免疫學(xué)原理及檢測(cè).ppt

免疫學(xué)原理及檢測(cè),技術(shù)支持部 胡賀,主要內(nèi)容,免疫學(xué)基本內(nèi)容 血清學(xué)一般特點(diǎn) ELISA方法的技術(shù)根據(jù) ELISA方法的種類 影響因素 中山生物產(chǎn)品 各類產(chǎn)品簡(jiǎn)介,免 疫 學(xué),一門自然科學(xué)，從研究機(jī)體對(duì)傳染病的抵抗力開始，是微生物學(xué)的一個(gè)分支，但隨著科技的發(fā)展，成為了一門獨(dú)立的學(xué)科。,免疫學(xué)反應(yīng),是抗原與抗體的反應(yīng)，僅在高等脊椎動(dòng)物中存在。 這是已知的最精妙復(fù)雜的身體抵御外部物質(zhì)的系統(tǒng)。,抗原(Antigen),抗原是指能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答而生成抗體和致敏淋巴細(xì)胞等免疫應(yīng)答產(chǎn)物，并能與之發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)。 具有免疫原性和反應(yīng)原性。一般抗原都是外來(lái)物，如細(xì)菌、病毒、寄生蟲、大分子蛋白等 。,抗體(Antibody),機(jī)體受外來(lái)抗原物質(zhì)刺激后，產(chǎn)生的一種能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白(Ig)。,免疫球蛋白分類,Ig通常是指具有抗體活性和（或）抗體樣結(jié)構(gòu)的球蛋白。應(yīng)用免疫電泳與超速離心分析可將Ig分5類： IgG、IgA、IgM、 IgD、 IgE。 IgG：含量最多或最主要的Ig（75%），唯一能夠通過胎盤的Ig。主要由脾臟和淋巴結(jié)中的漿細(xì)胞合成與分泌。 IgM：分子量最大，由5個(gè)IgM單體通過J鏈連接。是最早出現(xiàn)的Ig，是抗原刺激后最早出現(xiàn)的抗體，其殺菌、溶菌、溶血、促吞噬以及凝集作用比IgG高5001000倍,IgG抗體的結(jié)構(gòu)及與抗原的反應(yīng),血清學(xué)反應(yīng)的一般特點(diǎn),1、抗原、抗體的結(jié)合具有特異性，但當(dāng)有共同抗原、抗體存在時(shí)，會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)。 2、抗原、抗體的結(jié)合是分子表面的結(jié)合，這種結(jié)合雖相當(dāng)穩(wěn)定，但是可逆的。 3、抗原、抗體的結(jié)合是按一定比例進(jìn)行的，只有比例適當(dāng)時(shí)，才能出現(xiàn)可見反應(yīng)。,最適比例示意圖,4、血清學(xué)反應(yīng)大體分為兩個(gè)階段進(jìn)行，但其間無(wú)嚴(yán)格界限。第一階段為抗原抗體特異性結(jié)合階段，反應(yīng)速度很快，只需幾秒至幾分鐘反應(yīng)即可完畢，但不出現(xiàn)肉眼可見現(xiàn)象。第二階段為抗原抗體反應(yīng)的可見階段，表現(xiàn)為凝集、沉淀、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)等。反應(yīng)速度慢，需幾分、幾十分以至更長(zhǎng)時(shí)間。,血清學(xué)反應(yīng)的一般特點(diǎn),酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) enzyme linked immuno- sorbent assay ELISA,ELISA方法的技術(shù)根據(jù),抗原或抗體能結(jié)合到固相載體的表面，并保持其免疫活性。 抗原或抗體與酶連接所形成的結(jié)合物仍保持免疫學(xué)和酶的活性。 在測(cè)定時(shí)待測(cè)血清與固相載體的抗原或抗體結(jié)合，然后再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，形成復(fù)合的結(jié)合物，最后加入底物溶液，與酶反應(yīng)的顏色深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成比例。,ELISA 方法的種類,雙抗體夾心 ELISA 法示意圖,影響因素,試劑因素 標(biāo)本因素（內(nèi)源性、外源性） 操作因素,試劑因素,選擇優(yōu)良的檢測(cè)試劑，操作前平衡到室溫 不同批號(hào)的試劑不能混用 在有效期內(nèi)使用,標(biāo)本因素(外源性干擾),標(biāo)本應(yīng)避免溶血，細(xì)菌的污染(假陽(yáng)性)； 抗凝不完全的標(biāo)本(假陽(yáng)性)，建議盡量不用抗凝劑血尤其是肝素抗凝劑； 標(biāo)本保留時(shí)間過長(zhǎng)(間接法本底值增高)，如需保存一周以上，則應(yīng)-20保存,融解后應(yīng)充分混勻； 標(biāo)本間應(yīng)避免交叉污染，不應(yīng)與生化標(biāo)本共用同一管標(biāo)本； 不能用NaN3防腐。,標(biāo)本因素(內(nèi)源必干擾),類風(fēng)濕因子（假陽(yáng)性） 檢測(cè)抗原時(shí)可用2-巰基乙醇加入到標(biāo)本稀釋液中,使其降解或F(ab)2代替完整IgG。 補(bǔ)體（假陽(yáng)性） 可用EDTA稀釋標(biāo)本或滅活補(bǔ)體。 嗜異性抗體、自身免疫性抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)等。,操作時(shí)影響因素,加樣應(yīng)加在孔的下1/3處，注意不可濺出或有氣泡產(chǎn)生。 加樣應(yīng)每人一吸頭，防止交叉污染。 樣本的稀釋(目的是減少非特異性反應(yīng)) 要先加稀釋液再加標(biāo)本并用微量振蕩器混勻30秒。 加試劑時(shí)應(yīng)搖勻并棄去第一滴。 洗滌應(yīng)徹底。,中山生物產(chǎn)品,乙肝兩對(duì)半（缺少e抗原） 丙肝 梅毒 EB病毒 登革熱 G6PD,乙型肝炎病毒血清標(biāo)志物檢測(cè), 常用ELISA法檢測(cè)。 目前HBsAg診斷試劑質(zhì)量較高，靈敏度可達(dá) 0.2ng/L。從全國(guó)室間質(zhì)控評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，陽(yáng) 性標(biāo)本率達(dá)到或超過98。 HBsAg滴度越高，HBeAg、HBV DNA陽(yáng)性的可能性越大。 血液與肝組織的HBsAg含量并不完全相關(guān)。,HBsAg,為什么血清HBsAg陰性不能排除HBV感染？ 檢測(cè)試劑不夠敏感。 S基因變異（抗原性發(fā)生改變）。 X基因變異（轉(zhuǎn)錄受抑制）。 重疊HCV感染（干擾HBsAg合成）。,如何診斷血清HBsAg陰性的HBV感染？ 提高檢測(cè)敏感性 采用針對(duì)變異抗原的檢測(cè)試劑 HBV DNA的檢測(cè) 組織中標(biāo)志物的檢測(cè),陽(yáng)性就萬(wàn)無(wú)一失了嗎？ 低滴度應(yīng)注意假陽(yáng)性 單一HBsAb陽(yáng)性HBV DNA檢出率0-11.8%： 先后感染了不同的HBV亞型 S基因變異 X基因變異,HBsAb,HBsAb陽(yáng)性HBV DNA陰性 并不排除肝細(xì)胞內(nèi)HBV的存在, 可出現(xiàn)在HBV感染的恢復(fù)期，此時(shí)HBsAg未 消失，HBsAb已產(chǎn)生，大部分歸功于檢測(cè)敏 感性的提高。 S基因發(fā)生變異，野生株HBsAb不能將其清 除； HBsAb陽(yáng)性者感染了不同亞型HBV或免疫逃 避株。,HBsAg 與 HBsAb共存, 是重要的免疫耐受因子，大部分情況下其存 在表示患者處于高感染低應(yīng)答期。 HBeAg與HBV DNA有良好的相關(guān)性。 陽(yáng)性標(biāo)本檢出率90左右。,HBeAg,HBeAg與HBeAb,HBeAg的存在表示病毒復(fù)制活躍且有較強(qiáng)的傳染性。 HBeAg消失而HBeAb產(chǎn)生稱為血清轉(zhuǎn)換。 HBeAb陽(yáng)轉(zhuǎn)后，病毒復(fù)制多處于靜止?fàn)顟B(tài)，傳染性降低。長(zhǎng)期HBeAb陽(yáng)性者并不代表病毒復(fù)制停止或無(wú)傳染性，研究顯示20%50%仍可檢測(cè)到HBV DNA，部分可能由于前C區(qū)基因變異，導(dǎo)致不能形成HBeAg。,HBeAg與HBeAb共存 血清轉(zhuǎn)換過程中。 檢測(cè)敏感性提高。 野生株與變異株同時(shí)存在。,HBcAb, 反映肝細(xì)胞受到HBV侵害的一種指標(biāo)，主要包括 IgM、IgG、IgA。 抗HBc IgM陽(yáng)性是最早出現(xiàn)的特異性抗體，是診 斷急性乙型肝炎和判斷病毒復(fù)制活躍的指標(biāo)，并 提示病人的血液有強(qiáng)傳染性。也見于慢性活動(dòng)性 肝炎。 抗HBc IgG 其陽(yáng)性滴度高，表明患有乙型肝炎， 指正在感染；低滴度為既往感染指標(biāo)，體內(nèi)時(shí)間 長(zhǎng)。,乙型肝炎病毒各項(xiàng)標(biāo)志物 檢測(cè)的臨床意義,臨床二對(duì)半檢測(cè)常見模式,？,建議每個(gè)病人都要進(jìn)行 HBV DNA檢測(cè),HBV DNA檢測(cè)的臨床意義,1、診斷方面： HBV DNA是HBV存在最直接的依據(jù) HBV DNA是HBV復(fù)制的標(biāo)志 HBV DNA是患者具有傳染性的標(biāo)志,（4） 對(duì)HBV-M起補(bǔ)充作用： HBeAg()/ HBeAb()乙型肝炎 （前C區(qū)變異） HBsAg()乙型肝炎 （S區(qū)變異） 低水平感染 單項(xiàng)抗HBc()乙型肝炎,HBV DNA檢測(cè)的臨床意義,2、 療效判斷： HBV DNA是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效 最敏感的指標(biāo) 。 3、預(yù)后判斷： HBV DNA水平與病情有一定的關(guān)系。,HBV DNA檢測(cè)的臨床意義,調(diào)查表明并不是所有“大三陽(yáng)”的病人都處于HBV復(fù)制期，具有傳染性；也不是所有“小三陽(yáng)”的病人HBV都無(wú)復(fù)制。因此，要準(zhǔn)確知道HBV是否處于復(fù)制狀態(tài)，最準(zhǔn)確的方法還是通過檢測(cè)HBV DNA來(lái)決定。,為什么建議每個(gè)病人都要進(jìn)行 HBV DNA檢測(cè)？,！,HBsAg和HBeAg均陽(yáng)性而HBV DNA陰性 可能的原因： 干擾素或拉米夫定等治療后病毒復(fù)制受抑制。 PCR所用引物相應(yīng)的DNA序列發(fā)生突變，此引物與突變DNA不能配對(duì)結(jié)合。 病毒DNA整合于宿主肝細(xì)胞染色體而血中游離HBV DNA很少或缺乏。,丙型肝炎,HCV抗體不是保護(hù)性抗體，是存在HCV感染的標(biāo)志?？笻CV IgM在發(fā)病后即可檢測(cè)到，一般持續(xù)13個(gè)月。如果抗HCV IgM持續(xù)陽(yáng)性，提示病毒持續(xù)復(fù)制，易轉(zhuǎn)為慢性。低滴度抗HCV IgG提示病毒處于靜止?fàn)顟B(tài)，高滴度提示病毒復(fù)制活躍。,HCV RNA HCV RNA陽(yáng)性是病毒感染和復(fù)制的直接標(biāo)志。HCV RNA亦可定量，定量測(cè)定有助于了解病毒復(fù)制程度、抗病毒治療的選擇及療效評(píng)估等。,為什么要同時(shí)檢測(cè) 抗HCV 及 HCV RNA？, 抗病毒治療的要求。 防止漏診。 有報(bào)道223例丙型肝炎病例中，抗HCV和 HCV RNA同時(shí)陽(yáng)性86例，單純抗HCV陽(yáng)性 118例，單純HCV RNA 陽(yáng)性19例。 表明單做其中一項(xiàng)可能導(dǎo)致漏診。,艾滋病血清學(xué)檢測(cè), 初篩試驗(yàn)：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 用于對(duì)檢測(cè)對(duì)象感染情況的初步篩查，檢測(cè)結(jié) 果可能會(huì)有假陽(yáng)性，不能發(fā)抗體陽(yáng)性報(bào)告。 確認(rèn)試驗(yàn)：免疫印跡法（Western Blot） 確定檢測(cè)對(duì)象是否有HIV抗體，可發(fā)抗體陽(yáng)性 報(bào)告。,第一代 ELISA 試劑,標(biāo)記抗原：全病毒裂解抗原 優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，可檢出各種抗體 缺點(diǎn)：制備麻煩，成本高，假陽(yáng)性 1985年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)第一個(gè)HIV抗體篩選試劑,第二代 ELISA 試劑,標(biāo)記抗原：重組或合成多肽抗原 優(yōu)點(diǎn)：重組抗原可消除HLA所致的抗體假陽(yáng)性，生產(chǎn)成本低.不使用HIV病毒顆粒，較為安全，敏感性特異性較高 缺點(diǎn)：仍有一定的假陽(yáng)性 1990年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)第一個(gè)重組抗原篩選試劑。,第三代 ELISA 試劑,標(biāo)記抗原：重組或合成多肽 優(yōu)點(diǎn)：可檢測(cè)所有不同種類的抗體，增加了試劑的敏感性和特異性 1994年發(fā)展了雙抗原夾心法，酶標(biāo)物由抗人 IgG改變?yōu)樘禺愋訦IV抗原。,第四代 ELISA 試劑,標(biāo)記物：重組或多肽抗原+重組抗體 優(yōu)點(diǎn)：同時(shí)檢測(cè)HIV抗原抗體，縮短窗口期 注意：抗原檢測(cè)敏感性低于單獨(dú)抗原試劑(20100pg/ml, 3.510pg/ml) 1998年第四代試劑首次上市。,快速檢測(cè)試驗(yàn),特點(diǎn)： 1、操作簡(jiǎn)便、快速； 2、普通室溫下可以完成，無(wú)需特殊儀器； 3、判讀受主觀因素影響。 適用范圍： 野外、緊急情況 。,HIV “窗口期”,ELISA法檢測(cè)假陽(yáng)性的原因,由于儀器或加樣頭造成的交叉污染 潮濕或試劑滴漏 底物被金屬離子污染 洗板不充分 讀取錯(cuò)誤 生物因素,抗體初篩試驗(yàn)的局限性,陽(yáng)性結(jié)果不能確認(rèn)，需用其他試劑復(fù)查。 陰性結(jié)果不能排除HIV感染： 在感染早期，血清陽(yáng)轉(zhuǎn)前存在“窗口期”，在感染晚期，某些抗體可能檢測(cè)不到（如p24抗體）。 反應(yīng)中抗體過量，抗原抗體比例不合適而不能形成特定結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)凝集抑制。 不能診斷18月齡嬰兒的母嬰垂直感染。 新出現(xiàn)的亞群難以檢測(cè)。,梅 毒（syphilis）,由梅毒螺旋體引起的慢性全身性疾病 梅毒螺旋體每3033小時(shí)繁殖一次，為厭氧微生物，在體外很容易死亡 梅毒分為三期：一期和二期梅毒病程在2年以內(nèi)稱為早期梅毒，三期梅毒病程已超過2年稱為晚期梅毒 傳播途徑：主要為性行為傳播，少數(shù)通過間接感染或血液,起源及流行情況,15世紀(jì)末,梅毒起源并廣泛流行于歐洲, 通過商業(yè)往來(lái)，也進(jìn)入了我國(guó)，于1505年在廣東省首先發(fā)現(xiàn)梅毒病例，此后，梅毒便從沿海到內(nèi)地在我國(guó)廣泛傳播開來(lái)，發(fā)病率居高不下，居性病之首。 解放后，黨和政府有效地取締了妓院，對(duì)性病進(jìn)行廣泛的普查普治，經(jīng)過十年的努力，已于 1959年基本上消滅了梅毒。 1964年我國(guó)向全世界宣布基本消滅了性病，這一舉動(dòng)震驚了世界，轟動(dòng)了全國(guó)。,世界各國(guó)積極防治,在美國(guó)、澳大利亞、加拿大以及歐洲發(fā)達(dá)國(guó)家等，已經(jīng)將梅毒的預(yù)防和治療納入到公共衛(wèi)生的范疇 在全球?qū)哟紊?，已?jīng)提出了消滅胎傳梅毒的全球行動(dòng)策略 在我國(guó)，目前已經(jīng)開始制定全國(guó)梅毒控制規(guī)劃,梅毒檢測(cè)方法,病原體檢查：硬下疳部位的分泌物見到螺旋體 梅毒血清學(xué)檢查 常規(guī)篩查方法：非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)（性病研究實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)、不加熱血清反應(yīng)素玻片試驗(yàn)） 若篩查陽(yáng)性，應(yīng)做梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)（熒光密螺旋體抗體吸收試驗(yàn)、梅毒螺旋體血凝試驗(yàn)），測(cè)定血清特異性抗體,現(xiàn)在通常是用梅毒血清學(xué)的檢測(cè)來(lái)加以診斷，目前各大醫(yī)院比較常用的是RPR（快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)）和TPHA（梅毒螺旋體血球凝集試驗(yàn)）。 ELISA檢測(cè)梅毒螺旋體抗體試劑盒則主要應(yīng)用于大規(guī)模梅毒篩查,如血篩,流行病篩查等。,EBV&鼻咽癌(NPC),鼻咽癌簡(jiǎn)介,鼻咽癌又稱廣東癌，高發(fā)于我國(guó)廣東廣西及東南亞，我國(guó)35歲兒童90%以上已感染EB病毒，華南地區(qū)人群的感染率接近100%。早期無(wú)明顯癥狀，不易發(fā)現(xiàn)。是我國(guó)死亡率最高的10大惡性腫瘤之一。 主要受遺傳因素、EB(Epstein-Barr)病毒感染以及某些環(huán)境因素相互影響而形成,微生物學(xué)檢查,EBV分離培養(yǎng)較困難，一般用血清學(xué)方法做輔助診斷： 1、EBV特異性抗體檢測(cè)，對(duì)鼻咽癌早期診斷有 很大幫助； 2、異嗜性抗體檢測(cè)：主要用于診斷傳染性單 核細(xì)胞增多癥。 EBV核酸檢測(cè)：原位核酸雜交或PCR,G6PD,6-磷酸葡萄糖脫氫酶（蠶豆?。?是一種遺傳性酶缺乏病。我國(guó)高發(fā)區(qū)，南高北低，主要分布在長(zhǎng)江以南各省，以海南廣東 廣西 云南 貴州 四川等省為高。 病因是由于G6PD基因突變，導(dǎo)致該酶活性降低紅細(xì)胞不能抵抗氧化損傷而遭受迫壞，引起溶血性貧血。,臨床表現(xiàn),G6PD缺乏癥的臨床表現(xiàn)與一般溶血性貧血大致相同。分新生兒黃疸、蠶豆病、藥物性溶血、感染性溶血、非球形細(xì)胞溶血性貧血等臨床類型。 因G6PD缺乏誘發(fā)的嚴(yán)重的急性溶血性貧血因紅細(xì)胞破壞過多，如不及時(shí)處理，可引起肝、腎、或心功能衰竭，甚至死亡。 G6PD缺乏癥又是新生兒病理性黃疸的主要原因。據(jù)中山醫(yī)大的一項(xiàng)統(tǒng)計(jì)表明，患G6PD缺乏癥的新生兒中，約50%的患兒會(huì)出現(xiàn)新生兒黃疸，其中約12%可發(fā)展為核黃疸，導(dǎo)致腦部損害，引起智力低下。,遺傳方式,G6PD缺乏癥屬X連鎖不完