第七章 細(xì)胞重組與細(xì)胞融合

1、第七章 細(xì)胞重組與細(xì)胞融合,細(xì)胞重組與細(xì)胞融合,細(xì)胞重組：從活細(xì)胞中分離出細(xì)胞器及其組份，在體外進(jìn)行重新裝配成為具有生物活性的細(xì)胞的一種技術(shù)。 細(xì)胞融合：人工方法使2個(gè)或2個(gè)以上的細(xì)胞合并形成1個(gè)細(xì)胞的技術(shù),核體與胞質(zhì)體 核體：與細(xì)胞質(zhì)分離后得到的帶有少量細(xì)胞質(zhì)并包有質(zhì)膜的細(xì)胞核，也成為小型細(xì)胞。核體能夠重生其胞質(zhì)部分，繼續(xù)生長分裂。 胞質(zhì)體：除去細(xì)胞核后由質(zhì)膜包裹的無核細(xì)胞。 細(xì)胞松弛素B處理細(xì)胞能誘發(fā)細(xì)胞排核反應(yīng)，此時(shí)通過離心的方法可以將核體與胞質(zhì)體分離,微細(xì)胞 微細(xì)胞：又稱微核體，含有一條或幾條染色體，外有一薄層細(xì)胞質(zhì)和一個(gè)完整質(zhì)膜的核質(zhì)體。 秋水仙素和長春新堿等有絲分離阻斷劑能干擾微管

2、的合成與裝配，導(dǎo)致細(xì)胞分裂后期染色體產(chǎn)生發(fā)散運(yùn)動，發(fā)散開的染色體各自裝配出自己的核膜，形成微細(xì)胞,秋水仙胺,細(xì)胞松弛素B,細(xì)胞松弛素B,離心,胞質(zhì)體與完整細(xì)胞的重組形成胞質(zhì)雜種； 微細(xì)胞與完整細(xì)胞的重組形成微細(xì)胞核異體； 胞質(zhì)體與核體重新組合形成重組細(xì)胞,細(xì)胞重組的方式,細(xì)胞重組技術(shù)將細(xì)胞融合技術(shù)與細(xì)胞核質(zhì)分離技術(shù)相結(jié)合，為重新構(gòu)建不同類型的雜種細(xì)胞提供可能； 細(xì)胞重組技術(shù)可以人為的將染色體或者基因進(jìn)行轉(zhuǎn)移，使重組細(xì)胞產(chǎn)生新的性狀和新的特性,細(xì)胞重組的意義,細(xì)胞質(zhì)工程,細(xì)胞質(zhì)工程：是研究真核細(xì)胞的核-質(zhì)關(guān)系以及細(xì)胞器、細(xì)胞質(zhì)基因轉(zhuǎn)移的技術(shù)。細(xì)胞質(zhì)工程是進(jìn)行細(xì)胞重組的重要基礎(chǔ)。 細(xì)胞質(zhì)工程涉及的

3、技術(shù)有： 1、細(xì)胞破碎 2、細(xì)胞器及細(xì)胞組分分離 3、細(xì)胞器轉(zhuǎn)移 4、胞質(zhì)雜種,一、細(xì)胞破碎,細(xì)胞破碎是指利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)容物釋放出來的技術(shù)。 細(xì)胞破碎方法包含： 1、超聲波破碎法 2、反復(fù)凍融法 3、高速組織搗碎法 4、化學(xué)裂解法 5、生物酶解法,超聲波破碎法 利用超聲波振蕩器發(fā)射的15-25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液，由發(fā)生器和換能器組成。 反復(fù)凍融法 將細(xì)胞放在低溫下冷凍，然后在室溫中融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用,高速組織搗碎法 借助高速組織搗碎機(jī)使細(xì)胞被高速旋轉(zhuǎn)的葉片打碎。 化學(xué)裂解法 通過化學(xué)藥品改變細(xì)胞膜的通透性，使其裂解。 生物酶解法 利用溶解細(xì)胞壁的酶

4、處理細(xì)胞，破壞細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)含組分釋放,二、細(xì)胞器及細(xì)胞組分分離,細(xì)胞內(nèi)不同組份的密度和大小都不相同，在同一離心場內(nèi)的沉降速度也不同，因此，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法將細(xì)胞內(nèi)各種組份分級分離出來。 細(xì)胞器及細(xì)胞組份分離過程包括組織細(xì)胞勻漿、分級分離和分析三步。細(xì)胞勻漿要在低溫條件、等滲緩沖液（等滲勻漿介質(zhì)，如0.25mol/L的蔗糖）中進(jìn)行。 細(xì)胞器及細(xì)胞組份分離方法包含： 1、差速離心法 2、密度梯度分離法,沉降系數(shù)：顆粒在單位離心力場中粒子移動的速度。沉降系數(shù)是以時(shí)間表示的。 蛋白質(zhì)，核酸等生物大分子的S實(shí)際上時(shí)常在10的-13次方秒左右，故把沉降系數(shù)10的-13次方秒稱為一個(gè)Svedberg

5、單位，簡寫S，即10的-13方秒=1S。 大多數(shù)蛋白質(zhì)和核酸的沉降系數(shù)在4S和40S之間，核糖體及其亞基在30S和80S之間，多核糖體在100S以上,離心方式,離心運(yùn)動是指物體有遠(yuǎn)離中心運(yùn)動的現(xiàn)象。 根據(jù)離心機(jī)的類型分為水平離心、角離心（偏水平）和垂直離心三種,根據(jù)離心方式分為差速離心和密度梯度離心兩種,差速離心：在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心，用于分離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器,速度逐漸提高，樣品按大小先后沉降,在差速離心中細(xì)胞器沉降的順序依次為：細(xì)胞核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體。 由于各種細(xì)胞器在大小和密度上相互重疊，而且某些慢沉降顆粒常常被快沉降顆

6、粒裹到沉淀塊中，一般重復(fù)23次效果會好一些。 差速離心只用于分離密度和大小懸殊的細(xì)胞，更多用于分離細(xì)胞器。對于精細(xì)的分離，則是密度梯度離心效果更好,密度梯度離心：用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細(xì)胞分層、分離,密度梯度離心又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種 1、速度沉降主要用于分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。這種沉降方法所采用的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。生物顆粒（細(xì)胞或細(xì)胞器）在十分平緩的密度梯度介質(zhì)中按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達(dá)到分離。 2、等密度沉降適用于分離密

7、度不等的顆粒。細(xì)胞或細(xì)胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和足夠長時(shí)間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達(dá)到平衡，從而將不同密度的細(xì)胞或細(xì)胞器分離。介質(zhì)的最高密度應(yīng)大于被分離組分的最大密度，而且介質(zhì)的梯度要求較高的陡度，不能太平緩。這種方法適于分離細(xì)胞器，而不太適于分離和純化細(xì)胞,速度沉降,等密度沉降,三、細(xì)胞器轉(zhuǎn)移,細(xì)胞器轉(zhuǎn)移是將一個(gè)物種的細(xì)胞器轉(zhuǎn)移到另一個(gè)物種細(xì)胞中的技術(shù)。 細(xì)胞器轉(zhuǎn)移類似細(xì)胞核移植技術(shù)。不同的是操作對象為細(xì)胞器，不是細(xì)胞核。 最常見的是線粒體和葉綠體的細(xì)胞器轉(zhuǎn)移。 細(xì)胞器轉(zhuǎn)移方法有微注射、載體轉(zhuǎn)移、胞吞胞飲等方式,四、胞質(zhì)雜種,概念一：將兩種不同來源的核外

8、遺傳物質(zhì)（線粒體和葉綠體）與一個(gè)特定的細(xì)胞核組合在一起得到的細(xì)胞稱為胞質(zhì)雜種。 概念二：來自兩個(gè)原生質(zhì)體融合產(chǎn)生的細(xì)胞，其中一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核消失后，兩個(gè)親代原生質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)雜交得到的個(gè)體成為胞質(zhì)雜種。 核心概念是細(xì)胞質(zhì)的雜交，不是細(xì)胞核，其中細(xì)胞質(zhì)中存在不同來源的細(xì)胞器，尤其是線粒體和葉綠體,細(xì)胞融合,細(xì)胞融合(Cell fusion)：又稱體細(xì)胞雜交，是指使用人工方法使兩個(gè)或兩個(gè)以上的體細(xì)胞合并形成一個(gè)細(xì)胞，使之分化再生，形成新物種或新品種的技術(shù)。 細(xì)胞融合方法包含人工方法和無性方法 1、人工方法：是指在外力使用誘導(dǎo)劑或促融劑、電場、磁場、超聲波、重力、激光等因素的作用。 2、無性方式：是區(qū)別

9、于有性方式而言的，有自然條件下，生殖細(xì)胞卵子和精子相互接觸會發(fā)生細(xì)胞融合的現(xiàn)象,1838-1875年：在血液組織中發(fā)現(xiàn)有多核細(xì)胞； 20世紀(jì)50年代：日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)仙臺病毒可以引起細(xì)胞的融合； 1965年：英國的科學(xué)家海利斯成功得到了融合細(xì)胞； 1964年：HAT（次黃嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脫氧核苷(thymidin) ）選擇培養(yǎng)基應(yīng)用于融合細(xì)胞的選擇； 1974年：加拿大華裔科學(xué)家高國楠發(fā)現(xiàn)聚乙二醇（PEG）能夠促使 植物的原生質(zhì)體融合； 1982年：出現(xiàn)了電融合技術(shù)； 近20年：從細(xì)胞融合的理論和實(shí)踐兩個(gè)方面進(jìn)行了大量研究，細(xì)胞融合的方法

10、不斷更新和完善，融合率逐步提高,細(xì)胞融合技術(shù)的發(fā)展史,幾種細(xì)胞融合成功的例子,細(xì)胞融合的類型,異核體：來自兩個(gè)不同基因型的細(xì)胞融合成的融合細(xì)胞。 同核體：基因型相同的細(xì)胞融合成的融合細(xì)胞。 細(xì)胞融合包括對稱融合和不對稱融合。 1、對稱融合：兩個(gè)完整的細(xì)胞間的融合。 2、不對稱融合：其中一個(gè)細(xì)胞通過物理、化學(xué)或者生物的方法使該細(xì)胞的細(xì)胞核或者細(xì)胞質(zhì)失活后再與另一個(gè)完整的細(xì)胞進(jìn)行的融合,細(xì)胞融合的過程,1、兩原生質(zhì)體或者細(xì)胞彼此靠近； 2、質(zhì)膜融合形成細(xì)胞橋； 3、胞質(zhì)滲透； 4、細(xì)胞核融合,細(xì)胞橋的形成過程,植物細(xì)胞融合過程,人造小鼠培育過程示意圖,細(xì)胞融合的意義,改造細(xì)胞遺傳物質(zhì) 生產(chǎn)抗腫瘤疫

11、苗 生產(chǎn)單克隆抗體 用于基因定位 用于動物育種 有利于基礎(chǔ)理論研究,細(xì)胞融合基本原理,1、細(xì)胞膜表面親水性結(jié)構(gòu)糖蛋白 細(xì)胞融合的關(guān)鍵是要脂雙層的接觸，就是要去除糖蛋白，露出無糖蛋白覆蓋的區(qū)域，使兩個(gè)細(xì)胞的脂雙層能緊密結(jié)合,2、病毒促進(jìn)細(xì)胞融合 很多病毒都具有凝集細(xì)胞的能力，其原理大致如下：病毒的一邊黏接在一個(gè)細(xì)胞表面，病毒的另一邊黏接在另一個(gè)細(xì)胞表面，從而使兩個(gè)細(xì)胞在病毒的作用下靠近發(fā)生凝結(jié)。 仙臺病毒促進(jìn)細(xì)胞融合的有效部位在于它的膜，病毒被膜上的兩種糖蛋白（HA、NA和F蛋白）可和細(xì)胞膜表面的糖蛋白發(fā)生作用，相互結(jié)合，在電鏡下觀察到在相接觸的相鄰細(xì)胞表面之間產(chǎn)生一些微小的細(xì)胞質(zhì)橋,3、化學(xué)誘

12、導(dǎo)細(xì)胞融合（聚乙二醇PEG） PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合的兩種方式： PEG含有醚鍵、帶負(fù)電性可與細(xì)胞表面正的極性集團(tuán)相連，引起細(xì)胞膜表面的蛋白起作用，使細(xì)胞相互凝集，膜蛋白質(zhì)分子重排，脂類分子重排，打開質(zhì)膜，細(xì)胞融合。 PEG和水之間的氫鍵相結(jié)合，使溶液中的自由水消失，導(dǎo)致細(xì)胞脫水而發(fā)生膜結(jié)構(gòu)的變化，使細(xì)胞相互凝集，膜蛋白質(zhì)分子重排，脂類分子重排，打開質(zhì)膜，細(xì)胞融合,4、電場誘導(dǎo)細(xì)胞融合 低壓交流電場中，細(xì)胞聚集成串珠狀緊密排列，相互接觸的細(xì)胞膜之間會出現(xiàn)無蛋白顆粒的脂質(zhì)區(qū)，當(dāng)受到電擊時(shí)，這個(gè)區(qū)域就會被擊穿，產(chǎn)生脂雙層膜孔，導(dǎo)致細(xì)胞之間的細(xì)胞質(zhì)連通，發(fā)生細(xì)胞融合。 細(xì)胞置于非常高的電場中，細(xì)胞膜就變

13、得具有通透性，能讓外界的分子擴(kuò)散進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，這一現(xiàn)象稱為電穿孔,動物細(xì)胞融合 1、細(xì)胞種類和性質(zhì) 細(xì)胞表面性質(zhì) 細(xì)胞種類 2、環(huán)境條件的影響 溫度： pH：最適為7.4-7.8 氧氣含量：耗氧量較大，一般大于20% 3、離子強(qiáng)度及離子種類 細(xì)胞融合時(shí)需要Ca 2，最適為0.1mol/L,細(xì)胞融合的影響因素,植物或微生物細(xì)胞融合 1、PEG誘導(dǎo)融合的時(shí)間 2、PEG純度 3、融合密度 一般為2x1048x104個(gè)/ml 4、融合液中加入少量的CaCI2 5、其他添加組份,互補(bǔ)作用：親本細(xì)胞的性狀同時(shí)在雜種細(xì)胞中表現(xiàn)。 激活作用：親本細(xì)胞的不活動基因在雜種細(xì)胞表達(dá)。 如只能合成RNA而不能合成DNA

14、的小鼠巨噬細(xì)胞，與Hela細(xì)胞融合，融合后的細(xì)胞則可以合成兩種核酸。 消失作用：親本細(xì)胞的性狀在雜種細(xì)胞中消失。 如金黃倉鼠的黑色素瘤細(xì)胞可產(chǎn)生黑色素，小鼠的成纖維細(xì)胞不能產(chǎn)生黑色素，它們的雜種細(xì)胞不能產(chǎn)生黑色素。 同時(shí)具有激活和消失作用 如小鼠的胸腺細(xì)胞具有t12抗原基因和h2抗原基因，在胚胎發(fā)育早期t12基因表達(dá)，h2基因不表達(dá)，在成年小鼠中h2基因表達(dá)，t12基因不表達(dá)，而在成年小鼠的胸腺細(xì)胞與小鼠胚胎性瘤細(xì)胞融合的雜種細(xì)胞中，h2基因不表達(dá)，卻激活了t12基因，使其表達(dá),融合細(xì)胞特性的表現(xiàn)形式,融合細(xì)胞篩選有兩大類：一類是根據(jù)遺傳和生理生化特性的互補(bǔ)選擇法；一類是根據(jù)可見標(biāo)記形狀的機(jī)械

15、選擇法。 抗藥性篩選系統(tǒng) 如親本A對氨芐青霉素敏感，對卡那霉素不敏感，親本B對氨芐青霉素不敏感，對卡那霉素敏感，融合后的細(xì)胞對兩種抗生素都不敏感。 營養(yǎng)互補(bǔ)篩選系統(tǒng) 親本A為色氨酸缺陷型，親本B為蘇氨酸缺陷型，融合細(xì)胞可以在不含色氨酸和蘇氨酸的培養(yǎng)平板上生長。 溫度敏感突變型融合細(xì)胞篩選 親本A具有卡那霉素抗性但只能在37度生長，親本B為高溫敏感突變型，不具備卡那霉素抗性，融合細(xì)胞能在高溫和卡那霉素抗性平板生長,融合細(xì)胞的篩選,物理特性篩選 利用細(xì)胞在形態(tài)、大小、顏色上的差別可以在顯微鏡下用微管將融合細(xì)胞吸取挑選出來，也可以用離心的方式。 熒光表記法利用發(fā)綠色熒光的異硫氰酸熒光素和發(fā)紅色熒光的

16、堿性芯香紅熒光素分別標(biāo)記兩個(gè)親本細(xì)胞，融合后的細(xì)胞內(nèi)存在兩種熒光標(biāo)記物，利用流式細(xì)胞儀可進(jìn)行分選,細(xì)胞融合的材料-原生質(zhì)體,原生質(zhì)體（protoplast）：去除細(xì)胞壁后裸露的球型細(xì)胞。 原生質(zhì)體主要是植物細(xì)胞，植物細(xì)胞壁主要成份為纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)和少量蛋白質(zhì)。 原生質(zhì)體雖然沒有細(xì)胞壁，但仍能進(jìn)行基本的生命活動，在離體培養(yǎng)下可再生細(xì)胞壁,植物原生質(zhì)體的特點(diǎn)： 1、吸收能力增強(qiáng)：易于攝取外來遺傳物質(zhì)、細(xì)胞器、細(xì)菌、病毒等；易于吸收氧、養(yǎng)分； 2、具有全能性：具有全套的遺傳物質(zhì)，具有細(xì)胞壁再生并能進(jìn)行人工培養(yǎng)分化發(fā)育成完整植株的能力； 3、在一定條件下可誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合，形成雜種細(xì)胞 。

17、4、分泌能力提高：去除了細(xì)胞壁的擴(kuò)散障礙，使細(xì)胞膜的透過性增強(qiáng)，利于胞內(nèi)產(chǎn)物的分泌。 5、穩(wěn)定性較差：失去了細(xì)胞壁的保護(hù)作用，穩(wěn)定性較差，易于受到滲透壓等條件變化的影響,原生質(zhì)體用途,原生質(zhì)體的制備,植物葉片 取材容易 比較容易用酶解法分離 * 植物根尖組織 可由各種植物的種子萌發(fā)后取得 * 植物花粉 產(chǎn)生單倍體原生質(zhì)體 * 愈傷組織、懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞 細(xì)胞壁容易解離,材料來源,原生質(zhì)體制備的前提是去除細(xì)胞壁，通常使用機(jī)械法和生物酶法。 機(jī)械法：細(xì)胞放入高滲糖溶液中，質(zhì)壁分離，剪碎組織，在這個(gè)過程中，有些質(zhì)壁分離的細(xì)胞只被切去了細(xì)胞壁，從而釋放出完整的原生質(zhì)體。產(chǎn)量低；方法繁瑣費(fèi)力；局限性大。分

18、生組織和其他液泡化程度不高的細(xì)胞中分離原生質(zhì)體時(shí)不能用此法,生物酶法：利用酶處理細(xì)胞壁，從而釋放出原生質(zhì)體。條件溫和、原生質(zhì)體完整性好、活力高、收率高。 纖維素酶類（Cellulase）：從綠色木霉中提取。 果膠酶類（Pectolyase）：也叫離析酶，從根霉、黑曲霉中提取。 半纖維素酶（Hemicellulase）：從黑曲霉中提取。常用于從愈傷組織中分離原生質(zhì)體。 崩潰酶 蝸牛酶,過濾、離心,加果膠酶 和纖維素酶,原生質(zhì)體分離過程（以葉片為例,原生質(zhì)體純化的方法： 去除破碎的原生質(zhì)體、未去壁的細(xì)胞、細(xì)胞器及其他碎片等雜質(zhì)。 (1) 沉降法：利用比重原理，在具有一定滲透壓的溶液中，先進(jìn)行過濾（44-169m的篩網(wǎng)），然后低速離心（900-4500r/min)，使純凈完整的原生質(zhì)體沉積于試管底部 。比較簡單 ，但不易除盡一些完整的細(xì)胞，或引起原生質(zhì)的破碎。 (2) 漂浮法 ：采用比原生質(zhì)體比重大的高滲溶液，使原生質(zhì)體漂浮在溶液表面?？梢缘玫捷^為純凈、完整的原生質(zhì)體， 但完好的原生質(zhì)體數(shù)量較少,500mmol/L蔗糖,140mmol/L蔗糖+360mmol/L山梨醇,100mmol/LCaCL2+300mmol/L山梨醇