紫外-可見(jiàn)分光光度法

1、紫外-可見(jiàn)分光光度法紫外-可見(jiàn)分光光度法1簡(jiǎn)述紫外-可見(jiàn)分光光度法是在190-80Onm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定物質(zhì)的吸光度，用于鑒 別、雜質(zhì)檢查和含量測(cè)定的方法。定量分析通常選擇物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)出吸光度，然后用對(duì)照品或吸收系數(shù)求算出被測(cè)物質(zhì)的含量，多用于制劑的含量測(cè)定；對(duì)已知物質(zhì)定性可用吸收峰波 長(zhǎng)或吸光度比值作為鑒別方法；若該物質(zhì)本身在紫外光區(qū)無(wú)吸收，而其雜質(zhì)在紫外 光區(qū)有相當(dāng)強(qiáng)度的吸收，或雜質(zhì)的吸收峰處該物質(zhì)無(wú)吸收，則可用本法作雜質(zhì)檢查。物質(zhì)對(duì)紫外輻射的吸收是由于分子中原子的外層電子躍遷所產(chǎn)生，因此，紫外 吸收主要決定于分子的電子結(jié)構(gòu)，故紫外光譜又稱電子光譜。有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu) 中如含有共軛

2、體系、芳香環(huán)等發(fā)色基團(tuán)，均可在紫外區(qū)（200400nm）或可見(jiàn)光區(qū)（400850nm）產(chǎn)生吸收。通常使用的紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的工作波長(zhǎng)范圍為 190900nm。紫外吸收光譜為物質(zhì)對(duì)紫外區(qū)輻射的能量吸收?qǐng)D。朗伯-比爾（Lambert-Beer）定律為光的吸收定律，它是紫外-可見(jiàn)分光光度法定量分析的依據(jù)，其數(shù)學(xué)表達(dá)式為：1A=log 二ECL式中 A為吸光度；T為透光率；E為吸收系數(shù)；C為溶液濃度；L為光路長(zhǎng)度。如溶液的濃度（C）為1%（g/ml），光路長(zhǎng)度（L ）為lcm，相應(yīng)的吸光度即為吸收系數(shù)以丘醫(yī)表示。如溶液的濃度（C）為摩爾濃度（mol/L），光路長(zhǎng)度為lcm 時(shí)，則相應(yīng)有吸收系數(shù)為摩

3、爾吸收系數(shù)，以 表示。2儀器紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)主要由光源、單色器、樣品室、檢測(cè)器、記錄儀、顯示系 統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等部分組成。為了滿足紫外-可見(jiàn)光區(qū)全波長(zhǎng)范圍的測(cè)定，儀器備有二種光源，即氘燈和碘鎢 燈，前者用于紫外區(qū)，后者用于可見(jiàn)光區(qū)。單色器通常由進(jìn)光狹縫、出光狹縫、平行光裝置、色散元件，聚焦透鏡或反射 鏡等組成。色散元件有棱鏡和光柵二種，棱鏡多用天然石英或熔融硅石制成，對(duì) 200400nm波長(zhǎng)光的色散能力很強(qiáng)，對(duì)600nm以上波長(zhǎng)的光色散能力較差，棱鏡色 散所得的光譜為非勻排光譜。光柵系將反射或透射光經(jīng)衍射而達(dá)到色散作用，故常 稱為衍射光柵，光柵光譜是按波長(zhǎng)作線性排列，故為勻排光譜，雙光束

4、儀器多用光 柵為色散元件。檢測(cè)器有光電管和光電倍增管二種。紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)依據(jù)其結(jié)構(gòu)和測(cè)量操作方式的不同可分為單光束和雙光 束分光光 度計(jì)二類。單光束分光光度計(jì)有些仍為手工操作，即固定在某一波長(zhǎng)， 分別測(cè)量比較空白、樣品或參比的透光率或吸收度，操作比較費(fèi)時(shí)，用于繪制吸收 光譜圖時(shí)很不方便，但適用于單波長(zhǎng)的含量測(cè)定。雙光束分光光度計(jì)藉扇形鏡交替 切換光路使分成樣品（S）和參比（R）兩光束，并先后到達(dá)檢測(cè)器，檢測(cè)器信號(hào)經(jīng) 調(diào)制分離成兩光路對(duì)應(yīng)信號(hào)，信號(hào)的比值可直接用記錄儀記錄，雙光束分光光度計(jì) 操作簡(jiǎn)單，測(cè)量快速，自動(dòng)化程度高，但作含量測(cè)定時(shí)，為求準(zhǔn)確起見(jiàn)，仍宜用固 定波長(zhǎng)測(cè)量方式。3紫外-可

5、見(jiàn)分光光度計(jì)的檢定3.1波長(zhǎng)準(zhǔn)確度3.1.1波長(zhǎng)準(zhǔn)確度的允差范圍紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)波長(zhǎng)準(zhǔn)確度允許誤差，紫外區(qū)為 .0nm，500nm處2.0nm，700nm處4.8nm。3.1.2波長(zhǎng)準(zhǔn)確度檢定方法3.121用低壓汞燈檢定關(guān)閉儀器光源，將汞燈（用筆式汞燈最方便）直接對(duì)準(zhǔn) 進(jìn)光狹 縫，如為雙光束儀器，用單光束能量測(cè)定方式，采用波長(zhǎng)掃描方式，掃描速度 慢”（如I5nm/min ）、響應(yīng) 快”、最小狹縫寬度（如0.1 nm ）、量程0100%，在200800nm范圍內(nèi)單方向重復(fù)掃描3次,由儀器識(shí)別記錄各峰值（若儀器無(wú) 峰檢測(cè)” 功能，必要時(shí)可對(duì)指定波長(zhǎng)進(jìn)行 單峰”掃描）單光束儀器以751G型為例，

6、可將選擇開關(guān)放在 X）.1位置，透光率讀數(shù)放在100（或選擇開關(guān)放在X，透光率放在10）,關(guān)小狹縫，打開光閘門，緩緩轉(zhuǎn)動(dòng)波長(zhǎng)盤， 尋找汞燈546.07nm峰出現(xiàn)的位置，若與波長(zhǎng)讀數(shù)不符，應(yīng)調(diào)節(jié)儀器左側(cè)準(zhǔn)直鏡的波 長(zhǎng)調(diào)整螺絲，如波長(zhǎng)向短波長(zhǎng)方向移動(dòng)，應(yīng)順時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)波長(zhǎng)調(diào)整螺絲，如向長(zhǎng) 波方向移動(dòng)，則應(yīng)反時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)波長(zhǎng)調(diào)整螺絲，調(diào)整好后，再按汞燈的下列譜線 測(cè)試，記錄每條譜線與儀器波長(zhǎng)讀數(shù)的誤差。用于檢定紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的汞燈譜線波長(zhǎng)：237.83、253.65 275.28、2g6.73、 302.15、313.16、334.15、365.02、365.48 366.33、404.66

7、（紫色）、435.83 （藍(lán)色）、 546.07 （綠色）、576.96 （黃色）及 579.07nm。3.1.2.2用儀器固有的氘燈檢定本法主要用于日常工作中波長(zhǎng)準(zhǔn)確度的核對(duì)。取單光束能量測(cè)定方式，測(cè)量條件同上述低壓汞燈的方法，對(duì)486.02及656.10nm二單峰進(jìn)行單方向重復(fù)掃描3次。3.1.2.3用氧化欽玻璃檢定將氧化欽玻璃放大樣品光路，參比光路為空氣，按測(cè)定吸收光譜圖方法測(cè)定。校正自動(dòng)記錄儀器時(shí)，應(yīng)考慮記錄儀的時(shí)間常數(shù)，測(cè)定樣 品與校正時(shí)取同一掃描速度。氧化欽玻璃在 27g.4、287.5、333.7、36O.g、418.7、460.0、484.5 536.2及637.5nm 波長(zhǎng)處

8、有尖銳的吸收峰，可供波長(zhǎng)檢定用。氧化欽玻璃因制造的原因，每片氧化欽 的吸收峰波長(zhǎng)有差異，另外，在放置過(guò)程中也會(huì)發(fā)生波長(zhǎng)漂移，因此需定期由計(jì)量 部門校驗(yàn)。3.1.2.4用高氯酸欽溶液檢定本法可供沒(méi)有單光束測(cè)定功能的雙光束紫外分光光度計(jì)波長(zhǎng)準(zhǔn)確度檢定用。高氯酸欽溶液的配制方法：取10姑高氯酸為溶劑，加入氧化欽（HO203）配成4% 溶液即得。高氯酸欽溶液較強(qiáng)的吸收峰波長(zhǎng)為 241.13、278.10、287.18、333.44、345.47、 361.31、416.28 451.30、485.29 536.64 640.52nm。如果是雙光束掃描儀器，但不是數(shù)據(jù)貯存型的（指是直接將信號(hào)描記于記錄紙

9、 上），記錄的波長(zhǎng)可能因記錄筆滯后而非真實(shí)波長(zhǎng)，為了準(zhǔn)確測(cè)定，建議采用定點(diǎn) 檢定而不用掃描方式。3.2 吸光度準(zhǔn)確度精密稱取在120C干燥至恒重的基準(zhǔn)重鉻酸鉀約60mg，置1000m1量瓶中，用0.005mol/L硫酸液溶解并稀釋至1000ml，用配對(duì)的Icm石英池， 以0.005moI/L硫酸液為空白，在235, 257, 313, 350nm分別測(cè)定吸光度，然后換算 成E；cm，測(cè)得值應(yīng)符合下表中規(guī)定的允差范圍。分光光度法允差范圍波支長(zhǎng)（nm）吸收強(qiáng)度吸收系數(shù)（E；cm）允差范圍235最小124.5123.0 126.257最大144.00313最小48.62142.8 146.350最大

10、106.6247.0 50.3105.5 108.5分辨率、雜散光、基線平直度、穩(wěn)定度、絕緣電阻等項(xiàng)檢定，按國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)檢定規(guī)程” JG682-90,并應(yīng)符合有關(guān)項(xiàng)下的規(guī)度。應(yīng)根 據(jù)日常使用中，對(duì)以上兩項(xiàng)，即波長(zhǎng)和吸光度準(zhǔn)確需要隨時(shí)檢查。4樣品測(cè)定操作方法4.1吸收系數(shù)測(cè)定（性狀項(xiàng)下）按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法配制供試品溶液，在規(guī)定 的波長(zhǎng)（參見(jiàn)5.8項(xiàng)）測(cè)定其吸光度，并計(jì)算吸收系數(shù)，應(yīng)符合規(guī)定范圍。4.2鑒別及檢查按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，測(cè)定供試品溶液的最大及最小吸收波長(zhǎng)， 有的并須測(cè)定其在最大吸收波長(zhǎng)與最小吸收波長(zhǎng)處的吸光度比值，均應(yīng)符合規(guī)定。4.3含量測(cè)定4.3.1對(duì)

11、照品比較法 按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法，分別配制供試品溶液和對(duì)照品溶 液，對(duì)照品溶液中所含被測(cè)成分的量應(yīng)為供試品溶液中被測(cè)成分標(biāo)示量的（1000） %以內(nèi)，用同一溶劑，在規(guī)定的波長(zhǎng)處測(cè)定供試品溶液和對(duì)照品溶液的吸光度4.3.2吸收系數(shù)法 按各品種項(xiàng)下配制供試品溶液，在規(guī)定的波長(zhǎng)及該波長(zhǎng)i2nm處測(cè)定其吸光度，按各該品種在規(guī)定條件下給出的吸收系數(shù)計(jì)算含量。采用吸收系數(shù)法應(yīng)對(duì)儀器進(jìn)行校正后測(cè)定，如為測(cè)定新品種的吸收系數(shù)，需按 后列吸收系數(shù)測(cè)定法”的規(guī)定進(jìn)行。4.3.3計(jì)算分光光度法按中國(guó)藥典規(guī)定，計(jì)算分光光度法一般不宜用于含量測(cè)定，對(duì)于少數(shù)采用計(jì)算分光光度法的品種，應(yīng)嚴(yán)格按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法進(jìn)行。

12、用本法時(shí)應(yīng)注意：有一些吸光度是在待測(cè)成分吸收曲線的上升或下降陡坡處測(cè)定， 影響精度的因素較多，故應(yīng)仔細(xì)操作，盡量使供試品和對(duì)照品的測(cè)定條件一致。若 該品種不用對(duì)照品，如維生素A測(cè)定法（見(jiàn)中國(guó)藥典附錄），則應(yīng)在測(cè)定前對(duì)儀器作 仔細(xì)的校正和檢定。注意事項(xiàng)5.1試驗(yàn)中所用的量瓶和移液管均應(yīng)經(jīng)檢定校正、洗凈后使用 5.2使用的石英吸收池必須潔凈。當(dāng)吸收池中裝入同一溶劑，在規(guī)定波長(zhǎng)測(cè)定各吸 收池的透光率，如透光率相差在 0.3%以下者可配對(duì)使用，否則必須加以校正。5.3取吸收池時(shí)，手指拿毛玻璃面的兩側(cè)。裝樣品溶液的體積以池體積的4/5為度,使用揮發(fā)性溶液時(shí)應(yīng)加蓋，透光面要用擦鏡紙由上而下擦拭干凈，檢視應(yīng)

13、無(wú)殘留溶 劑，為防止溶劑揮發(fā)后溶質(zhì)殘留在池子的透光面，可先用蘸有空白溶劑的擦鏡紙擦 拭，然后再用干擦鏡紙拭凈。吸收池放入樣品室時(shí)應(yīng)注意每次放入方向相同。使用 后用溶劑及水沖洗干凈，晾干防塵保存，吸收池如污染不易洗凈時(shí)可用硫酸發(fā)煙硝 酸（3:1v/v）混合液稍加浸泡后，洗凈備用。如用鉻酸鉀清潔液清洗時(shí)，吸收池不 宜在清潔液中長(zhǎng)時(shí)間浸泡，否則清潔液中的鉻酸鉀結(jié)晶會(huì)損壞吸收池的光學(xué)表面， 并應(yīng)充分用水沖洗，以防鉻酸鉀吸附于吸收池表面。5.4測(cè)定前應(yīng)先檢查所用的溶劑在測(cè)定供試品所用的波長(zhǎng)附近是否符合要求，可用Icm石英吸收池盛溶劑以空氣為空白（即參比光路中不放置任何物質(zhì)）測(cè)定其吸光度，應(yīng)符合下表規(guī)定，

14、并不得在溶劑的截止使用波長(zhǎng)以下測(cè)定。以空氣為空白測(cè)定溶劑在不同波長(zhǎng)處的吸光度的規(guī)定波長(zhǎng)范圍220240241250251300300以上(nm)吸光度0.40.20.10.05每次測(cè)定時(shí)應(yīng)采用同一廠牌批號(hào)，混合均勻的同批溶劑。5.5稱量應(yīng)按藥典規(guī)定要求。配制測(cè)定溶液時(shí)稀釋轉(zhuǎn)移次數(shù)應(yīng)盡可能少，轉(zhuǎn)移稀釋 時(shí)所取容積一般應(yīng)不少于5ml。含量測(cè)定時(shí)供試品應(yīng)稱取2份，如為對(duì)照品比較法， 對(duì)照品一般也應(yīng)稱取2份。吸收系數(shù)檢查也應(yīng)稱取供試品2份，平行操作，每份結(jié)果 對(duì)平均值的偏差應(yīng)在).5%以內(nèi)。作鑒別或檢查可取樣品1份。5.6供試品溶液的濃度，除各品種項(xiàng)下已有注明者外，供試品溶液的吸光度以在 0.30.7

15、之間為宜，吸光度讀數(shù)在此范圍誤差較小，并應(yīng)結(jié)合所用儀器吸光度線性范 圍，配制合適的讀數(shù)濃度。5.7選用儀器的狹縫譜帶寬度應(yīng)小于供試品吸收帶半高寬的10%，否則測(cè)得的吸光度值會(huì)偏低，或以減小狹縫寬度時(shí)供試品溶液的吸光度不再增加為準(zhǔn)，對(duì)于中國(guó)藥 典紫外測(cè)定的大部分品種，可以使用2nm縫寬，但當(dāng)吸收帶的半高寬小于2Onm時(shí), 則應(yīng)使用較窄的狹縫，例如青霉素鉀及鈉的吸光度檢查需用Inm縫寬或更窄，否則其264nm的吸光度會(huì)偏低。5.8測(cè)定時(shí)除另有規(guī)定者外，應(yīng)在規(guī)定的吸收峰i2nm處，再測(cè)幾點(diǎn)的吸光度，以核對(duì)供試品的吸收峰位置是否正確，并以吸光度最大的波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)，除另有 規(guī)定外吸光度最大波長(zhǎng)應(yīng)在該

16、品種項(xiàng)下規(guī)定的波長(zhǎng)吃nm以內(nèi)，否則應(yīng)考慮試樣的同一性、純度以及儀器波長(zhǎng)的準(zhǔn)確度。5.9用于制劑含量測(cè)定時(shí)，應(yīng)注意供試液與對(duì)照液的pH值是否一致，如pH值對(duì)吸收有影響，則應(yīng)調(diào)溶液的pH值一致后再測(cè)定吸光度。6結(jié)果計(jì)算6.1對(duì)照品比較法可根據(jù)供試品溶液及對(duì)照品溶液的吸光度與對(duì)照品溶液的濃度以正比法算出供試品溶液的濃度，再計(jì)算含量。C樣品=A樣品 XC 對(duì)照 /A 對(duì)照式中 A為吸光度值;C為測(cè)試液濃度(以mg/ml計(jì))。6.2吸收系數(shù)法 中國(guó)藥典規(guī)定的吸收系數(shù)，系指 E；cm，即在指定波長(zhǎng)時(shí)，光路長(zhǎng)度為lcm，試樣濃度換算為1% （g/ml）時(shí)的吸光度值，故應(yīng)先求被測(cè)樣品的 E值, 再與規(guī)定的E醫(yī)

17、值比較，可計(jì)算出供試樣品的含量。1%Eicm（樣品）式中A為供試品溶液測(cè)得的吸光度值C為供試品溶液的百分濃度，即100ml中所含溶質(zhì)的克數(shù)（g/ml）L為吸收池的光路長(zhǎng)度（cm）供試品的含量%=1%E1cm（樣品）1%E 1cm（標(biāo)準(zhǔn)）X100式中E；cm （樣品）為根據(jù)前式計(jì)算出的供試品吸收系數(shù)E；cm （標(biāo)準(zhǔn)）為藥典或藥品標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的吸收系數(shù)吸收系數(shù)測(cè)定法本法主要用于新品種的吸收系數(shù)測(cè)定。7.1測(cè)定方法取精制樣品精密稱取一定量，使樣品溶液配成吸光度讀數(shù)在0.60.8之間，置IC m吸收池中，在規(guī)定波長(zhǎng)處按5.8項(xiàng)的規(guī)定測(cè)出吸光度讀數(shù)，然后再用同 批溶劑將溶液稀釋1倍，使吸光度在0.30.4

18、之間，再按上述方法測(cè)定。樣品應(yīng)同時(shí) 測(cè)定2份，同一臺(tái)儀器測(cè)定的2份結(jié)果，對(duì)平均值的偏差應(yīng)不超過(guò) ）.3%，否則應(yīng)重 新測(cè)定。測(cè)定時(shí)，先按儀器正常靈敏度測(cè)試，然后再減小狹縫測(cè)定，直到減小狹縫吸光值不增加為止，取吸光度不改變的數(shù)據(jù)。再用4臺(tái)不同型號(hào)的儀器復(fù)測(cè)。吸收系數(shù)可根據(jù)朗伯-比爾定律求算，以下例說(shuō)明：已知某化合物的分子量為 287,用乙醇配成濃度為 0.0030%的溶液，在波長(zhǎng) 297nm處，用ICm石英池，測(cè)得吸光度為0.613g,求E值及摩爾吸收系數(shù) 值。E1X 297nm=A/CL=0614 =2050.0030 1297nm = A/CL=0.6140.00301000100-=58747.2測(cè)定注意事項(xiàng) 7.2.1樣品應(yīng)為精制品，水分應(yīng)另取樣測(cè)定，扣除干燥失重。722所用的容量?jī)x器及分析天平應(yīng)經(jīng)過(guò)檢定，如有相差應(yīng)加上校正值。723測(cè)定所用的溶劑，其吸收度應(yīng)符合規(guī)定。吸收池應(yīng)于臨用時(shí)配對(duì)或作空白校 正。7.2.4稱取樣品時(shí)，其稱量準(zhǔn)確度應(yīng)按中國(guó)藥典規(guī)定要