫性疾病、血液病、內(nèi)分泌疾病和遺傳病，用單克隆抗體作為診斷手段，是一個必然趨勢。另外，用單克隆抗體做體內(nèi)診斷，借以鑒別和定位體內(nèi)“病灶”也引起人們的注意，目前，主要用于腫瘤追蹤及心肌梗塞的診斷。,用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體做成的“早早孕診斷試劑盒”，靈敏度很高，在妊娠第8天就可以做出診斷，比原來的診斷方法提前了10天左右，可以避免孕婦在不知道妊娠的情況下因服用藥物而對胎兒造成不利影響。該方法檢測的準(zhǔn)確率在90以上。,2020/10/8,26,提醒 取相應(yīng)B細(xì)胞前必需先注射相應(yīng)抗

10、原,形象 地說先“打針”,否則失敗。 (5)原理：細(xì)胞膜的流動性和細(xì)胞增殖。 拓展提升 植物體細(xì)胞雜交和單克隆抗體的制備的比較,2020/10/8,27,2020/10/8,28,知識結(jié)構(gòu),兩個過程,動物細(xì)胞培養(yǎng)過程,單克隆抗體制備過程,三個“一”,一個誘導(dǎo)細(xì)胞融合的新方法 滅活的病毒,一個新細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞,一個優(yōu)勢單克隆抗體特異性 強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)勢,三.思考與探究 1.植物體細(xì)胞雜交技術(shù)與動物細(xì)胞融合技術(shù)有什么不同？ 2.制備單克隆抗體時(shí)，為什么要選用B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞？,提示：植物體細(xì)胞雜交技術(shù)與動物細(xì)胞融合技術(shù)基本相同，不同的是植物體細(xì)胞融合前需去掉細(xì)胞壁，然后再

11、融合；動物細(xì)胞融合是兩個體細(xì)胞直接融合。,提示：哺乳動物感染抗原后，其體內(nèi)會形成相應(yīng)的B淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞 能分泌相應(yīng)的抗體凝聚或殺死這些抗原。動物在免疫反應(yīng)的過程中，每一種B淋巴細(xì)胞能分泌一種特異性抗體，要想獲得大量的特異性抗體，必須使能分泌該單一抗體的B淋巴細(xì)胞大量增殖。B淋巴細(xì)胞具有產(chǎn)生單一抗體的能力，但不能在體外增殖；骨髓瘤細(xì)胞是一種癌細(xì)胞，它能在體外培養(yǎng)條件下無限增殖，但不能產(chǎn)生抗體。因此，把一種B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，它會兼有兩個親本細(xì)胞的特性在體外培養(yǎng)條件下能不斷增殖，同時(shí)能產(chǎn)生出某種特異性的抗體。,教學(xué)參考,1.已成功的動物細(xì)胞融合實(shí)例還有哪些？,

12、生物種類 細(xì)胞來源 成功年代 酵母菌雞 原生質(zhì)體血紅細(xì)胞 1975年 人胡蘿卜 腹水癌細(xì)胞原生質(zhì)體 1976年 人小鼠 纖維肉瘤細(xì)胞畸胎瘤細(xì)胞 1978年,要知道更多的實(shí)例，需經(jīng)常查閱更多科研報(bào)道。,2.為什么不用兩個而要用多個細(xì)胞進(jìn)行動物細(xì)胞間的融合？,就目前常用的細(xì)胞融合方法來看，不管是用物理的、化學(xué)的方法，還是生物的方法，其融合率都不可能是100%。僅用兩個細(xì)胞融合，其效率太低，不一定能得到融合細(xì)胞。更重要的是，即使兩個細(xì)胞已發(fā)生融合，但并不一定是研究者期望得到的細(xì)胞類型。目前動物細(xì)胞融合技術(shù)最有價(jià)值的應(yīng)用就是單克隆抗體的制備。我們以制備單克隆抗體為例來說明這一問題。我們知道，體內(nèi)產(chǎn)生的

13、特異性抗體種類可多達(dá)百萬種以上，但是每一個B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體，如果僅取一個脾細(xì)胞（含B淋巴細(xì)胞）和一個瘤細(xì)胞雜交，我們不能確定該脾細(xì)胞分泌的抗體是否正是我們所需要的；若用大量的脾細(xì)胞和瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，就可以從融合細(xì)胞中篩選出能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。,3.如何進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的抗體檢測及克隆化培養(yǎng)？,融合后的細(xì)胞經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后，能存活的細(xì)胞就是雜交瘤細(xì)胞。但這些雜交瘤細(xì)胞并非都是能分泌所需抗體的細(xì)胞，通常用“有限稀釋法”來選擇。將雜交瘤細(xì)胞稀釋，用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，使每孔細(xì)胞不超過一個，通過培養(yǎng)讓其增殖。然后檢測各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體（常用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法），那些上清

14、液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔。陽性孔中的細(xì)胞還不能保證是來自單個細(xì)胞，挑選陽性孔的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行有限稀釋，一般需進(jìn)行34次，直至確信每個孔中增殖的細(xì)胞為單克隆細(xì)胞。該過程即為雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)。,教學(xué)反饋,1.動物細(xì)胞融合技術(shù)最重要的用途是 （ ） A.克服遠(yuǎn)源雜交不親和 B.制備單克隆抗體 C.培育新物種 D.生產(chǎn)雜種細(xì)胞,B,2.單克隆抗體是由下列哪種細(xì)胞產(chǎn)生的（ ）A.B淋巴細(xì)胞 B.T淋巴細(xì)胞 C.骨髓瘤細(xì)胞 D.雜交瘤細(xì)胞,D,3.（多選）1975年米爾斯坦和柯勒成功地獲得了單克隆抗體。下列細(xì)胞中與單克隆抗體的制備有關(guān)的是（ ） A.效應(yīng)B細(xì)胞 BT淋巴細(xì)胞C.骨髓瘤細(xì)胞 D

15、雜交瘤細(xì)胞,A B C D,4.下圖為某同學(xué)根據(jù)雜交瘤技術(shù)的方法，設(shè)計(jì)的生產(chǎn)破傷風(fēng)桿菌的實(shí)驗(yàn)方案,制備單克隆抗體,不能，沒有將抗原注入小鼠體內(nèi)，無法獲得產(chǎn)生單一抗體的B淋巴細(xì)胞。,(1).該實(shí)驗(yàn)方案的目的是：_,(2).該方案能達(dá)到預(yù)期效果嗎？為什么？,(3).A是從小鼠的脾臟中取得_ 該細(xì)胞能夠產(chǎn)生_ 。,(4).圖中B為_過程，常用_作為誘導(dǎo)劑，該細(xì)胞繼承_的遺傳特性，既能_,又能_。,(5).C過程指細(xì)胞培養(yǎng)，該過程包括_培養(yǎng)和_培養(yǎng)兩個階段，其中_代以內(nèi)的的細(xì)胞屬于細(xì)胞株。,B淋巴細(xì)胞,抗體,細(xì)胞融合,滅活的病毒,雙親細(xì)胞,分泌抗體,無限增殖,原代,傳代,50,課后習(xí)題,1. 單克隆抗體制備過程中，骨髓瘤細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞 誘導(dǎo)融合后，要用特定培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細(xì)胞， 在這種培養(yǎng)基上不能存活增殖的細(xì)胞是 （ ） 淋巴細(xì)胞 小鼠骨髓瘤細(xì)胞 B淋巴細(xì)胞自身融合細(xì)胞 小鼠骨髓瘤細(xì)胞自身融合細(xì)胞 雜交瘤細(xì)胞 A. B. C. D.,C,2.動物細(xì)胞融合和植物