基因操作總結(jié)

1、基因操作總結(jié)質(zhì)粒重組的注意事項質(zhì)粒重組主要包括質(zhì)粒提取、限制性酶切、目的片段回收、連接及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化這五個基本步驟?，F(xiàn)在結(jié)合本人在實驗室長期從事質(zhì)粒重組的實際情況總結(jié)一下質(zhì)粒重組實驗操作的一些注意事項。.1 質(zhì)粒提取:質(zhì)粒重組對質(zhì)粒的質(zhì)量要求比較高；我們實驗室是用堿裂解法提取質(zhì)粒，一般說來,如果質(zhì)粒的拷貝數(shù)比較高而小量制備的質(zhì)粒量可以滿足實驗需要的話，那么對于初學(xué)者本人不推薦在質(zhì)粒提取這一步使用大量制備方法,因為大量制備方法步驟過多對質(zhì)粒的“傷害”要大于小量提取方法且所需時間相對較長。小量提取質(zhì)粒過程中建議只用酚氯仿抽提一次即可,上清少取一些（00ul一般)就不需要用氯仿再抽提一次了,最后在

2、用ter溶解質(zhì)粒之前質(zhì)粒的晾干最好是放在37度培養(yǎng)箱內(nèi),若質(zhì)粒提取起始菌液為1.5ml則晾干時間最好不要超過0分鐘（一般5分鐘即可);若質(zhì)粒提取起始菌液為3m則晾干時間最好不要超過0分鐘，質(zhì)粒晾干后馬上加入ter 于0度水浴鍋中助溶0分鐘。12限制性酶切:一般我喜歡用總體積為80ul的酶切體系，加入的酶量為1ul(10個單位)。對于將來要做為載體的da模板一般切割量是2-ug;而對于做為外插片段的質(zhì)粒則要考慮酶切下來的小片段與質(zhì)粒的長度比例來確定模板量,比如我們要從10kb的質(zhì)粒上切下的外插片段長度為1b，那么我們的小片段與質(zhì)粒的質(zhì)量比為1：1，這樣的話我們?yōu)榱吮ＷC小片段有800ng-1u而需

3、要酶切的模板量則是8-10u。1.3 目的片段回收：酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后于紫外燈照射下切取所要的目的條帶時，一定要謹記兩個要求:、一定要快;2、膠塊一定要小。1連接：載體一般加500ng左右,外插片段加的量是保證與載體的mol比為3:1即可。本人做連接反應(yīng)從來不做梯度，因為我堅信如果回收的目的片段質(zhì)量好的話，一個反應(yīng)即可成功。1.5 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化：將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌常用的方法有電轉(zhuǎn)化法和熱激法。電轉(zhuǎn)化法依靠短暫的高壓電脈沖造成細胞膜的不穩(wěn)定，形成電穿孔有利于da進入細菌；電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌時，電壓高，脈沖時間長,轉(zhuǎn)化率高，但細胞的死亡率也高且需要購買電轉(zhuǎn)化儀。熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌不

4、需要電轉(zhuǎn)化儀,操作簡便，是我們實驗室所選用的轉(zhuǎn)化方法。熱激法轉(zhuǎn)化細菌成功的關(guān)鍵步驟是感受態(tài)細胞的制備,目前常用的感受態(tài)細胞制備方法有ccl2和bcl(kl)法，rcl(kcl）法制備的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率較高,但cl2 法簡便易行,且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足一般實驗的要求。c2法制備感受態(tài)細胞熱激法轉(zhuǎn)化細菌的的原理是：大腸桿菌在0 ac低滲溶液中，細菌細胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的dn形成抗dnase的羥基鈣磷酸復(fù)合物粘附于細胞表面，經(jīng)42短時間熱沖擊處理,促進細胞吸收dna復(fù)合物，在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)十分鐘后,球狀細胞復(fù)原并分裂增殖。在被轉(zhuǎn)化的細胞中,重組子基因得到表達,在選擇性培養(yǎng)基平板上可挑

5、選所需的轉(zhuǎn)化子。在轉(zhuǎn)化過程中所要注意的事項有以下幾點：（1） 感受態(tài)細胞的制備盡量在低溫條件下操作,且動作要輕柔；（2） 感受態(tài)細胞制備好后加入連接產(chǎn)物輕柔混勻一次在冰上放置不要少于分鐘,而且注意冰浴過程中不要再去混勻它們。（3） 熱激后加入液體培養(yǎng)基復(fù)舒時搖床轉(zhuǎn)速控制在00轉(zhuǎn)/分以內(nèi)。（4） 用涂布棒將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂平板時,注意用力要輕,快速涂勻即可。（5） 平板倒置在培養(yǎng)箱里培養(yǎng)時間一般為16-8小時,不要超過20小時。2 實驗舉例：2.1 pcambia13035sno的重組該實驗是用eco和hindii兩種酶酶切pcabia100回收大片段作為載體,酶切rkii回收小片段（5sns)作為外

6、插d與載體進行連接，這個實驗是一個雙酶切連接實驗；雙酶切連接實驗是質(zhì)粒重組中最簡單的一種實驗，成功率極高。11質(zhì)粒cambia130與proii的提取。質(zhì)粒pcami130在大腸桿菌中拷貝數(shù)很高，用小量制備方法提取即可，起始菌液為3ml(5ml管回收菌液兩次),提取過程中注意動作要輕柔，最后在用2l ter溶解dna，取1ul溶解好的na電泳看提取效果。質(zhì)粒prokii的拷貝數(shù)較低,采用中量制備方法提取。21.雙酶切質(zhì)粒80ul酶切體系eo與hni各加1,質(zhì)粒pambia13酶切2ug，oki酶切u，酶切反應(yīng)過夜從晚6點切到次日早晨8點，加入電泳上樣uffer中止反應(yīng)。1.3 回收與定量酶切產(chǎn)

7、物經(jīng)瓊脂糖電泳后切膠回收，電泳時間可以比普通電泳適當(dāng)長些，切膠要快要準(zhǔn)，用it回收后取1ul電泳定量。由于proi是低拷貝，若提取的質(zhì)粒量不到8ug比如只有4u那么酶切回收小片段的量可能會很少,這時可以將回收物開蓋放置于60度水浴鍋中將其濃縮一下。注意:小片段可以濃縮，載體大片段不建議進行濃縮。24 連接與轉(zhuǎn)化10l連接體系，加1ul0bufr、05u連接酶，載體加8n，由于載體(b左右）分子量是外插(35snos約1b左右）是的8倍,所以外插加入3g即可。6度連接過夜。次日取5連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌。 cambia10ubiptnos的重組本實驗用p單酶切質(zhì)粒pcmi130ubinos和tes

8、yipt分別回收載體與t基因片段進行連接,這是一個單酶切連接實驗。單酶切連接實驗比起雙酶切連接實驗來說需要多注意的一步是載體脫磷反應(yīng),這一步如果做的好的話那么實驗成功率也是極高的。2.21當(dāng)酶切載體后載體是5突出粘末端時，那么在過夜的酶切產(chǎn)物中直接加入1l的a酶，37度反應(yīng)3分鐘即可加入上樣buffer中止反應(yīng)，電泳回收即可。22.2 如果酶切載體后載體是3突出粘末端，比如本實驗pni酶切后載體就是突出的,5端的磷酸基團是在里邊的；這種情況時，我是在酶切時用30l的酶切總體系,用1l的酶過夜酶切2ug的pcama30binos質(zhì)粒,然后加入7l的0iap buffer，1ul的cia酶,加dd

9、h2o到總體積為10ul，0度反應(yīng)半個小時后中止反應(yīng)電泳回收。.2.3 其它注意事項同雙酶切連接實驗附:感受態(tài)的制備與連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化步驟1cacl 法制備感受態(tài)細胞.1從37c 培養(yǎng)16-2小時的新鮮平板中挑取一個單菌落,轉(zhuǎn)到一個含有mllb培養(yǎng)基的10ml燒瓶中，3c劇烈震蕩培養(yǎng)約小時,至od值為0.20.3。1.2將細菌轉(zhuǎn)移到一個無菌、一次性使用的、冰預(yù)冷的7l聚丙烯管中，冰上放置10分鐘，使培養(yǎng)物冷至0c 。1.3于4c 以5000rm離心1分鐘，以回收細胞。1倒出培養(yǎng)液,將管倒置至少一分鐘，使培養(yǎng)液流干凈。1.5每5ml培養(yǎng)液用2ml預(yù)冷的0.1mol/l的cal2重懸細胞,冰上放置0分鐘。16于4 以5000rpm離心1分鐘,以回收細胞。倒出培養(yǎng)液，將管倒置至少一分鐘,使培養(yǎng)液流干凈。17每管用200l預(yù)冷的0.ol/l的cal2重懸細胞,此時感受態(tài)細胞制備完畢。連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化21用冷卻的無菌吸頭從用ac制備的感受態(tài)細胞中吸取200轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，每管加入連接產(chǎn)物,輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，冰上放置30分鐘。2.2將管在 水浴中放置