細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果準(zhǔn)確性的影響因素

1、.,細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果準(zhǔn)確性的 影響因素,.,一、試驗(yàn)誤差分析及改進(jìn)措施 鱟試劑質(zhì)量及靈敏度標(biāo)示值得的影響 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品效價及使用的影響 實(shí)驗(yàn)器皿的的影響 樣品成份及理化性質(zhì)的影響 實(shí)驗(yàn)員的影響 環(huán)境的影響,.,1 鱟試劑質(zhì)量及靈敏度標(biāo)示值得的影響 鱟試劑的質(zhì)量：抗干擾能力，穩(wěn)定性； 鱟試劑靈敏度標(biāo)示值的準(zhǔn)確性 。 鱟試劑靈敏度的誤差 是否用細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定？ 標(biāo)示值是否準(zhǔn)確？,.,2 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品引起的誤差 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品種類 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品效價誤差 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品操作誤差 細(xì)菌內(nèi)毒素單位表示誤差 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的錯誤使用,.,1） 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品種類 細(xì)菌內(nèi)毒

2、素國際標(biāo)準(zhǔn)品 細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品,.,2） 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品效價誤差 細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品與細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品之間或細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品與細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品之間的生物效價存在一定的誤差，用不同細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)核同一批鱟試劑靈敏度時可能存在一定的誤差。中國藥典要求“當(dāng)c在0.5-2(包括0.5和2)時，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度為該批鱟試劑的靈敏度?！痹囼?yàn)結(jié)果只要在這合格范圍內(nèi)表示鱟試劑標(biāo)示靈敏度準(zhǔn)確。,.,3） 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品操作誤差,取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)一支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，用75%酒精棉球擦拭后啟開，防止玻璃屑落

3、入瓶內(nèi)。,正確,（易折點(diǎn)）錯誤,.,注意：只能在安瓿的易折點(diǎn)上部開啟內(nèi)毒素，不能沿易折點(diǎn)開啟，防止振蕩過程中內(nèi)毒素粘在封口膜上。 只能取1ml的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品。 若使用的為細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品，可按其使用說明書中的方法將其稀釋至規(guī)定濃度后分裝保存。若為細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，為一次性使用。,.,4） 錯誤使用 有部分客戶使用廠家生產(chǎn)的細(xì)菌內(nèi)毒素來復(fù)核鱟試劑的靈敏度，這是一種錯誤行為，更有甚者使用廠家生產(chǎn)的細(xì)菌內(nèi)毒素來交叉復(fù)核鱟試劑的靈敏度，這是一種嚴(yán)重錯誤行為。,.,3 實(shí)驗(yàn)器皿的影響 器皿的計(jì)量管理（校正） 器皿的選擇標(biāo)準(zhǔn) 器皿的正確處理,.,1） 器皿的選擇標(biāo)準(zhǔn)

4、鱟試驗(yàn)對器皿的要求：刻度準(zhǔn)確；內(nèi)表面光滑；易于清理。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查實(shí)驗(yàn)不宜選用注射器，最好使用經(jīng)過校正的刻度玻璃吸管或吸嘴。注射器刻度不精確，內(nèi)壁磨沙面吸附內(nèi)毒素，而且要特別注意注射器針頭引入的鐵離子對試驗(yàn)結(jié)果的干擾，故不宜選用注射器。,.,如果用量不大，使用頻率不高，建議大家選用本公司提供的一次性耗材。無熱原耗材是一種在此行業(yè)中被鑒定為無內(nèi)毒素和-葡聚糖污染的產(chǎn)品，其中包括, 無熱原試管、無熱原移液器吸頭。這些產(chǎn)品可以給您的工作帶來很大方便,另外，當(dāng)實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)誤差時可首先排除器皿方面的因素,很快分析判斷出誤差原因。,.,2） 器皿的正確處理 2005年版中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范278頁細(xì)菌內(nèi)毒

5、素檢查法“實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備”規(guī)定：“將被洗滌的玻璃器皿用洗滌劑和自來水洗凈并烘干水分后，置洗液中浸泡4小時，取出將洗液瀝干，用自來水將殘余的洗液洗凈，再用蒸,.,餾水沖洗干燥后置適宜的密閉金屬容器中，迅速置烤箱中，除去玻璃器皿表面可能存在的外源性內(nèi)毒素?！?應(yīng)該特別注意，該規(guī)程明確規(guī)定最后沖洗玻璃器皿必須“用蒸餾水沖洗，禁用純化水沖洗。”有的客戶使用反滲透制備的純化水沖洗試驗(yàn)用玻璃器皿，結(jié)果試驗(yàn)中所有的陽性對,.,照都為陰性，復(fù)核鱟試劑靈敏度時試驗(yàn)結(jié)果誤差較大，這主要是由于純化水和蒸餾水的質(zhì)量不同所造成的。因純化水中存在的陰陽離子經(jīng)250高溫干烤不能完全被破壞，這時不同的離子就產(chǎn)生對鱟試劑酶反應(yīng)抑制或

6、增強(qiáng)的反應(yīng)，為了保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和檢驗(yàn)報告的權(quán)威性，我們應(yīng)該嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，用多效蒸餾水沖洗鱟試驗(yàn)用玻璃器皿。,.,4 樣品成份及理化性質(zhì)的影響 -葡聚糖樣物質(zhì)的影響 PH值的影響 金屬離子和弱酸陰離子的影響 藥物濃度的影響,.,1） -葡聚糖樣物質(zhì)的影響 常見現(xiàn)象：假陽性。 鱟試劑的特異性系指在藥品、生物制品和血液制品中鱟試劑能準(zhǔn)確測出被測物質(zhì)內(nèi)毒素的能力，既不能造成樣品內(nèi)毒素的漏檢，也不能將其它物質(zhì)錯判為內(nèi)毒素。,.,目前我公司研究證明，已知能與鱟試劑發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)有細(xì)菌內(nèi)毒素和-葡聚糖，而內(nèi)毒素反應(yīng)曲線為S型特征曲線，-葡聚糖反應(yīng)曲線為經(jīng)過0點(diǎn)的斜線。鱟試劑的特異性差的另一種表現(xiàn)，

7、是將其它物質(zhì)（如-葡聚糖）判定為內(nèi)毒素，錯誤將合格藥品判為不合格，造成制藥廠直接經(jīng)濟(jì)損失。,.,鱟試劑反應(yīng)機(jī)理圖,.,判斷假陽性的方法： 1、特異性鱟試劑法； 2、定量反應(yīng)曲線分析法； 3、家兔模擬試驗(yàn)法。,.,2） PH值對反應(yīng)速度的影響 常見現(xiàn)象：樣品陽性不成立。 鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)的最適宜pH在6.5-8.0；pH 3 或10時，酶活性受到抑制。,相對活力,PH,7.0,.,PH對反應(yīng)速度的影響: 影響酶原的激活； 影響酶分子的構(gòu)象，過高過低的PH會改變酶的活性中心的構(gòu)象，或甚至改變整個酶分子的機(jī)構(gòu)使其變性失活。,.,故鱟試驗(yàn)時，供試品 pH 最好應(yīng)預(yù)調(diào)和6.5-8.0 為好，必要時可用

8、無內(nèi)毒素的 HCl 或NaOH 稀溶液調(diào)節(jié) pH 值。美國、日本藥局方以及中國藥典故2005版規(guī)定檢品必須調(diào)節(jié)PH值6.0-8.0。,.,3） 金屬離子和弱酸陰離子 離子對細(xì)菌內(nèi)毒素測定結(jié)果影響較大，一方面陽離子如Fe3+、Al3+強(qiáng)度較大會引起內(nèi)毒素的聚集造成內(nèi)毒素局部濃度過高，同時還必須注意高價陽離子（如Fe3+）的氧化性對鱟試劑酶反應(yīng)具有強(qiáng)抑制作用；重金屬離子如Ag+、Cu2+、Pb2+可以使蛋白質(zhì)變性而使酶失活；另一方面鱟試劑必須在二價陽離子Ca2+、Mg2+的參與下才能被激活形成凝膠反應(yīng)。許多藥物因PH值10時，其中的陰離子會吸收鱟試劑中的Ca2+、Mg2+離子，使實(shí)驗(yàn)呈假陰性。,.

9、,4） 藥物濃度 1、10%葡萄糖注射液 2、白蛋白、小牛血清 3、醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉 4、中藥類注射液,.,5 實(shí)驗(yàn)員的影響 操作時嚴(yán)格按操作規(guī)程進(jìn)行，安瓿開啟前應(yīng)先用酒精棉球擦拭曲頸部，用將頸部折斷，防止碎玻屑掉入安瓿內(nèi)。在鱟試劑的溶解、樣品的稀釋及加樣時，取樣均應(yīng)準(zhǔn)確。如果一人獨(dú)立完成試驗(yàn)，可先稀釋配制好內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，然后開啟復(fù)溶鱟試劑，最后加樣，盡可能縮短鱟試劑溶液暴露在空氣中的時間（最好控制在15分鐘內(nèi)）。,.,6、環(huán)境的影響 保溫時間 保溫溫度 1）保溫溫度 將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成2，進(jìn)行鱟試驗(yàn)，然后分別放置于25、28、31、34、37、41、43、46、49水浴保溫。實(shí)驗(yàn)中觀察到凝膠形成的速度隨著溫度的升高而加快，但到達(dá)49保溫90min也未出現(xiàn)凝膠。,.,從實(shí)驗(yàn)可以看出，溫度對鱟試劑的靈敏度影響很大，保溫溫度在2541之間，隨著溫度的升高，反應(yīng)速度也升高，41尚未達(dá)到反應(yīng)速度峰值，25 時反應(yīng)速度已相當(dāng)快；在4146之間，溫度對鱟試劑的靈敏度無明顯影響；達(dá)到49或更高溫度時，隨溫度升高而使酶蛋白逐漸變性，則鱟試劑被破壞，反應(yīng)速度反而降低。,.,2）保溫時間 將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成2，進(jìn)行鱟試驗(yàn)，37保溫，分別在10、20、30、40、50、70min時觀察，發(fā)現(xiàn)