NKG2D配體的表達(dá)直接影響NK細(xì)胞對(duì)不同發(fā)育階段DC的殺傷.doc

NKG2D配體的表達(dá)直接影響NK細(xì)胞對(duì)不同發(fā)育階段DC的殺傷作者：涂三芳,郭坤元,胡亮衫,梅家轉(zhuǎn),周健,孫明【摘要】目的:探討NKG2D配體在不同發(fā)育階段樹突狀細(xì)胞（DC）表面的表達(dá)及其對(duì)自然殺傷（NK）細(xì)胞殺傷活性的影響。方法:用細(xì)胞因子（rhIL-4、rhGM-CSF、TNF-）體外誘導(dǎo)培養(yǎng)單核細(xì)胞來源的未成熟樹突狀細(xì)胞（iDC）和成熟樹突狀細(xì)胞（mDC）并鑒定形態(tài)和表型,免疫磁珠法分離純化NK細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測iDC和mDC表面NKG2D配體MICA/B、ULBP1-3的表達(dá)。用LDH釋放法檢測NK細(xì)胞對(duì)iDC和mDC的殺傷活性以及抗NKG2D單克隆抗體(mAb)阻斷NK細(xì)胞后的殺傷活性。結(jié)果:培養(yǎng)的iDC和mDC具有典型的細(xì)胞形態(tài)和免疫表型特征。iDC表面表達(dá)MICA、MICB、ULBP1、ULBP3,表達(dá)率分別為(32.398.30）%、(17.753.40)%、(26.716.48)%、(38.376.89)%；mDC表面表達(dá)MICA、ULBP3,表達(dá)率分別為(7.822.67)%、(8.362.42)%,比iDC表面相應(yīng)配體表達(dá)率低（P<；0.01）。各效靶比NK細(xì)胞對(duì)iDC的殺傷活性均比對(duì)mDC的殺傷活性高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<；0.01)?？筃KG2DmAb阻斷NK細(xì)胞后對(duì)iDC殺傷活性比阻斷前減弱(P<；0.05)；對(duì)mDC的殺傷活性與阻斷前相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>；0.05)。結(jié)論:NKG2D配體在iDC表面表達(dá)高,介導(dǎo)了NK細(xì)胞對(duì)iDC的殺傷,而對(duì)mDC的殺傷無影響,是NK細(xì)胞對(duì)iDC選擇性高殺傷的分子機(jī)制之一?！娟P(guān)鍵詞】NKG2D配體自然殺傷細(xì)胞樹突狀細(xì)胞AbstractAIM:ToinvestigatetheexpressionofNKG2Dligandsondendriticcells（DC）atdifferentdevelopmentstagesanditseffectoncytotoxicityofnaturalkiller（NK）cells.METHODS:Themonocyteswereculturedintoimmaturedendriticcells（iDC）andmaturedendriticcells（mDC）withcytokines.NKcellswereobtainedfromnormalperipheralbloodbyCD56antibodymagneticisolation.TheexpressionofNKG2Dligands(MICA/B,ULBP1-3)wasdetectedbyflowcytometry.CytotoxicityofNKcellsandtheNKcellsblockedwithanti-NKG2DmAbsagainstiDCandmDCwastestedusingLDH-releasingmethod.RESULTS:IDCandmDCwereoftypicalmorphologyandphenotypes.MICA,MICB,ULBP1,andULBP3wereexpressedoniDCandtheirexpressionratewas(32.398.30)%,(17.753.40)%,(26.716.48)%,(38.376.89)%,respectively.MICAandULBP3wereexpressedonmDCandtheirexpressionratewas(7.813.33)%and(8.362.42)%,respectively,whichwaslowerthanthatonmDC(P<；0.01).AttheeachETratiocytotoxicityofNKcellsagainstiDCwasstrongerthanthatagainstmDC(P<；0.01).cytotoxicityofNKcellsblockedwithanti-NKG2DmAbagainstiDCwasdecreasedcomparedwiththatofNKcellsunblocked(P<；0.05)whilecytotoxicityofNKcellsblockedwithanti-NKG2DmAbagainstmDCshowednodecreasecomparedwiththatofNKcellsunblocked(P>；0.05).CONCLUSION:TheexpressionofNKG2DligandsoniDCishigherthanthatonmDC,whichplaysanimportantroleinthecytotoxiceffectofNKcellsagainstiDC,buthasnoeffectonthataginstmDC.NKG2D-NKG2DligandsshowsoneofthemoleculermechanismsthatNKcellskilliDCselectivly.KeywordsNKG2Dligand；naturalkillercell；dendriticcell樹突狀細(xì)胞（DC）和自然殺傷（NK）細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)最重要的組成部分,二者之間存在相互作用1。Ruggeri等2,3研究發(fā)現(xiàn)在異基因造血干細(xì)胞移植中供者NK細(xì)胞可以通過殺傷宿主DC來降低移植物抗宿主?。℅VHD）的發(fā)生。但NK細(xì)胞殺傷DC的作用機(jī)制仍未完全明確。NK細(xì)胞主要通過表面受配體結(jié)合起殺傷作用,本研究旨在通過檢測NKG2D配體在不同發(fā)育階段DC表面的表達(dá)水平來探索NKG2D受配體識(shí)別途徑是否參與介導(dǎo)了NK細(xì)胞對(duì)不同發(fā)育階段DC的殺傷,為臨床運(yùn)用NK細(xì)胞降低GVHD的發(fā)生提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1材料RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司。重組人白細(xì)胞介素-4(rhIL-4)、重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和腫瘤壞死因子（TNF-）均為Peprotech公司產(chǎn)品?？笴D56免疫磁珠抗體、MACS磁柱和MACS細(xì)胞分選儀均為Miltenyi公司產(chǎn)品。殺傷活性檢測試劑盒（Cytotox96non-radioactivecytotoxocityassay）為Promega公司產(chǎn)品。CD3FITC、CD16PECD56PEmAb為BD公司產(chǎn)品。FITC或PE標(biāo)記的鼠抗人CD80、CD86、HLA2DR、CD83、CD1a單克隆抗體(mAb)及其同型對(duì)照均為eBiosience公司產(chǎn)品。鼠抗人NKG2D、MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3mAb和FITC標(biāo)記的兔抗鼠IgG1購自RnD公司。FACScabilur型流式細(xì)胞儀為Beckman-Coulter公司產(chǎn)品。1.2方法1.2.1人外周血單核細(xì)胞來源的iDC與mDC體外誘導(dǎo)培養(yǎng)與鑒定常規(guī)分離健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞,以4109/L細(xì)胞密度接種在6孔板中,置于37、50mL/LCO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)4h后,去除非貼壁細(xì)胞,加入含20g/LrhIL-4、50g/LrhGM-CSF、100mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,置于培養(yǎng)箱培養(yǎng),隔天半量換液,補(bǔ)充等量細(xì)胞因子。第6天補(bǔ)加80g/L的TNF-,共培養(yǎng)9d。每天倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。收集第6天和第9天細(xì)胞用25mL/L戊二醛固定,漂洗,脫水,乙酸異物脂置換,干燥,噴金后上機(jī)用掃描電子顯微鏡觀察鑒定其形態(tài)。同樣收集第6天和第9天細(xì)胞計(jì)數(shù)后分管,分別加CD80PE、CD86PE-CY5、HLA-DRPE、CD1aFE、CD83FITCmAb4度標(biāo)記,對(duì)照管加同型對(duì)照IgG1,用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測各分子的表達(dá),不同時(shí)間點(diǎn)重復(fù)3次。1.2.2人外周血來源的NK細(xì)胞分離分離另外3位健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞,每107個(gè)細(xì)胞加入80LPBS和20L抗CD56免疫磁珠抗體,4標(biāo)記15min后洗滌,用500L的PBS充分混勻后加入到磁柱中,在MACS細(xì)胞分選儀中分離,推注器將分選的陽性細(xì)胞推入無菌試管,為NK細(xì)胞。CD3FITC、CD16PECD56PEmAb標(biāo)記NK細(xì)胞檢測NK細(xì)胞的純度。1.2.3iDC、mDC表面NKG2D配體的FCM檢測分別收集鑒定后的iDC與mDC洗滌計(jì)數(shù),分6管,每管109/100mL細(xì)胞懸液,按1g/106個(gè)細(xì)胞密度分別加入MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3mAb,4度標(biāo)記30min后洗滌,加入FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG1二抗4度標(biāo)記30min,第6管加等量同型IgG1作為陰性對(duì)照,洗滌后以FCM檢測MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3的表達(dá)量。為避免實(shí)驗(yàn)誤差,不同時(shí)間點(diǎn)重復(fù)3次。1.2.4NK細(xì)胞對(duì)iDC與mDC殺傷活性的檢測采用LDH釋放法4,收集iDC,mDC作為靶細(xì)胞,NK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞,按照Cytotox96non-radioactivecytotoxocityassay殺傷試劑盒說明書操作,倍比稀釋法按效靶比201、101、51鋪板,阻斷組先加抗NKG2DmAb10g/100L常溫下孵育15min,封閉NK細(xì)胞表面NKG2D受體,再加靶細(xì)胞。顯色后ELX-800酶標(biāo)儀上測A值。NK細(xì)胞殺傷率=(實(shí)驗(yàn)孔A值靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔A值效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放孔A值)/(靶細(xì)胞最大釋放孔A值靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔A值)100%1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,數(shù)據(jù)以xs表示,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P<；0.05者表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1iDC和mDC的形態(tài)和表型倒置顯微鏡下觀察第6天細(xì)胞大部分半懸浮聚集成簇生長,胞體增大,表面可見短小毛刺狀突起。第9天細(xì)胞大部分懸浮生長,表面樹突結(jié)構(gòu)明顯。掃面電鏡下觀察第6天細(xì)胞大小10m左右,表面突起短小,多見薄沙或云霧狀皺褶,符合iDC的形態(tài)特征（圖1A）；第9天細(xì)胞表面突起更多更長,呈典型樹突狀結(jié)構(gòu),云霧狀皺褶稀疏,符合mDC的形態(tài)特征（圖1B）。FCM結(jié)果顯示第6天DC表面共刺激分子CD80和CD86分別為（40.87.9）%和（45.13.7）%,HLA-DR表達(dá)為（59.95.2）%,特異性分子標(biāo)志物CD1a高表達(dá)為（71.95.2）%,成熟分子標(biāo)志物CD83低表達(dá)為（14.91.9）%,為不成熟階段表型。第9天測得CD80、CD86和HLA-DR表達(dá)升高為（71.57.3）%、（79.96.7）%和（88.66.6）%,CD1a仍高表達(dá),CD83表達(dá)升高為(65.53.8)%,為成熟階段表型。圖1掃描電鏡下觀察DC形態(tài)（略）Fig1ThemorphologiesofDCobservedbyscanningelectronmicroscopeA:Day6；B:Day9.2.2NK細(xì)胞的純度FCM結(jié)果顯示外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)免疫磁珠分選后NK細(xì)胞（CD3-CD16+CD56+）的純度為（91.664.04）%,能滿足實(shí)驗(yàn)要求（圖2）。圖2免疫磁珠法分選后NK細(xì)胞的純度（略）Fig2PurificationofNKcellsafterimmunomagneticisolation2.3iDC和mDC表面NKG2D配體的表達(dá)iDC表面表達(dá)MICA、MICB、ULBP1和ULBP34個(gè)配體；mDC表面只表達(dá)MICA、ULBP22個(gè)配體,且比iDC表面相應(yīng)配體表達(dá)率低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<；0.01）。其他配體表達(dá)率均低于5%,視為陰性結(jié)果(表1,圖3)。表1NKG2D配體在iDC和mDC表面的表達(dá)率（略）Tab1ExpressionofNKG2DligandsonthesurfaceofiDCandmDCbP<；0.01vsiDC.圖3iDC和mDC膜表面NKG2D配體的表達(dá)（略）Fig3ExpressionofNKG2DligandsonthesurfaceofiDCandmDC2.3NK細(xì)胞對(duì)iDC與mDC的殺傷活性各效靶比NK細(xì)胞對(duì)iDC的殺傷活性分別高于對(duì)mDC的殺傷活性,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<；0.01）。NKG2DmAb阻斷NK細(xì)胞后,各效靶比NK細(xì)胞對(duì)iDC的殺傷活性降低（P<；0.05）；對(duì)mDC的殺傷活性與阻斷前相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>；0.05）；阻斷后的NK細(xì)胞對(duì)iDC的殺傷活性比阻斷前NK細(xì)胞對(duì)mDC的殺傷活性高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<；0.05,圖4）。圖4抗NKG2DmAb阻斷前后NK細(xì)胞對(duì)iDC和mDC的殺傷活性（略）Fig4CytotoxicityofNKcellsandtheNKcellsblockedwithanti-NKG2DmAbagainstiDCandmDC3討論NK細(xì)胞和DC是機(jī)體天然免疫和獲得性免疫系統(tǒng)中重要的組成部分,近年來研究1,5表明二者在天然免疫早期階段存在相互作用,DC能增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性,同時(shí)NK細(xì)胞能選擇性殺傷iDC,到目前為止其殺傷機(jī)制仍在探索中。DC根據(jù)發(fā)育階段的不同可分為iDC和mDC,其在形態(tài),表型和功能上有所不同6。NK細(xì)胞的殺傷活性同時(shí)受活化性和抑制性受配體結(jié)合產(chǎn)生的信號(hào)平衡調(diào)節(jié)起作用7,其活化性受體主要包括II型跨膜蛋白受體NKG2D和NK細(xì)胞自然細(xì)胞毒受體NCR,與配體結(jié)合向NK細(xì)胞傳遞活化性信號(hào)。NKG2D配體8主要包括多態(tài)性的MHC-I類鏈相關(guān)的肽A、B（MICA/B）和人巨細(xì)胞病毒UL16結(jié)合蛋白(ULBPs),它們?cè)诓煌l(fā)育階段DC的表達(dá)情況尚未見研究報(bào)道。我們通過FCM分別檢測iDC和mDC表面NKG2D配體的表達(dá),結(jié)果顯示iDC表面表達(dá)MICA、MICB、ULBP1和ULBP3,而mDC表面只表達(dá)MICA和ULBP3,且表達(dá)率很低。因此iDC可以通過表面NKG2D配體與NKG2D結(jié)合激活NK細(xì)胞的殺傷活性,mDC通過NKG2D配體很難激活NK細(xì)胞。本研究殺傷試驗(yàn)顯示NK細(xì)胞對(duì)iDC的殺傷活性比對(duì)mDC的殺傷活性高很多,與其他研究結(jié)果一致9。NKG2DmAb阻斷NK細(xì)胞后降低了NK細(xì)胞對(duì)iDC的殺傷活性,但對(duì)mDC的殺傷沒有影響。因此可認(rèn)為NKG2D受配體識(shí)別信號(hào)途徑介導(dǎo)了NK細(xì)胞對(duì)iDC的殺傷,沒有介導(dǎo)對(duì)mDC的殺傷,是NK細(xì)胞選擇性高殺傷iDC的機(jī)制之一。NK細(xì)胞的殺傷作用除了受活化性信號(hào)作用之外,同時(shí)受抑制性信號(hào)的共同調(diào)節(jié)作用。NK細(xì)胞抑制性信號(hào)受體主要包括殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體KIR和CD94/NKG2A等,分別與靶細(xì)胞表面的HLA-類分子和不典型的I類分子結(jié)合,向NK細(xì)胞傳遞抑制性信號(hào)10。本研究結(jié)果顯示抗NKG2DmAb阻斷后對(duì)iDC的殺傷活性仍比未阻斷前NK對(duì)mDC的殺傷活性高,說明抗NKG2DmAb不能完全阻斷NK細(xì)胞對(duì)iDC的殺傷,同時(shí)其他受配體識(shí)別途徑介導(dǎo)。除了其他活化性信號(hào)途徑外,更主要的就是抑制性信號(hào)在二者強(qiáng)弱不等。Ferlazzo等11發(fā)現(xiàn)mDC高表達(dá)抑制性配體MHC-I類分子,而iDC低表達(dá),這可能也是iDC被NK細(xì)胞選擇性殺傷的原因之一。在異基因造血干細(xì)胞移植中利用NK細(xì)胞對(duì)iDC的殺傷清除能力,輸入KIR/HLA錯(cuò)配的NK細(xì)胞可能做為