蛋白質(zhì)組學(xué)及技術(shù)介紹【研究知識】

1、,蛋白質(zhì)組學(xué),概念 蛋白質(zhì)組是在一個(gè)細(xì)胞的整個(gè)生命過程中由基因組表達(dá)的以及表達(dá)后修飾的全部蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)組學(xué)是蛋白質(zhì)組概念的延伸。是蛋白質(zhì)的規(guī)?；芯?，從蛋白質(zhì)水平和生命本質(zhì)層次上研究和發(fā)現(xiàn)生命活動的規(guī)律和重要生理、病理現(xiàn)象的本質(zhì)，揭示基因活動的動態(tài)表達(dá)。 蛋白質(zhì)水平的分析不僅為生物分子體系提供最有效的實(shí)時(shí)分析模型而且也獲得了DNA和RNA水平上不易獲得的信息。,研究內(nèi)容,蛋白質(zhì)的研究內(nèi)容主要有兩方面： 1、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)：主要是蛋白質(zhì)表達(dá)模型的研究，包括蛋白質(zhì)氨基酸序列 分析及空間結(jié)構(gòu)的解析種類分析及數(shù)量確定; 2、功能蛋白質(zhì)組學(xué)：主要是蛋白質(zhì)功能模式的研究，包括蛋白質(zhì)功能及蛋白質(zhì)間的相互

2、作用。,研究內(nèi)容,蛋白質(zhì)組學(xué)可分為三個(gè)主要領(lǐng)域： 1、蛋白質(zhì)的微特性以供蛋白質(zhì)的規(guī)模化鑒定和他們的后翻譯飾； 2、“差異顯示”蛋白質(zhì)組學(xué)供蛋白質(zhì)水平與疾病在廣泛范圍的有力應(yīng)用比較； 3、應(yīng)用特定的分析技術(shù)如質(zhì)譜法（包括串聯(lián)質(zhì)譜法、生物質(zhì)譜法）或酵母 雙雜交系統(tǒng)以及其他蛋白質(zhì)組學(xué)研究新技術(shù)研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。,研究技術(shù),3,蛋白質(zhì)分離策略： 1、多維色譜法，包括大小排阻色譜法、離子交換色譜法、反相高效色譜法、疏水性相互作用色譜法等； 2、多維電泳技術(shù)，包括二維凝膠電泳法、自由流動電泳法、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法等； 3、親合法，包括免疫印跡法、親和捕獲； 4、細(xì)胞器，膜的復(fù)合體分離。,二維凝膠電

3、泳法： 二維凝膠電泳的原理是第一向基于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離，把復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開。 2-DE有較好的分辨率，SDS-PAGE或單相IEF的最好分辨率僅為100個(gè)蛋白，而2-DE大約為3000個(gè)蛋白。,蛋白質(zhì)肽段的鑒定: 1、氨基和羧基末端分析，如：Edman 2、質(zhì)譜法，包括肽片段的質(zhì)譜和串聯(lián)質(zhì)譜法、,質(zhì)譜法： 質(zhì)譜（mass spectrum）是化合物分子在真空條件下受電子流的轟擊或強(qiáng)電場等其他方法的作用，電離成離子，同時(shí)發(fā)生某些化學(xué)鍵有規(guī)律的斷裂，生成具有不同質(zhì)量的帶電荷的離子，這些離子按質(zhì)荷比m/z（離子的質(zhì)

4、量m與其所帶電荷z的比值）的大小被收集并記錄程譜的方法。 生物質(zhì)譜技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最重要的鑒定技術(shù)，其基本原理是樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子之間的荷質(zhì)比（M/E）的差異來分離并確定分子量。對于經(jīng)過雙向電泳分離的目標(biāo)蛋白質(zhì)用胰蛋白酶酶解（水解Lys或Arg的-C端形成的肽鍵）成肽段，對這些肽段用質(zhì)譜進(jìn)行鑒定與分析。目前常用的質(zhì)譜包括兩種：基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）和電噴霧質(zhì)譜（ESI- MS）。,蛋白質(zhì)相互作用 1、免疫共沉淀技術(shù)： 該技術(shù)以抗體和抗原之間的特異性結(jié)合為基礎(chǔ)，不僅能夠確定生理?xiàng)l件下細(xì)胞或組織內(nèi)2種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否存在相互作用，還可以探究與

5、己知相互作用的蛋白。 它的基本原理是在非變性條件下裂解細(xì)胞，保留細(xì)胞內(nèi)相互作用的蛋白質(zhì)，將目的蛋白的抗體加入細(xì)胞裂解液中，使目的蛋白在體內(nèi)的相互作用蛋白成電下來。經(jīng)過洗脫，收集沉淀物并進(jìn)行分離，最后對分離所獲得蛋白進(jìn)行鑒定。 該方法所研究的蛋白均是在體內(nèi)經(jīng)過翻譯后修飾的，并且是可分離的天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物，能夠反映正常生理?xiàng)l件下的蛋白質(zhì)間相互作用,蛋白質(zhì)相互作用 2、酵母雙雜交系統(tǒng)： 該系統(tǒng)利用真核細(xì)胞調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程中，DN A結(jié)合結(jié)構(gòu)域(binding domain,BD)識別DNA上的特異序列并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain, AD)啟動所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄這

6、一原理，將己知蛋白X和待研究蛋白Y的基因分別與編碼AD和BD的序列結(jié)合，通過載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入同一酵母細(xì)胞中表達(dá)，生成兩個(gè)融合蛋白。若蛋白X和Y可以相互作用，則AD和BD在空間上接近就能形成完整的有活性的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而啟動轉(zhuǎn)錄，表達(dá)相應(yīng)的報(bào)告基因;反之，如果X和Y之間不存在相互作用，報(bào)告基因就不會表達(dá)。這樣，通過報(bào)告基因的表達(dá)與否，便可確定是否發(fā)生了蛋白質(zhì)的相互作用。,蛋白質(zhì)相互作用 3、蛋白質(zhì)芯片技術(shù) 蛋白質(zhì)芯片是一種新型的生物芯片，能夠進(jìn)行高通量的蛋白功能分析。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)的基礎(chǔ)是蛋白探針在固相支持物(載體)表而的大規(guī)模集成，利用樣品中標(biāo)記或未經(jīng)標(biāo)記的靶蛋白分子與探針進(jìn)行反 應(yīng)，然后通過熒光法、放

7、射性同位素法或無標(biāo)記檢測法等相應(yīng)的方法進(jìn)行檢測，最后由計(jì)算機(jī)分析結(jié)果，獲得高豐度表達(dá)蛋白。,蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用,疾病研究 植物學(xué) 藥物研究 食品科學(xué) 遺傳病學(xué) 微生物學(xué),在疾病及藥物研究中的應(yīng)用,1.發(fā)現(xiàn)新的疾病標(biāo)志物，鑒定疾病相關(guān)蛋白質(zhì)作為早期臨床診斷標(biāo)志。 例如：Lei等通過2-DE和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜等蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)對膀胱癌患者的尿蛋白進(jìn)行分離鑒定，獲得14個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，這些差異表達(dá)的蛋白可能是診斷和檢測膀胱癌的潛在尿標(biāo)志物。,在疾病及藥物研究中的應(yīng)用,2.探索疾病的發(fā)病機(jī)制和治療途徑。 例：Polprasert等應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法對遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥的紅細(xì)胞膜

8、蛋白變化進(jìn)行研究，分離鑒定出56個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，通過蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)分析出包括細(xì)胞死亡、細(xì)胞循環(huán)及遺傳性和血液性紊亂3個(gè)HS相關(guān)的重要網(wǎng)絡(luò)，為進(jìn)一步研究和了解HS相關(guān)的發(fā)病機(jī)制提供了參考。,在疾病及藥物研究中的應(yīng)用,3.研究膜蛋白及膜相關(guān)蛋白 Liu等利用比較膜蛋白組學(xué)方法對H5N1病毒分別感染6,12,14h的人肺腺癌細(xì)胞A549進(jìn)行蛋白分析鑒定，得到24個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，其中57%為膜蛋白或膜相關(guān)蛋白，通過siRNA技術(shù)鑒定出與病毒增殖相關(guān)的幾種蛋白質(zhì)。,在疾病及藥物研究中的應(yīng)用,4、為快速，特異，高通量的藥物研究提供了技術(shù)支持。 Lin等應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對阿霉素處理的人子宮癌細(xì)胞的蛋白

9、表達(dá)變化進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，有 37 種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，為阿霉素抗性的子宮癌細(xì)胞的治療提供了診斷和治療標(biāo)志物。,蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù),蛋白質(zhì)分離技術(shù)：雙向凝膠電泳（2DE），雙向熒光差異電泳（2D-DIGE），等電聚焦電泳（IEF）,液相色譜。 多維色譜（MDC），多維液相色譜（MDLC） 蛋白質(zhì)鑒定技術(shù) 一級質(zhì)譜：根據(jù)離子源的不同，分為基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）和電噴霧質(zhì)譜（ESI- MS）。二級質(zhì)譜： 肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF）。 新技術(shù)：穩(wěn)定同位素特征標(biāo)簽生物質(zhì)譜(SIAMS),iTRAQ,定義：同位素標(biāo)記相對和絕對定量(isobaric tags for

10、relative and absolute quantitation，iTRAQ) 技術(shù)由AB SCIEX公司研發(fā)的一種體外同種同位素標(biāo)記的相對與絕對定量技術(shù)。該技術(shù)利用多種同位素試劑標(biāo)記蛋白多肽N末端或賴氨酸側(cè)鏈基團(tuán)，經(jīng)高精度質(zhì)譜儀串聯(lián)分析，可同時(shí)比較多達(dá)8種樣品之間的蛋白表達(dá)量，是近年來定量蛋白質(zhì)組學(xué)常用的高通量篩選技術(shù)。 原理：iTRAQ 技術(shù)采用4種或8種同位素編碼的標(biāo)簽，通過特異性標(biāo)記多肽的氨基基團(tuán)，而后進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，可同時(shí)比較4種或8種不同樣品中蛋白質(zhì)的相對含量或絕對含量。,iTRAQ試劑 iTRAQ試劑是一種小分子同重元素化學(xué)物質(zhì)，包括三部分： 1.一端是報(bào)告部分 repor

11、ter group 2.另一端是肽反應(yīng)部分 peptide reactive group 3.中間部分是平衡部分 balance group reporter group：質(zhì)量為114Da、115 Da、116 Da、117Da，因此iTRAQ試劑共四種； peptide reactive group：將reporter group與肽N端及賴氨酸側(cè)鏈連接，幾乎可以標(biāo)記樣本中所有蛋白質(zhì)； balance group：質(zhì)量為31 Da、30 Da、29 Da、28 Da，使得四種iTRAQ試劑分子量均為145 Da，保證iTRAQ標(biāo)記的同一肽段m/z相同。,iTRAQ 試劑結(jié)構(gòu),iTRAQ 試劑

12、標(biāo)記原理,4個(gè)來源不同的相同蛋白樣品在一級質(zhì)譜上表現(xiàn)相同;Balance group在二級質(zhì)譜發(fā)生中性丟失;Reporter group 在二級質(zhì)譜產(chǎn)生個(gè)報(bào)告離子，分別是114、115、116和117;通過分析報(bào)告離子的峰強(qiáng)度比值就可以分析同一個(gè)蛋白在不同樣品間的表達(dá)量比值.,操作流程,儀器,TripleTOFTM5600+系統(tǒng)是快速評估藥物代謝穩(wěn)定性、藥物在體內(nèi)特征和最終代謝產(chǎn)物鑒定的理想平臺。在最快采集速度條件下，用高分辨和準(zhǔn)確質(zhì)量質(zhì)譜數(shù)據(jù)，完成無與倫比的蛋白質(zhì)定性鑒定工作。,技術(shù)特點(diǎn),定量精確：每組平行比較多達(dá)8個(gè)樣本，標(biāo)記效率高達(dá)97%，可減少樣本處理、以及不同組上機(jī)造成的實(shí)驗(yàn)誤差。

13、高效率樣品分離：進(jìn)行SCX-HPLC分離，實(shí)現(xiàn)自動化操作。 高鑒定率：系統(tǒng)全面地研究組織或細(xì)胞中盡可能多的蛋白質(zhì)，可鑒定多達(dá)6000種蛋白。 適用范圍廣：無物種特異性限制，理論上可用于所有物種。iTRAQ技術(shù)不僅可發(fā)現(xiàn)胞漿蛋白，還有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白。 儀器性能優(yōu)良：基于高分辨率（大于105）、高質(zhì)量精度（小于1ppm）質(zhì)譜平臺，可獲得更加準(zhǔn)確的結(jié)果。iTRAQ技術(shù)可檢測出低豐度蛋白、強(qiáng)堿性蛋白、小于10KD或大于200KD的蛋白。,熒光差異凝膠電泳,原理 在二維電泳的基礎(chǔ)上進(jìn)行熒光標(biāo)記 特點(diǎn) DIGE熒光差異蛋白表達(dá)分析系統(tǒng)在傳統(tǒng)雙向電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合了多重?zé)晒夥治龅姆椒?，在同一塊膠上共同分離多個(gè)分別由不同熒光標(biāo)記的樣品，并第一次引入了內(nèi)標(biāo)的概念，極大地提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性，可靠性和重復(fù)性。在DIGE技術(shù)中，每個(gè)蛋白點(diǎn)都有它自己的內(nèi)標(biāo)，并且軟件全自動根據(jù)每個(gè)蛋白點(diǎn)的內(nèi)標(biāo)對其表達(dá)量進(jìn)行校準(zhǔn)，保證所檢測到的蛋白豐度變化是真實(shí)的。DIGE技術(shù)可檢測到樣品間小于10%的蛋白表達(dá)差異，統(tǒng)計(jì)學(xué)可信度達(dá)到95%以上。,實(shí)驗(yàn)流程,儀器 熒光差異凝膠電泳系統(tǒng)Ettan DIGE 2D 試劑 1.樣品標(biāo)記 （1）染料 Cy2,Cy3,Cy5 與蛋白的賴氨酸的epsilon-氨基反應(yīng)，產(chǎn)生三種帶正電荷的熒光基團(tuán)，在不同波長光激發(fā)下產(chǎn)生熒光。,2.一相等點(diǎn)聚焦 （2）IPG膠條水化