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文檔簡介
1、a,細胞內(nèi)溶酶體和線粒體的熒光活體染色,a,實驗原理,Mito-Tracker Green是一種線粒體(mitochondria)綠色熒光探針,可以用于活細胞線粒體特異性熒光染色。Mito-TrackerGreen為采用MolecularProbes公司的carbocyanine進行了熒光標記的一種Mito-Tracker,分子量為671.88,可以用作線粒體特異性的熒光探針。和rhodamine123或JC-1相比,Mito-Tracker Green對于線粒體的染色不依賴于線粒體膜電位,a,實驗原理,Lyso-Tracker Red是一種溶酶體(lysosome)紅色熒光探針,可以用于活細
2、胞溶酶體特異性熒光染色。Lyso-Tracker Red為采用Molecular Probes公司的DND 99進行了熒光標記的帶有弱堿性的熒光探針,可以選擇性地滯留在偏酸性的溶酶體中,從而實現(xiàn)對于溶酶體的特異性熒光標記。中性紅(NeutralRed)和吖啶橙(Acridine Orange)也都可以對溶酶體進行熒光染色,但中性紅和吖啶橙的染色缺乏特異性,a,1.實驗?zāi)康?掌握熒光顯微鏡工作的原理 了解細胞器在細胞內(nèi)的分布 了解熒光染料的使用方法,a,Lyso-Tracker Red工作液的配制,a. 取少量Lyso-Tracker Red按照1:13333-1:20000的比例加入到細胞培養(yǎng)
3、液或適當(dāng)?shù)娜芤?例如含鈣鎂離子的HBSS)中,使 最終濃度為50-75nM。例如取1l Lyso-Tracker Red加入到20ml或13.33ml細胞培養(yǎng)液或適當(dāng)?shù)娜芤?例如含鈣鎂離子的 HBSS)中,a,2. 溶酶體的熒光標記: a. 去除細胞培養(yǎng)液,加入步驟1配制好的并28預(yù)溫育的Lyso-Tracker Red染色工作液,與細胞28共孵育30分鐘。 b. 去除Lyso-Tracker Red染色工作液,加入500微升預(yù)溫的新鮮的細胞培養(yǎng)液或PBS漂洗。 c. 取出蓋玻片,在載玻片上滴一滴PBS,將蓋玻片反扣在載玻片上,熒光觀察 d. 用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡進行觀察。此時可觀察
4、到溶酶體呈明亮的強熒光染色。如果染色效果欠佳,可以提高Lyso-Tracker Red染色工作液中Lyso-Tracker Red的濃度或在推薦的時間范圍內(nèi)適當(dāng)延長染色時間,a,使用說明,1. Mito-Tracker Green儲存液的配制: 用無水DMSO(anhydrous dimethylsulfoxide)配制Mito-Tracker Green至終濃度為1mM。配制后可以-20或更低溫度避光保 存,a,2. Mito-Tracker Green工作液的配制: a. 取少量1mM Mito-Tracker Green儲存液按照1:5000-1:50000的比例加入到細胞培養(yǎng)液或適當(dāng)?shù)?/p>
5、溶液(例如含鈣鎂離子的 HBSS)中,使最終濃度為20-200nM。例如取1l Mito-Tracker Green加入到50ml或5ml細胞培養(yǎng)液或適當(dāng)?shù)娜芤?例如含鈣鎂離子的HBSS)中。混勻后即為Mito-Tracker Green工作液。HBSS with Ca2+ & Mg2+ (C0219) 可以向碧云天訂購,a,b. Mito-Tracker Green工作液使用前需28預(yù)溫育。 注:工作液中Mito-Tracker Green的濃度可以根據(jù)實際情況進行適當(dāng)調(diào)整。為降低背景,在染色效果可以接受的范圍內(nèi),建議盡量使用較低濃度的Mito-Tracker Green。 3. 線粒體的熒
6、光標記: a. 去除細胞培養(yǎng)液,加入步驟2配制好的并28預(yù)溫育的Mito-Tracker Green染色工作液,與細胞28共孵育15-45分 鐘。 b. 去除Mito-Tracker Green染色工作液,加入500微升28預(yù)溫育的新鮮細胞培養(yǎng)液或PBS漂洗。 c. 取出蓋玻片,在載玻片上滴一滴PBS,將蓋玻片反扣在載玻片上,熒光觀察。 d. 用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡進行觀察。此時可觀察到線粒體呈明亮的強熒光染色。如果染色效果欠佳,可以提高Mito-Tracker Green染色工作液中Mito-Tracker Green的濃度或在推薦的時間范圍內(nèi)適當(dāng)延長染色時間,a,1 打開可將光和激發(fā)光光源(預(yù)熱10分鐘) 2遮光
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