動物實驗室疾病診斷工作流程

1、生物實驗室疾病診斷工作流程 流程： 業(yè)務(wù)接收流程： 內(nèi)勤研發(fā)部生物實驗室 業(yè)務(wù)反饋流程： 生物實驗室 實施細(xì)則 : 、樣品采集與運輸 1.病料的采集要求： (1) 新鮮，代表性。病料存放時間夏天少于6h，冬天12-24h. (2) 減少污染。第一時間采取病料，減少病料因暴露于空氣中而造成的污染。 ( 3)病料采集后，應(yīng)先存放于冰箱中1-2 小時后，再做微生物檢驗 2.病料的采集方法 ( 1 )組織和實質(zhì)器官的采集 采集病料心、肝、脾臟、胰腺、肺等，剪切小塊組織，放入滅菌試管(青霉素瓶) ，密 封。 ( 2)液體病料的采集 血液、膽汁、膿腫液、滲出物等液體病料，使用注射器(或滅菌吸管)吸取病變組

2、織的 液體，將病料注入滅菌試管(青霉素瓶) ( 3 )全血的采集方法 用注射器自雞的心臟或翅靜脈采血 ( 4)血清的采集方法 ，塞好棉塞送檢。 2-5 毫升，注入滅菌試管(青霉素瓶)中。 用滅菌注射器自雞的心臟或翅靜脈采血 2 毫升，注入滅菌試管中(青霉素瓶)擺成斜 面，待血液凝固血清析出后，將血清吸出注入另一個滅菌試管中，備用。 采樣的比例：按每個舍 0.5%的比例采集，但每舍不得少于15份，一般常規(guī)采樣 15-30 份即 可。 、檢測項目 項目一、藥敏試驗 試驗步驟 1.試驗材料 ：培養(yǎng)基、藥敏試紙、細(xì)菌、接種環(huán)、酒精燈、打 孔器、移液器、滴頭。 2.試驗準(zhǔn)備 ： 藥液的制備 （用于商品藥

3、的試驗 ） ：按商品藥使用治療量的比例配制藥 液；如商品藥“百病消”按其說明量治療量 0.01%飲水，可按這個比例配 制藥液，可取 1 0毫克加入 10毫升的水中混勻。此稀釋液即為用于做藥敏 試驗的藥液。 3. 試驗操作方法： 3.1 藥敏片法 3.1.1 在“超凈臺”中，用經(jīng) （酒精燈）火焰滅菌的接種環(huán)挑取適量細(xì)菌培 養(yǎng)物，以劃線方式將細(xì)菌涂布到平皿培養(yǎng)基上。 具體方式； 用滅菌接種環(huán)取適量 細(xì)菌分別在平皿邊緣相對四點涂菌，以每點開始劃線涂菌至平皿的 1/2。找到第 二點劃線至平皿的 1/2，依次劃線，直至細(xì)菌均勻密布于平皿。（另可挑取待試 細(xì)菌于少量生理鹽水中制成細(xì)菌混懸液， 用滅菌棉拭子

4、將待檢細(xì)菌混懸液涂布于 平皿培養(yǎng)基表面，涂布均勻致密 ） 。 3.1.2 將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面。 為了使藥敏片與培養(yǎng)基緊密相貼， 可用鑷子輕按幾下藥敏片。 為了使能準(zhǔn)確的觀 察結(jié)果，要求藥敏片能有規(guī)律的分布于平皿培養(yǎng)基上； 一般可在平皿中央貼一片， 外周可等距離貼若干片 （ 外周一般可貼七片 ），每種藥敏片的名稱要記住。 3.1.3將平皿培養(yǎng)基置于37C溫箱中培養(yǎng)24小時后，觀察效果。 二、結(jié)果觀察： 過夜培養(yǎng)后形成一個抑菌圈，抑菌圈越大，說明該菌對此藥敏感性越大，反之 越小，若無抑菌圈，則說明該菌對此藥具有耐藥性。其直徑大小與藥物濃度、劃線 細(xì)菌濃度有直接

5、關(guān)系。 三、結(jié)果判定 藥敏試驗的結(jié)果，應(yīng)按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標(biāo)準(zhǔn)。 實驗條件不同，判定標(biāo)準(zhǔn)有所不同。對于一般抑菌環(huán)的直徑，20 mn以上極敏;15 mm以上者為高度敏感；10-15 mn為中度敏感；10mm以下為低度敏感；無抑菌環(huán) 者為耐藥。 抗菌藥物 青霉素 鏈霉素 氯霉素 新霉素 紙片含藥量 （卩 g /mL） 50 500 700 300 抑菌圈直徑（mm） 不敏感 低度敏感 中度敏感 敏感 0 26 0 15 0 20 0 25 多黏菌素抑菌圈在9毫米以上為高敏，6-9毫米為低敏，無抑菌圈為不敏。 四、應(yīng)用 藥物敏感試驗后，應(yīng)選擇高敏藥物進行治療，也可選用兩種藥物協(xié)助使

6、用。 在選擇高敏藥物時應(yīng)考慮藥物的吸收途徑，這樣才會達(dá)到好的治療效果。 項目二、抗體試驗 一、實驗用設(shè)備： 離心機1臺、冰箱1臺、振蕩器1臺、抗原、96孔V型板、八道移液器、吸頭、積 液槽、一次性采血管、2毫升注射器、紅細(xì)胞、檸檬酸三鈉、重鉻酸鉀、硫酸、吸管、吸耳 球、針頭、蒸餾水、10毫升離心管、生理鹽水。 二、實驗過程: （一）血凝（HA ）試驗：采用96孔V型反應(yīng)板，測定抗原效價 （二）4單位抗原校正： （三）血凝抑制（ （四）結(jié)果判定： 1）判定結(jié)果： 指數(shù)表示。 2）判定標(biāo)準(zhǔn)： 1. 新城疫抗體： HI ）試驗：每排孔檢查1份血清。 以完全抑制紅細(xì)胞凝集的血清最大稀釋度為該血清的 育

7、雛育成雞在 7以上，產(chǎn)蛋雞在9以上。 HI滴度，以2的 2. H5抗體：抗體值在 6以上。 3. H9抗體：抗體值在 7以上。 注：低于以上標(biāo)準(zhǔn)，則需要進行免疫。 3）免疫后抗體規(guī)律 一般活疫苗免后7-10天產(chǎn)生抗體，2-3周抗體到達(dá)峰值， 可以維持2個月。滅活疫苗免 后10-15天產(chǎn)生抗體，3-4周抗體到達(dá)峰值，可以維持 3-4個月。 項目三、PCR檢測 一、PCR反應(yīng)的條件設(shè)置 PCR反應(yīng)條件為溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。 1. 溫度與時間的設(shè)置 基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點 法，雙鏈DNA在9095C變性，再迅速冷卻至 4060C，弓I物退火并

8、結(jié)合到靶序列上， 然后快速升溫至7075C,在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短 靶基因（長度為100300bP時）可采用二溫度點法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合 二為一，一般采用 94C變性，65C左右退火與延伸（此溫度 Taq DNA酶仍有較高的催化活 性）。 2. 循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板 DNA的濃度，一般的循 環(huán)次數(shù)選在3040次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。 二、PCR擴增產(chǎn)物分析 PCR產(chǎn)物是否為特異性擴增，其結(jié)果是否準(zhǔn)確可靠，必須對其進行嚴(yán)格的分析與鑒定， 才能得出正確的結(jié)論。 PCR產(chǎn)物的分析，可依據(jù)研究對象和目的不同而采用不同的分析方 法。 三、PCR結(jié)果異常分析 PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間一般為 48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測，大于48h后帶 型不規(guī)則甚