高級(jí)生物化學(xué)課件蛋白質(zhì)加工與輸送

1、1,蛋白質(zhì)合成后加工與輸送,第2章,2,3,翻譯后加工 （Posttranslational processing）,肽鏈從核蛋白體釋放后，經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)各種修飾處理，成為有活性的具有天然構(gòu)象的成熟蛋白質(zhì)的過程。,4,包括：,折疊； 一級(jí)結(jié)構(gòu)的修飾； 空間結(jié)構(gòu)的修飾等； 靶向輸送到特定細(xì)胞,5,一、多肽鏈折疊為天然構(gòu)象的蛋白質(zhì) 多肽鏈合成后需要逐步折疊（folding)成天然空間構(gòu)象(native conformation)才成為有功能的蛋白質(zhì)。 一些疾病是單純由錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)引發(fā)的 蛋白質(zhì)構(gòu)象病。 時(shí)間：新生肽鏈的折疊在肽鏈合成中、合成后完成， 新生肽鏈N端在核蛋白體上一出現(xiàn)，肽鏈的折 疊即開

2、始。,6,Anfinsen經(jīng)典實(shí)驗(yàn)（20世紀(jì)60年代）,牛胰核糖核酸酶含有124個(gè)氨基酸殘基，由8個(gè)巰基配對(duì)組成4對(duì)二硫鍵?？梢杂?jì)算出酶分子中8個(gè)巰基組成4對(duì)二硫鍵的可能方式有105種，在溫和的堿性條件下，8摩爾的濃脲和大量巰基乙醇能使四對(duì)二硫鍵完全還原，整個(gè)分子變?yōu)闊o規(guī)則卷曲狀，酶分子變性。透析去除脲，在氧的存在下，二硫鍵重新形成，酶分子完全復(fù)性，二硫鍵中成對(duì)的巰基都與天然一樣，復(fù)性分子可以結(jié)晶且具有與天然酶晶體相同的X射線衍射花樣，從而證實(shí)，酶分子在復(fù)性過程中，不僅能自發(fā)地重新折疊，而且只選擇了105種二硫鍵可能配對(duì)方式中的一種。,7,Anfinsen經(jīng)典實(shí)驗(yàn) Anfinsen基于還原變性

3、的牛胰RNase在不需其他任何物質(zhì)幫助下，僅通過去除變性劑和還原劑就使其恢復(fù)天然結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提出了“多肽鏈的氨基酸序列包含了形成其熱力學(xué)上穩(wěn)定的天然構(gòu)象所必需的全部信息”的“自組裝學(xué)說”。 這一學(xué)說表明：蛋白質(zhì)折疊的必需信息都儲(chǔ)存在一級(jí)結(jié)構(gòu)中。即“序列決定構(gòu)象”。 隨著對(duì)蛋白質(zhì)折疊研究的廣泛開展，人們對(duì)蛋白質(zhì)折疊理論有了進(jìn)一步的補(bǔ)充和擴(kuò)展。Anfinsen的“自組裝熱力學(xué)假說”得到了許多體外實(shí)驗(yàn)的證明，的確有許多蛋白在體外可進(jìn)行可逆的變性和復(fù)性，尤其是一些小分子量的蛋白。但是并非所有的蛋白都如此。,8,有些蛋白質(zhì)移除前導(dǎo)序列會(huì)伴隨著之后的蛋白質(zhì)重折疊的缺失。相反的，全長(zhǎng)酶原解折疊后可以重新

4、產(chǎn)生一個(gè)折疊的酶。這個(gè)結(jié)果表明前導(dǎo)序列參與了折疊反應(yīng)，這說明并不是“最終的”序列編碼了折疊信息。,9,細(xì)胞中大多數(shù)天然蛋白質(zhì)折疊都不是自動(dòng)完成，而需要其他酶、蛋白質(zhì)輔助. 所有細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的伴侶蛋白都是聚體體系，它阻止了不正確的蛋白質(zhì)的折疊，以7個(gè)、8個(gè)或9個(gè)亞基的超環(huán)形結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)。超環(huán)形結(jié)構(gòu)被任意端蓋住，形成一個(gè)通過疏水表面結(jié)合解折疊多肽的空穴，通過ATP驅(qū)動(dòng)的構(gòu)象變化促使肽折疊為天然構(gòu)象。 不正確的折疊導(dǎo)致活性失活，這是許多疾病的分子基礎(chǔ)。,10,（一）肽鏈折疊的模型,框架模型 （Framework Model） 假設(shè)蛋白質(zhì)的局部構(gòu)象依賴于局部的氨基酸序列。在多肽鏈折疊過程的起始階段，先迅速

5、形成不穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元； 稱為“flickering cluster”，隨后這些二級(jí)結(jié)構(gòu)靠近接觸，從而形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)框架；最后，二級(jí)結(jié)構(gòu)框架相互拼接，肽鏈逐漸緊縮，形成了蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。 這個(gè)模型認(rèn)為即使是一個(gè)小分子的蛋白也可以一部分一部分的進(jìn)行折疊，其間形成的亞結(jié)構(gòu)域是折疊中間體的重要結(jié)構(gòu),11,2.疏水塌縮模型 （Hydrophobic Collapse Model） 疏水作用力被認(rèn)為是在蛋白質(zhì)折疊過程中起決定性作用的力的因素。在形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)之前首先發(fā)生很快的非特異性的疏水塌縮。,12,3.擴(kuò)散-碰撞-粘合機(jī)制 （Diffusion-Collision-Adhesio

6、n Model） 該模型認(rèn)為蛋白質(zhì)的折疊起始于伸展肽鏈上的幾個(gè)位點(diǎn)，在這些位點(diǎn)上生成不穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元或者疏水簇，主要依靠局部序列的進(jìn)程或中程（3-4個(gè)殘基）相互作用來維系。它們以非特異性布朗運(yùn)動(dòng)的方式擴(kuò)散、碰撞、相互黏附，導(dǎo)致大的結(jié)構(gòu)生成并因此而增加了穩(wěn)定性。進(jìn)一步的碰撞形成具有疏水核心和二級(jí)結(jié)構(gòu)的類熔球態(tài)中間體的球狀結(jié)構(gòu)。球形中間體調(diào)整為致密的、無活性的類似天然結(jié)構(gòu)的高度有序熔球態(tài)結(jié)構(gòu)。最后無活性的高度有序熔球態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橥暾挠谢盍Φ奶烊粦B(tài)。,13,4.成核-凝聚-生長(zhǎng)模型 （Nuclear-Condensation-Growth Model） 根據(jù)這種模型，肽鏈中的某一區(qū)域可以形成“折疊

7、晶核”，以它們?yōu)楹诵?，整個(gè)肽鏈繼續(xù)折疊進(jìn)而獲得天然構(gòu)象。 所謂“晶核”實(shí)際上是由一些特殊的氨基酸殘基形成的類似于天然態(tài)相互作用的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這些殘基間不是以非特異的疏水作用維系的，而是由特異的相互作用使這些殘基形成了緊密堆積。晶核的形成是折疊起始階段限速步驟。,14,（二）折疊過程中的輔助蛋白質(zhì)： 分子伴侶（molecular chaperon） 蛋白二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomerase,PDI） 肽?；?脯氨酰順反異構(gòu)酶（peptidyl prolyl cis-trans isomerase, PPI）,15,1分子伴侶*（molecular chaperon）

8、 是細(xì)胞中一大類保守蛋白質(zhì)，可識(shí)別肽鏈的非天 然構(gòu)象（不穩(wěn)定構(gòu)象），促進(jìn)各功能域和整體蛋白質(zhì)的 正確折疊（穩(wěn)定構(gòu)象）。 普遍特點(diǎn)-只與Pr分子的非天然構(gòu)象結(jié)合，而不與已經(jīng)折疊 成天然構(gòu)象的Pr分子結(jié)合,16,（1）功能 幫助肽鏈折疊； 輔助新生肽鏈的轉(zhuǎn)運(yùn)與轉(zhuǎn)位，幫助“次品蛋白質(zhì)” 的降解。 一些細(xì)胞質(zhì)中的可溶性分子伴侶還可以通過與輔助分子伴侶 的相互作用，行使更多的功能：網(wǎng)格蛋白的去組裝；參與突觸小泡融合后的內(nèi)吞；幫助蛋白質(zhì)/新生肽鏈靶向，如進(jìn)入線粒體；以及一些復(fù)合物的組裝，如肌球蛋白復(fù)合物和核孔等； 分子伴侶還參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。另外，引發(fā)因子(TF)除了能幫助新生肽鏈折疊外，還兼有PPI酶的活性

9、。,17,（2）折疊作用： 蛋白質(zhì)肽鏈的折疊可以簡(jiǎn)單看作是一些疏水基團(tuán)被包埋到分子內(nèi)部的過程，因此，幫助新生肽鏈折疊的分子伴侶一定是具有與疏水基團(tuán)結(jié)合能力的蛋白質(zhì)。以最常見的hsp70為例，它們都具有一個(gè)肽結(jié)合部位，由疏水氨基酸殘基構(gòu)成。分子伴侶總的作用是與暴露的疏水區(qū)域穩(wěn)定結(jié)合。 結(jié)果： 降低了局部未折疊蛋白質(zhì)的濃度并防止其非特異性的不可逆的聚合和錯(cuò)誤折疊，同時(shí)保存了多肽鏈折疊的能力，當(dāng)折疊不成功時(shí)，可以重新進(jìn)行折疊。,18,（3）分布： 廣泛分布于原核和真核細(xì)胞中。 在真核細(xì)胞中目前發(fā)現(xiàn)它們存在于： 細(xì)胞液、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、葉綠體以及細(xì)胞核中。 （存在胞內(nèi)pr折疊、組裝的各部位）,19,（

10、4）典型分子伴侶 細(xì)胞至少有兩種分子伴侶家族 熱休克蛋白 伴侶素,20,(1)熱休克蛋白（heat shock protein, HSP )： 屬于應(yīng)激反應(yīng)性蛋白，高溫應(yīng)激可誘導(dǎo)該蛋白合成增加。 包括HSP70, HSP40和GrpE三族 HSP促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊的基本作用： 結(jié)合保護(hù)待折疊多肽片段，再釋放該片段進(jìn)行折疊，形成HSP70和多肽片段依次結(jié)合、解離的循環(huán)。,21,HSP70： 一類約70kD的高度保守的ATP酶，廣泛存在原、真核細(xì)胞中。 由兩個(gè)功能不同的結(jié)構(gòu)域組成： N端的ATP酶結(jié)構(gòu)域和C端的多肽鏈結(jié)合結(jié)構(gòu)域。 ATP酶結(jié)構(gòu)域：能結(jié)合和水解ATP. 多肽鏈結(jié)合結(jié)構(gòu)域：可識(shí)別由4-5個(gè)

11、疏水AA殘基為核心組成的7肽片段。,22,-ATP,Hsp40,ADP,CrpE,23,機(jī)制： 結(jié)合待折疊多肽片段，產(chǎn)生HSP40-HSP70-ADP-多肽復(fù)合物，避免錯(cuò)誤折疊 釋出多肽片段，進(jìn)行正確折疊。,24,(2）伴侶素（chaperonins )： 是分子伴侶的另一家族 如E.coli的GroEL和GroES 真核細(xì)胞中同源物為HSP60和HSP10 等家族。 主要作用 是為非自發(fā)性折疊蛋白質(zhì)提供能折疊形成 天然空間構(gòu)象的微環(huán)境。,25,26,27,伴侶素GroEL/GroES系統(tǒng)促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊過程,28,2蛋白二硫鍵異構(gòu)酶 （protein disulfide isomerase,

12、PDI） 多肽鏈內(nèi)或肽鏈之間二硫鍵的正確形成對(duì)穩(wěn)定分泌蛋白、膜蛋白等的天然構(gòu)象十分重要 部位：主要在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行。 原因：多肽鏈的幾個(gè)半胱氨酸間可能出現(xiàn)錯(cuò)配二硫鍵，影響蛋白質(zhì)正確折疊。 解決：在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔活性很高 可在較大區(qū)段肽鏈中催化錯(cuò)配二硫鍵斷裂并 形成正確二硫鍵連接。,29,PDI是一種含有巰基的酶，能隨機(jī)切斷及催化蛋白質(zhì)中的二硫鍵，使之正確重排，形成熱力學(xué)上最穩(wěn)定的構(gòu)象。 PDI通過催化巰基與二硫鍵的交換反應(yīng)，從而催化蛋白質(zhì)二硫鍵的形成、還原（斷裂）或重排（異構(gòu)化）。,30,并不是所有的蛋白質(zhì)都含有二硫鍵，特別是在細(xì)胞內(nèi)的多數(shù)蛋白質(zhì)是不含有二硫鍵的，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)的環(huán)境是個(gè)還原性的環(huán)境。

13、近年來的研究表明，蛋白二硫鍵異構(gòu)酶也參與了對(duì)蛋白質(zhì)功能的調(diào)節(jié)。,31,3.肽?；桓滨ｍ樂串悩?gòu)酶，（peptidyl prolyl cis-trans isomerase, PPI） 脯氨酸為亞氨基酸，多肽鏈中肽酰一脯氨酸間形成的肽鍵有順反兩種異構(gòu)體，空間構(gòu)象差別明顯。PPI可促進(jìn)上述順反兩種異構(gòu)體之間的轉(zhuǎn)換。 天然蛋白肽鏈中肽酰一脯氨酸間肽鍵絕大部分是反式構(gòu)型，僅6為順式構(gòu)型。 在肽鏈合成需形成順式構(gòu)型時(shí)，PPI可使多肽在各脯氨酸彎折處形成準(zhǔn)確折疊。,32,二、一級(jí)結(jié)構(gòu)的修飾,場(chǎng)所：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體的管腔中（外分泌蛋白前體的活化） （一）去除N-甲?；騈-甲硫氨酸 酶：脫甲?；福?/p>

14、基肽酶 結(jié)果：切除N-甲酰基 切除N-末端Met或N-末端一段AA,33,蜂毒毒蛋白的加工成熟 蜂毒蛋白只有經(jīng)蛋白酶水解切除N端的22個(gè)氨基酸以后才有生物活性。,34,（二）個(gè)別氨基酸的修飾 1.氨基末端乙?；?2.甲基化 3.氧化（-SH -S-S-） 4.羧基末端的酰胺化 5.谷氨酸殘基的羧基修飾 6. Pro, Lys OH 7. Ser, Thr, Tyr 磷酸化,35,1.氨基末端乙?；?十分普遍，估計(jì)體內(nèi)50%的蛋白質(zhì)有氨基乙?；?在N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的催化下將多肽鏈的氨基末端（或氨 基酸殘基側(cè)鏈氨基）乙?；?。 有兩組乙酰轉(zhuǎn)移酶：分泌蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和非分泌蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶，都以乙酰Co

15、A為底物。 近年發(fā)現(xiàn)組蛋白的乙?；诨罨旧|(zhì)，使它作為轉(zhuǎn)錄及復(fù)制的模板中起重要作用。,36,核小體中四種組蛋白各兩分子構(gòu)成的八聚體即核心組蛋白。 （多富含Lys殘基） 它們的側(cè)鏈氨基是乙?；奈稽c(diǎn)。,37,2.甲基化 酶:甲基轉(zhuǎn)移酶.存在:胞液(主要);細(xì)胞核(少量) 底物：S-腺苷蛋氨酸(SAM, 是Met活化產(chǎn)物），SAM的甲基被高度活化，稱為活性蛋氨酸，是體內(nèi)最重要的甲基直接供給體 甲基化位點(diǎn)：Lys,Arg, His的側(cè)鏈；Gln的N-甲基化和Glu, Asp的O-甲基化.,38,39,3.氧化 蛋白質(zhì)多肽鏈中進(jìn)行氧化修飾最普遍現(xiàn)象是- 二硫鍵的生成。 酶：二硫鍵異構(gòu)酶 作用：肽鏈內(nèi)

16、或鏈間的Cys巰基氧化成二硫巰基。,40,4.羧基末端的酰胺化 肽鏈羧基末端的AA可出現(xiàn)酰胺化，如C端是Gly的蛋白 質(zhì)常被酰胺化，保護(hù)它免受羧肽酶的降解。 酰胺化分兩步： 1）Gly羥基化； 2）脫去一分子乙醛酸并產(chǎn)生新的酰胺化的羧端。 結(jié)果：缺失了原來作為羧基端的Gly.,41,5.谷氨酸殘基的羧基修飾 凝血酶原及其他涉及與鈣離子相互作用的凝血因子如，和中均發(fā)現(xiàn)有羧基化修飾的羧化谷氨酸殘基（Glu殘基）。 部位：內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 過程：在Glu殘基的碳原子上添加羧基 結(jié)果：Glu的碳原子上有兩個(gè)羧基 作用：能螯合鈣離子，在凝血過程中起重要作用。,羧化酶,42,6.脯氨酸和賴氨酸的羥基化修飾 前膠原是

17、成纖維細(xì)胞分泌的pr，在生物合成過程中新生的肽 鏈進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的脯氨酰-4-羥化酶和賴氨酰羥化 酶能分別識(shí)別肽鏈中的GlyXPro和GlyXLys序列，羥化Pro及Lys 殘基。 產(chǎn)物：4-羥基脯氨酸（Hyp)及 羥基賴氨酸（Hyl)殘基。 原膠原分子中的Lys殘基可在賴氨酰氧化酶的催化下形成醛賴氨酸（aiiysine).,43,（三）水解修飾 無活性的蛋白質(zhì)前體活性的蛋白質(zhì)或多肽 如胰島素的成熟 真核細(xì)胞大分子多肽前體數(shù)種小分子活性肽類,如鴉片促黑皮質(zhì)素原(POMC)的水解修飾,44,45,鴉片促黑皮質(zhì)素原(POMC)的水解修飾,46,三、空間結(jié)構(gòu)的修飾 （一） 亞基聚合 具有四

18、級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)由兩條以上肽鏈通過非共價(jià)鍵聚合，形成寡聚體。如：血紅蛋白22,47,（二） 輔基連接 結(jié)合蛋白中非蛋白質(zhì)部分（輔基）通過共價(jià)鍵方式與蛋白質(zhì)部分相連。 各種主要的結(jié)合蛋白（如糖蛋白、脂蛋白等），合成后都需要結(jié)合相應(yīng)輔基，成為天然功能蛋白質(zhì),48,（三）疏水脂鏈的共價(jià)連接 某些蛋白質(zhì)（如Ras蛋白、G蛋白等），翻譯后需要在肽鏈特定位點(diǎn)共價(jià)連接一個(gè)或多個(gè)疏水性強(qiáng)的脂鏈，包括脂肪酸鏈、多異戊二烯鏈等。 這些蛋白通過脂鏈嵌入 疏水膜脂雙層，定位成 為特殊質(zhì)膜內(nèi)在蛋白， 才成為具有生物功能的 蛋白質(zhì)。,49,四、 蛋白質(zhì)合成后的靶向輸送,蛋白質(zhì)合成后的去向： 1、保留在胞漿 2、進(jìn)入細(xì)胞核、

19、線粒體等細(xì)胞器 3、分泌到體液，再輸送到靶器官、靶細(xì)胞 靶向輸送*（protein targeting)： 蛋白質(zhì)合成后經(jīng)過復(fù)雜機(jī)制，定向到達(dá)其執(zhí) 行功能的目標(biāo)地點(diǎn). 蛋白質(zhì)的修飾反應(yīng)與靶向輸送過程同步完成,50,蛋白質(zhì)的分類- 結(jié)構(gòu)蛋白（structural protein)或固有蛋白（house keeping protein):合成后留在細(xì)胞內(nèi)，如： 酶、細(xì)胞骨架、亞細(xì)胞器如線粒體、過氧化體、細(xì)胞核等 分泌蛋白（輸出蛋白，export protein): 合成后輸出細(xì)胞進(jìn)入血液和細(xì)胞間液，如： 肝細(xì)胞制造的血漿清蛋白、凝血酶原、胰腺細(xì)胞合成的各種消化酶、胰島素，免疫細(xì)胞合成的免疫球蛋白等

20、。,51,所有靶向輸送的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中存在分選信號(hào)- 主要為N末端特異氨基酸序列 可引導(dǎo)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞的適當(dāng)靶部位， 這類序列稱為信號(hào)序列*（signal sequence) . 這提示指導(dǎo)蛋白質(zhì)靶向輸送的信息存在于它的一級(jí)結(jié) 構(gòu)中。 靶向不同的蛋白質(zhì)各有特異的信號(hào)序列或成分.,52,(一）與分泌蛋白的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的組分 1.信號(hào)肽*（signal peptide） 未成熟蛋白質(zhì)的端序列，可被細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)識(shí)別 的特征性氨基酸序列。 存在：所有分泌pr、部分膜pr、溶酶體pr的N端共 同序列。 結(jié)構(gòu)：一般含15-30個(gè)AA殘基。 N端或接近N端為親水區(qū)、帶正電，長(zhǎng)度常為 1-7個(gè)AA(親水極性

21、,如Arg, Ser, Thr, Lys）； 疏水核心區(qū)含疏水中性AA C端-加工區(qū)（含極性、小側(cè)鏈的AA；信號(hào)肽 酶裂解的部位）,53,緊接親水區(qū)為疏水核心（hydrophobic core)，在分泌時(shí)起決定作用。該區(qū)段由15-19個(gè)AA殘基組成，并以Gly或Ala等側(cè)鏈較短的AA結(jié)尾。此結(jié)尾的AA恰好在切點(diǎn)之前。 疏水區(qū)中央常含Pro或Gly殘基，由此將疏水區(qū)分成2個(gè)區(qū)。這2個(gè)螺旋如被破壞，會(huì)抑制pr的分泌。,54,信號(hào)肽的一級(jí)結(jié)構(gòu),55,未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽有保守序列；信號(hào)肽似乎沒有嚴(yán)格的 專一性： 如將信號(hào)肽附加到正常存在細(xì)胞液中的球狀蛋白 的N端，導(dǎo)致該球蛋白分泌到細(xì)胞外。,56,2.信號(hào)識(shí)

22、別顆粒（signal recognition particle,SRP）,存在細(xì)胞溶質(zhì)中，6條多肽鏈和一分子7S RNA共同構(gòu)成，RNA構(gòu)成核蛋白的骨架，6條多肽鏈各自形成獨(dú)立功能的結(jié)構(gòu)。 54kD亞基：識(shí)別信號(hào)肽； 9kD和14kD亞基二聚體：抑制分泌肽延長(zhǎng)，使核蛋白體翻譯停止，同時(shí)避免長(zhǎng)肽鏈折疊； 68kD和72kD亞基二聚體：對(duì)SRP核蛋白體復(fù)合體的移位和識(shí)別SRP受體是必需的。,57,SRP作用： 1.識(shí)別、結(jié)合信號(hào)肽； 2.將核蛋白體復(fù)合體引導(dǎo)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上并與受體結(jié)合； 3.暫時(shí)抑制肽鏈延長(zhǎng)，避免長(zhǎng)肽鏈折疊。,58,SRP抑制肽鏈延長(zhǎng)，是由于SRP占據(jù)了核蛋白體的A位點(diǎn)，阻止了攜帶A

23、A的tRNA進(jìn)入核蛋白體，即切斷了pr合成原料的進(jìn)入。 SRP在分泌pr的轉(zhuǎn)運(yùn)過程只起短暫作用，但可循環(huán)利用，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)濃度很高，為核蛋白體的1/10。,59,3.對(duì)接蛋白（docking protein，） -(SRP受體） 存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，由（GTP酶活性）和兩個(gè)亞基組成。 作用： 引導(dǎo)SRP和新生肽鏈的復(fù)合物能正確地結(jié)合到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上； 一旦SRP和新生肽鏈的復(fù)合物結(jié)合到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，就促使SRP與其受體以及新生肽鏈和核糖體解離，成為游離的SRP，參與新的一輪SRP的循環(huán)。,60,ER膜上的轉(zhuǎn)位器(translocon) 包括了早前認(rèn)為的核蛋白體受體等： 新生肽鏈跨膜的蛋白通道,61,（二）分

24、泌蛋白的靶向輸送過程,合成肽鏈先由信號(hào)序列引導(dǎo)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng) （endoplasmic reticulum, ER)， 蛋白質(zhì)再分別被包裝進(jìn)分泌小泡轉(zhuǎn)移、融合 到其他部位或分泌出細(xì)胞。 （1）信號(hào)肽被識(shí)別（2）核蛋白體轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（3）分泌肽進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔,62,具體過程： 胞液游離核蛋白體上以mRNA為模板，合成出N端包括信號(hào)肽的最初約70個(gè)氨基酸殘基。 SRP結(jié)合新生肽鏈N端的信號(hào)肽，多肽合成暫停，通過雙重結(jié)合（SRP與其受體的結(jié)合；帶有新生肽鏈的核糖體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的結(jié)合），確保新生肽鏈正確無誤地附著并進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。 當(dāng)核糖體與轉(zhuǎn)位器正確對(duì)位接觸后，可導(dǎo)致轉(zhuǎn)位器的中央通道與核糖體大亞基的中央通道

25、對(duì)齊，延伸中的新生肽鏈就能進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在平時(shí)轉(zhuǎn)位器是關(guān)閉的，只是在新生肽鏈進(jìn)入的瞬間是開放的。信號(hào)肽是引起轉(zhuǎn)位器開放的觸發(fā)因素。 信號(hào)肽將新生肽鏈引導(dǎo)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)后，在信號(hào)肽酶復(fù)合物作用下，切除。折疊，形成有空間構(gòu)象的蛋白質(zhì)，有的還需要運(yùn)送到高爾基體等處進(jìn)行進(jìn)一步的加工修飾，才能成為有特定結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)，并被定位到機(jī)體中的特定部位行使其功能。,63,64,（三）線粒體蛋白的靶向輸送 90以上線粒體蛋白前體在胞液合成后輸入線粒體 其中：大部分定位基質(zhì)N端都有相應(yīng) 其他定位內(nèi)、外膜或膜間隙信號(hào)序列 如：線粒體基質(zhì)蛋白前體的N端有保守的2035殘基 信號(hào)序列，稱為導(dǎo)肽，富含絲、蘇及堿性殘基。,

26、65,線粒體基質(zhì)蛋白靶向輸送過程如下： 胞液新合成的線粒體蛋白與分子伴侶HSP70或線粒體 輸入刺激因子（MSF)結(jié)合，以穩(wěn)定的未折疊形式轉(zhuǎn)運(yùn) 到線粒體。 蛋白質(zhì)先通過信號(hào)序列識(shí)別、結(jié)合線粒體外膜的受體復(fù)合物。 再轉(zhuǎn)運(yùn)、穿過由線粒體外膜轉(zhuǎn)運(yùn)體（Tom）和內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)體(Tim）共同組成的跨內(nèi)、外膜蛋白通道。以未折疊形式進(jìn)入線粒體基質(zhì)?；|(zhì)HSP70水解ATP釋能及利用跨內(nèi)膜電化學(xué)梯度，為肽鏈進(jìn)入線粒體提供動(dòng)力。 蛋白質(zhì)前體信號(hào)序列被蛋白酶切除，在上述的分子伴侶作用下折疊成有功能的蛋白質(zhì),66,67,（四）細(xì)胞核蛋白的靶向輸送 多種細(xì)胞核蛋白在胞液合成后輸入核內(nèi)， 各種大分子及核內(nèi)組裝的核蛋白體亞基

27、都是通過核孔 進(jìn)出核膜。 核定位序列（nuclear localization sequence, NLS ) 所有靶向輸送的胞核蛋白多肽鏈內(nèi)含有的特異信號(hào)序列 結(jié)構(gòu)：為48殘基的短序列， 富含帶正電的賴、精氨酸及脯氨酸 肽鏈中位置：不只在N末端，可位于肽鏈不同部位。 特點(diǎn)：NLS在蛋白質(zhì)進(jìn)核定位后不被切除。 不同NLS間未發(fā)現(xiàn)共有序列。,68,新合成胞核蛋白靶向輸送涉及幾種蛋白質(zhì)成分： 核輸入因子（nuclear importin) 和 異二聚體可作為胞核蛋白受體， 識(shí)別結(jié)合NLS序列。 Ran蛋白(一種小GTP酶)：Ran-GDP幫助輸入蛋白入核，而Ran-GTP則是介導(dǎo)空載的輸入蛋白亞基

28、出核。,69,70,蛋白質(zhì)分子在細(xì)胞內(nèi)的降解,細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)處于不斷更新過程，基本上處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡：不斷被合成，不斷被降解。,71,一、與蛋白質(zhì)降解相關(guān)的末端和內(nèi)部序列 細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，出于細(xì)胞活動(dòng)對(duì)特異蛋白質(zhì)的需要，各自都具有一定的壽命，長(zhǎng)短不一。 此外，細(xì)胞中受損蛋白、折疊或組裝錯(cuò)誤的蛋白都應(yīng)及時(shí)清除。,72,1.蛋白質(zhì)分子N-末端殘基影響蛋白質(zhì)的壽命。 （1）穩(wěn)定殘基（stabilizing residues)： Cys,Ala,Ser,Thr,Gly,Val,Met 30Hours （2）一級(jí)去穩(wěn)定殘基（primary destabilizing residues): Lys,Arg

29、,His;Phe,Leu,Ile,Tyr,Trp. 3min （3）二級(jí)去穩(wěn)定殘基（secondary destabilizing residues): Asp,Glu,Cys 。這些氨基酸可以被Arg-tRNA-蛋白轉(zhuǎn)移酶（R-transferase)識(shí)別，然后在末端加上一個(gè)Arg殘基。 （4）三級(jí)去穩(wěn)定殘基: Asn,Gln.可被一種N末端酰胺水解酶作用而變成Asp,Glu,之后再被Arg-tRNA-蛋白轉(zhuǎn)移酶（R-transferase)識(shí)別，然后在末端加上一個(gè)Arg殘基。,73,2.存在肽鏈內(nèi)部的一些保守序列: 如Arg-X-X-Leu-Gly-X-Ile-Gly-Asx 和Pro-G

30、lu-Ser-Thr(即PEST序列）,74,不依賴ATP和泛素； 利用溶酶體中的組織蛋白酶(cathepsin)降解外源性蛋白、膜蛋白和長(zhǎng)壽蛋白質(zhì)。,（一）蛋白質(zhì)在溶酶體通過ATP-非依賴途徑被降解,二、真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解有兩條重要途徑,（二）蛋白質(zhì)在蛋白酶體通過ATP-依賴途徑被降解,依賴ATP和泛素 降解異常蛋白和短壽蛋白質(zhì),75,溶酶體是蛋白質(zhì)降解的重要場(chǎng)所。細(xì)胞內(nèi)外的蛋白質(zhì)都可以通過不同的方式進(jìn)入溶酶體。 細(xì)胞外的蛋白質(zhì)，以及細(xì)胞質(zhì)膜上的受體蛋白質(zhì)，幾乎都是通過胞吞方式進(jìn)入溶酶體的。 細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)入溶酶體有非選擇性和選擇性兩種形式。前者又可分為自體吞噬和分泌自噬；后者則是由氨基酸殘基序列模體KFERQ介導(dǎo)的，但在營(yíng)養(yǎng)充足的細(xì)胞中，該途徑是關(guān)閉的。,（一）蛋白質(zhì)在溶酶體通過ATP-非依賴途徑被降解,76,2004年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予以色列科學(xué)家阿龍切哈諾沃、阿夫拉姆赫什科和美國(guó)科學(xué)家歐文羅斯，以表彰他們?cè)诜核卣{(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)降解研究領(lǐng)域中的卓越成就。,（二）蛋白質(zhì)在蛋