紫外-可見分光光度法

1、紫外-可見分光光度法紫外-可見分光光度法1簡述紫外-可見分光光度法是在190-80Onm波長范圍內(nèi)測定物質(zhì)的吸光度，用于鑒 別、雜質(zhì)檢查和含量測定的方法。定量分析通常選擇物質(zhì)的最大吸收波長處測出吸光度，然后用對照品或吸收系數(shù)求算出被測物質(zhì)的含量，多用于制劑的含量測定；對已知物質(zhì)定性可用吸收峰波 長或吸光度比值作為鑒別方法；若該物質(zhì)本身在紫外光區(qū)無吸收，而其雜質(zhì)在紫外 光區(qū)有相當強度的吸收，或雜質(zhì)的吸收峰處該物質(zhì)無吸收，則可用本法作雜質(zhì)檢查。物質(zhì)對紫外輻射的吸收是由于分子中原子的外層電子躍遷所產(chǎn)生，因此，紫外 吸收主要決定于分子的電子結(jié)構(gòu)，故紫外光譜又稱電子光譜。有機化合物分子結(jié)構(gòu) 中如含有共軛

2、體系、芳香環(huán)等發(fā)色基團，均可在紫外區(qū)（200400nm）或可見光區(qū)（400850nm）產(chǎn)生吸收。通常使用的紫外-可見分光光度計的工作波長范圍為 190900nm。紫外吸收光譜為物質(zhì)對紫外區(qū)輻射的能量吸收圖。朗伯-比爾（Lambert-Beer）定律為光的吸收定律，它是紫外-可見分光光度法定量分析的依據(jù)，其數(shù)學表達式為：1A=log 二ECL式中 A為吸光度；T為透光率；E為吸收系數(shù)；C為溶液濃度；L為光路長度。如溶液的濃度（C）為1%（g/ml），光路長度（L ）為lcm，相應的吸光度即為吸收系數(shù)以丘醫(yī)表示。如溶液的濃度（C）為摩爾濃度（mol/L），光路長度為lcm 時，則相應有吸收系數(shù)為摩

3、爾吸收系數(shù)，以 表示。2儀器紫外-可見分光光度計主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、記錄儀、顯示系 統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等部分組成。為了滿足紫外-可見光區(qū)全波長范圍的測定，儀器備有二種光源，即氘燈和碘鎢 燈，前者用于紫外區(qū)，后者用于可見光區(qū)。單色器通常由進光狹縫、出光狹縫、平行光裝置、色散元件，聚焦透鏡或反射 鏡等組成。色散元件有棱鏡和光柵二種，棱鏡多用天然石英或熔融硅石制成，對 200400nm波長光的色散能力很強，對600nm以上波長的光色散能力較差，棱鏡色 散所得的光譜為非勻排光譜。光柵系將反射或透射光經(jīng)衍射而達到色散作用，故常 稱為衍射光柵，光柵光譜是按波長作線性排列，故為勻排光譜，雙光束

4、儀器多用光 柵為色散元件。檢測器有光電管和光電倍增管二種。紫外-可見分光光度計依據(jù)其結(jié)構(gòu)和測量操作方式的不同可分為單光束和雙光 束分光光 度計二類。單光束分光光度計有些仍為手工操作，即固定在某一波長， 分別測量比較空白、樣品或參比的透光率或吸收度，操作比較費時，用于繪制吸收 光譜圖時很不方便，但適用于單波長的含量測定。雙光束分光光度計藉扇形鏡交替 切換光路使分成樣品（S）和參比（R）兩光束，并先后到達檢測器，檢測器信號經(jīng) 調(diào)制分離成兩光路對應信號，信號的比值可直接用記錄儀記錄，雙光束分光光度計 操作簡單，測量快速，自動化程度高，但作含量測定時，為求準確起見，仍宜用固 定波長測量方式。3紫外-可

5、見分光光度計的檢定3.1波長準確度3.1.1波長準確度的允差范圍紫外-可見分光光度計波長準確度允許誤差，紫外區(qū)為 .0nm，500nm處2.0nm，700nm處4.8nm。3.1.2波長準確度檢定方法3.121用低壓汞燈檢定關閉儀器光源，將汞燈（用筆式汞燈最方便）直接對準 進光狹 縫，如為雙光束儀器，用單光束能量測定方式，采用波長掃描方式，掃描速度 慢”（如I5nm/min ）、響應 快”、最小狹縫寬度（如0.1 nm ）、量程0100%，在200800nm范圍內(nèi)單方向重復掃描3次,由儀器識別記錄各峰值（若儀器無 峰檢測” 功能，必要時可對指定波長進行 單峰”掃描）單光束儀器以751G型為例，

6、可將選擇開關放在 X）.1位置，透光率讀數(shù)放在100（或選擇開關放在X，透光率放在10）,關小狹縫，打開光閘門，緩緩轉(zhuǎn)動波長盤， 尋找汞燈546.07nm峰出現(xiàn)的位置，若與波長讀數(shù)不符，應調(diào)節(jié)儀器左側(cè)準直鏡的波 長調(diào)整螺絲，如波長向短波長方向移動，應順時針方向旋轉(zhuǎn)波長調(diào)整螺絲，如向長 波方向移動，則應反時針方向旋轉(zhuǎn)波長調(diào)整螺絲，調(diào)整好后，再按汞燈的下列譜線 測試，記錄每條譜線與儀器波長讀數(shù)的誤差。用于檢定紫外-可見分光光度計的汞燈譜線波長：237.83、253.65 275.28、2g6.73、 302.15、313.16、334.15、365.02、365.48 366.33、404.66

7、（紫色）、435.83 （藍色）、 546.07 （綠色）、576.96 （黃色）及 579.07nm。3.1.2.2用儀器固有的氘燈檢定本法主要用于日常工作中波長準確度的核對。取單光束能量測定方式，測量條件同上述低壓汞燈的方法，對486.02及656.10nm二單峰進行單方向重復掃描3次。3.1.2.3用氧化欽玻璃檢定將氧化欽玻璃放大樣品光路，參比光路為空氣，按測定吸收光譜圖方法測定。校正自動記錄儀器時，應考慮記錄儀的時間常數(shù)，測定樣 品與校正時取同一掃描速度。氧化欽玻璃在 27g.4、287.5、333.7、36O.g、418.7、460.0、484.5 536.2及637.5nm 波長處

8、有尖銳的吸收峰，可供波長檢定用。氧化欽玻璃因制造的原因，每片氧化欽 的吸收峰波長有差異，另外，在放置過程中也會發(fā)生波長漂移，因此需定期由計量 部門校驗。3.1.2.4用高氯酸欽溶液檢定本法可供沒有單光束測定功能的雙光束紫外分光光度計波長準確度檢定用。高氯酸欽溶液的配制方法：取10姑高氯酸為溶劑，加入氧化欽（HO203）配成4% 溶液即得。高氯酸欽溶液較強的吸收峰波長為 241.13、278.10、287.18、333.44、345.47、 361.31、416.28 451.30、485.29 536.64 640.52nm。如果是雙光束掃描儀器，但不是數(shù)據(jù)貯存型的（指是直接將信號描記于記錄紙

9、 上），記錄的波長可能因記錄筆滯后而非真實波長，為了準確測定，建議采用定點 檢定而不用掃描方式。3.2 吸光度準確度精密稱取在120C干燥至恒重的基準重鉻酸鉀約60mg，置1000m1量瓶中，用0.005mol/L硫酸液溶解并稀釋至1000ml，用配對的Icm石英池， 以0.005moI/L硫酸液為空白，在235, 257, 313, 350nm分別測定吸光度，然后換算 成E；cm，測得值應符合下表中規(guī)定的允差范圍。分光光度法允差范圍波支長（nm）吸收強度吸收系數(shù)（E；cm）允差范圍235最小124.5123.0 126.257最大144.00313最小48.62142.8 146.350最大

10、106.6247.0 50.3105.5 108.5分辨率、雜散光、基線平直度、穩(wěn)定度、絕緣電阻等項檢定，按國家技術監(jiān)督局雙光束紫外-可見分光光度計檢定規(guī)程” JG682-90,并應符合有關項下的規(guī)度。應根 據(jù)日常使用中，對以上兩項，即波長和吸光度準確需要隨時檢查。4樣品測定操作方法4.1吸收系數(shù)測定（性狀項下）按各品種項下規(guī)定的方法配制供試品溶液，在規(guī)定 的波長（參見5.8項）測定其吸光度，并計算吸收系數(shù)，應符合規(guī)定范圍。4.2鑒別及檢查按各品種項下的規(guī)定，測定供試品溶液的最大及最小吸收波長， 有的并須測定其在最大吸收波長與最小吸收波長處的吸光度比值，均應符合規(guī)定。4.3含量測定4.3.1對

11、照品比較法 按各品種項下規(guī)定的方法，分別配制供試品溶液和對照品溶 液，對照品溶液中所含被測成分的量應為供試品溶液中被測成分標示量的（1000） %以內(nèi)，用同一溶劑，在規(guī)定的波長處測定供試品溶液和對照品溶液的吸光度4.3.2吸收系數(shù)法 按各品種項下配制供試品溶液，在規(guī)定的波長及該波長i2nm處測定其吸光度，按各該品種在規(guī)定條件下給出的吸收系數(shù)計算含量。采用吸收系數(shù)法應對儀器進行校正后測定，如為測定新品種的吸收系數(shù)，需按 后列吸收系數(shù)測定法”的規(guī)定進行。4.3.3計算分光光度法按中國藥典規(guī)定，計算分光光度法一般不宜用于含量測定，對于少數(shù)采用計算分光光度法的品種，應嚴格按各品種項下規(guī)定的方法進行。

12、用本法時應注意：有一些吸光度是在待測成分吸收曲線的上升或下降陡坡處測定， 影響精度的因素較多，故應仔細操作，盡量使供試品和對照品的測定條件一致。若 該品種不用對照品，如維生素A測定法（見中國藥典附錄），則應在測定前對儀器作 仔細的校正和檢定。注意事項5.1試驗中所用的量瓶和移液管均應經(jīng)檢定校正、洗凈后使用 5.2使用的石英吸收池必須潔凈。當吸收池中裝入同一溶劑，在規(guī)定波長測定各吸 收池的透光率，如透光率相差在 0.3%以下者可配對使用，否則必須加以校正。5.3取吸收池時，手指拿毛玻璃面的兩側(cè)。裝樣品溶液的體積以池體積的4/5為度,使用揮發(fā)性溶液時應加蓋，透光面要用擦鏡紙由上而下擦拭干凈，檢視應

13、無殘留溶 劑，為防止溶劑揮發(fā)后溶質(zhì)殘留在池子的透光面，可先用蘸有空白溶劑的擦鏡紙擦 拭，然后再用干擦鏡紙拭凈。吸收池放入樣品室時應注意每次放入方向相同。使用 后用溶劑及水沖洗干凈，晾干防塵保存，吸收池如污染不易洗凈時可用硫酸發(fā)煙硝 酸（3:1v/v）混合液稍加浸泡后，洗凈備用。如用鉻酸鉀清潔液清洗時，吸收池不 宜在清潔液中長時間浸泡，否則清潔液中的鉻酸鉀結(jié)晶會損壞吸收池的光學表面， 并應充分用水沖洗，以防鉻酸鉀吸附于吸收池表面。5.4測定前應先檢查所用的溶劑在測定供試品所用的波長附近是否符合要求，可用Icm石英吸收池盛溶劑以空氣為空白（即參比光路中不放置任何物質(zhì)）測定其吸光度，應符合下表規(guī)定，

14、并不得在溶劑的截止使用波長以下測定。以空氣為空白測定溶劑在不同波長處的吸光度的規(guī)定波長范圍220240241250251300300以上(nm)吸光度0.40.20.10.05每次測定時應采用同一廠牌批號，混合均勻的同批溶劑。5.5稱量應按藥典規(guī)定要求。配制測定溶液時稀釋轉(zhuǎn)移次數(shù)應盡可能少，轉(zhuǎn)移稀釋 時所取容積一般應不少于5ml。含量測定時供試品應稱取2份，如為對照品比較法， 對照品一般也應稱取2份。吸收系數(shù)檢查也應稱取供試品2份，平行操作，每份結(jié)果 對平均值的偏差應在).5%以內(nèi)。作鑒別或檢查可取樣品1份。5.6供試品溶液的濃度，除各品種項下已有注明者外，供試品溶液的吸光度以在 0.30.7

15、之間為宜，吸光度讀數(shù)在此范圍誤差較小，并應結(jié)合所用儀器吸光度線性范 圍，配制合適的讀數(shù)濃度。5.7選用儀器的狹縫譜帶寬度應小于供試品吸收帶半高寬的10%，否則測得的吸光度值會偏低，或以減小狹縫寬度時供試品溶液的吸光度不再增加為準，對于中國藥 典紫外測定的大部分品種，可以使用2nm縫寬，但當吸收帶的半高寬小于2Onm時, 則應使用較窄的狹縫，例如青霉素鉀及鈉的吸光度檢查需用Inm縫寬或更窄，否則其264nm的吸光度會偏低。5.8測定時除另有規(guī)定者外，應在規(guī)定的吸收峰i2nm處，再測幾點的吸光度，以核對供試品的吸收峰位置是否正確，并以吸光度最大的波長作為測定波長，除另有 規(guī)定外吸光度最大波長應在該

16、品種項下規(guī)定的波長吃nm以內(nèi)，否則應考慮試樣的同一性、純度以及儀器波長的準確度。5.9用于制劑含量測定時，應注意供試液與對照液的pH值是否一致，如pH值對吸收有影響，則應調(diào)溶液的pH值一致后再測定吸光度。6結(jié)果計算6.1對照品比較法可根據(jù)供試品溶液及對照品溶液的吸光度與對照品溶液的濃度以正比法算出供試品溶液的濃度，再計算含量。C樣品=A樣品 XC 對照 /A 對照式中 A為吸光度值;C為測試液濃度(以mg/ml計)。6.2吸收系數(shù)法 中國藥典規(guī)定的吸收系數(shù)，系指 E；cm，即在指定波長時，光路長度為lcm，試樣濃度換算為1% （g/ml）時的吸光度值，故應先求被測樣品的 E值, 再與規(guī)定的E醫(yī)

17、值比較，可計算出供試樣品的含量。1%Eicm（樣品）式中A為供試品溶液測得的吸光度值C為供試品溶液的百分濃度，即100ml中所含溶質(zhì)的克數(shù)（g/ml）L為吸收池的光路長度（cm）供試品的含量%=1%E1cm（樣品）1%E 1cm（標準）X100式中E；cm （樣品）為根據(jù)前式計算出的供試品吸收系數(shù)E；cm （標準）為藥典或藥品標準中規(guī)定的吸收系數(shù)吸收系數(shù)測定法本法主要用于新品種的吸收系數(shù)測定。7.1測定方法取精制樣品精密稱取一定量，使樣品溶液配成吸光度讀數(shù)在0.60.8之間，置IC m吸收池中，在規(guī)定波長處按5.8項的規(guī)定測出吸光度讀數(shù)，然后再用同 批溶劑將溶液稀釋1倍，使吸光度在0.30.4

18、之間，再按上述方法測定。樣品應同時 測定2份，同一臺儀器測定的2份結(jié)果，對平均值的偏差應不超過 ）.3%，否則應重 新測定。測定時，先按儀器正常靈敏度測試，然后再減小狹縫測定，直到減小狹縫吸光值不增加為止，取吸光度不改變的數(shù)據(jù)。再用4臺不同型號的儀器復測。吸收系數(shù)可根據(jù)朗伯-比爾定律求算，以下例說明：已知某化合物的分子量為 287,用乙醇配成濃度為 0.0030%的溶液，在波長 297nm處，用ICm石英池，測得吸光度為0.613g,求E值及摩爾吸收系數(shù) 值。E1X 297nm=A/CL=0614 =2050.0030 1297nm = A/CL=0.6140.00301000100-=58747.2測定注意事項 7.2.1樣品應為精制品，水分應另取樣測定，扣除干燥失重。722所用的容量儀器及分析天平應經(jīng)過檢定，如有相差應加上校正值。723測定所用的溶劑，其吸收度應符合規(guī)定。吸收池應于臨用時配對或作空白校 正。7.2.4稱取樣品時，其稱量準確度應按中國藥典規(guī)定要