單克隆抗體與基因工程抗體制備工作

1、單克隆抗體與基因工程抗體的制備 抗體種類(lèi)： 第一代抗體 多克隆抗體（polyclonal antibody) 第二代抗體 單克隆抗體（monoclonal antibody) 第三代抗體 基因工程抗體（genetic engineering antibody) 雜交瘤技術(shù)的基本原理 單克隆抗體的制備 一、單克隆抗體的產(chǎn)生 二、單克隆抗體的純化 三、單克隆抗體的性質(zhì)鑒定 四、單克隆抗體的特性 基因工程抗體制備 一、基因工程抗體種類(lèi) 二、原理 三、重組抗原制備過(guò)程 基本概念 抗原決定簇（抗原表位） 細(xì)胞克隆 多克隆抗體 單克隆抗體 是指抗原分 子中決定抗 原特異性的 特殊化學(xué)基 團(tuán)，又稱表 位(e

2、pitope). 由一 個(gè)B淋 巴細(xì) 胞增 殖而 成的 細(xì)胞 集團(tuán) 針對(duì)多種抗原決 定簇的混合抗體 由單個(gè)B細(xì) 胞克隆產(chǎn)生 的針對(duì)單一 抗原決定簇 的同源抗體 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的克隆選擇學(xué)說(shuō)，即一種克 隆只產(chǎn)生一種抗體 細(xì)胞融合技術(shù)產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞可以保持雙方 親代細(xì)胞的特性 利用代謝缺陷補(bǔ)救機(jī)理篩選雜交瘤細(xì)胞，并克 隆化，制備McAb 當(dāng)兩個(gè)細(xì)胞緊密接觸時(shí)，細(xì)胞膜可能融合在一 起。融合細(xì)胞含有兩個(gè)不同的細(xì)胞核，稱為異核 體，產(chǎn)生具有原來(lái)兩個(gè)細(xì)胞基因信息的單個(gè)核細(xì) 胞，稱為雜交細(xì)胞（hybrid cell）。 雜交瘤技術(shù)原理： 聚乙二醇（PEG）：細(xì)胞融合劑，使免疫 的小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)

3、胞融合 HAT培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)：反復(fù)的免疫學(xué)檢 測(cè)篩選克隆化增殖的雜交瘤細(xì)胞系 單克隆抗體生成：接種雜交瘤細(xì)胞于小 鼠腹腔，腹水中即可得到高效價(jià)的單克 隆抗體 流 程 雜交瘤技術(shù) 不產(chǎn)生Ig的重鏈和輕鏈 HGPRT-;TK- 與提供淋巴細(xì)胞的動(dòng)物品系相同 （一）小鼠骨髓瘤細(xì)胞 動(dòng) 物： BALB/c小鼠 712周齡 20g25g體重 （二）免疫脾細(xì)胞 細(xì)胞性抗原： （12）107/只，不加佐劑，23 周重復(fù)一次 可溶性抗原： 首次，完全福氏佐劑+100微克抗原 ，36周100200微克抗原，融合前3 天，加強(qiáng)免疫 免疫小鼠 細(xì)胞融合劑： PEG:分子量4000 的PEG是最常用的細(xì)胞 融合劑

4、作用機(jī)理：誘導(dǎo)細(xì)胞膜上脂類(lèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu) 重排，使細(xì)胞膜易打開(kāi)而有助于細(xì)胞融 合 作用特點(diǎn)：隨機(jī)發(fā)生的，不同廠商、批 號(hào)、分子量的PEG，其純度與毒性有所不 同 骨髓瘤細(xì)胞與淋巴細(xì)胞(1:3-10) 50% PEG 1min內(nèi)加完; 10ml培養(yǎng)液終止反應(yīng) 融合方法 SP2/0細(xì)胞與脾細(xì)胞的比例為1：25 1ml 50%的PEG（無(wú)菌，預(yù)溫37）在1分鐘內(nèi) 滴完,靜置45秒,時(shí)間一到,將事先準(zhǔn)備的培養(yǎng) 液一滴一滴加入,停止PEG作用 根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入HAT培養(yǎng)基，使之分加到96 孔板中時(shí)每孔細(xì)胞數(shù)為（0.51.5）105個(gè) 。融合后7-14天，換用HT培養(yǎng)液 細(xì)胞融合 720天出現(xiàn)克隆 HAT篩選

5、挑克隆 融合細(xì)胞的早期培養(yǎng) HAT培養(yǎng)基： H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤 A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物， 阻斷DNA合成主要途徑 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體” ，供細(xì)胞通過(guò)替代途徑合成DNA 雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng) HAT選擇作用： 淋巴細(xì)胞：不能生長(zhǎng)，57天死亡；DNA合成 的主要途徑被A阻斷 骨髓瘤細(xì)胞：不能生長(zhǎng)，57天死亡；HGPRT 缺乏，DNA合成的替代途徑受阻 雜交瘤細(xì)胞： 長(zhǎng)期生長(zhǎng)繁殖 利用淋巴細(xì)胞的HGPRT，將H合成為嘌呤 堿并最終與T一起合成DNA 從淋巴細(xì)胞獲得產(chǎn)生某種抗體的遺傳信息 從骨髓瘤細(xì)胞獲得不斷繁殖的能

6、力 有限稀釋法 特點(diǎn)： 不需任何特殊設(shè)備 克隆出現(xiàn)效率高 實(shí)驗(yàn)室常用方法 方法： 細(xì)胞懸液通過(guò)系列稀釋 每個(gè)培養(yǎng)孔含0.51個(gè)細(xì)胞 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)與凍存 經(jīng)過(guò)反復(fù)克隆化獲得的抗體 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株應(yīng)立即擴(kuò)大培 養(yǎng)（除及時(shí)凍存的細(xì)胞外）。因 多次傳代易引起染色體逐漸丟失 而使細(xì)胞產(chǎn)生抗體能力逐漸減弱 甚至消失，還應(yīng)盡早使用獲得的 抗體陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株制備單克 隆抗體。 一、單克隆抗體的產(chǎn)生 動(dòng)物體內(nèi)誘生方法： 每次用BALB/c或F1代小鼠，（510 ）105/只 體外培養(yǎng)法： 中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng) 單抗含量不高，牛血清Ab難以去除 腹腔注射法 鹽析沉淀 親和層析 離子交換層析 二、Mc

7、Ab的純化 Ig類(lèi)型、亞類(lèi)測(cè)定：雙擴(kuò)法或ELISA法 特異性測(cè)定：抗原類(lèi)似物的交叉反應(yīng) 效價(jià)測(cè)定：用腹水或培養(yǎng)液的稀釋度表示 表位測(cè)定：幾株單抗是否為不同表位特異的 ,用競(jìng)爭(zhēng)抑制法，相加指數(shù)法及微機(jī)集群分 析 親和性測(cè)定：測(cè)定親和常數(shù)K 雜交瘤細(xì)胞染色體：秋水仙素裂解法，小鼠 B細(xì)胞染色體40條，SP2/0細(xì)胞68條，雜交瘤 細(xì)胞一般100多條 McAb靶抗原分子量：常用western blot 三、 單克隆抗體的性質(zhì)鑒定 四、單克隆抗體的特性 高度特異性 高度的均一性和可重復(fù)性 弱凝集反應(yīng)和不呈現(xiàn)沉淀 反應(yīng) 對(duì)環(huán)境敏感性 （一）單克隆抗體的特性 優(yōu)點(diǎn) ： 在體外“永久”地存活并傳代 用相對(duì)不

8、純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗 體。適用于以標(biāo)記抗體為特點(diǎn)的免疫學(xué)分析方法 可用于體內(nèi)的放射免疫顯像和免疫導(dǎo)向治療 單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)與局限性 局限性 ： 固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應(yīng)用范圍 反應(yīng)強(qiáng)度不如多克隆抗體 制備技術(shù)復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)工、價(jià)格較高 McAb PcAb 抗原要求 可以不純 純度高 得量 高 低 特異性 高 低 穩(wěn)定 低 高 沉淀反應(yīng) 無(wú) 有 成本 高 低 McAb與PcAb的比較 McAb and PcAb 基因工程抗體(Genetic engineering antibody) 根據(jù)研究者的意圖，采用基因工 程方法，在基因水平，對(duì)免疫球蛋白 基因進(jìn)行切割、拼

9、接或修飾后導(dǎo)入受 體細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生新型抗體。主 要包括嵌合抗體、單鏈抗體、人源化 抗體、雙價(jià)抗體和雙特異性抗體。 將小鼠Ig基因敲除，轉(zhuǎn)染人Ig基因，在 小鼠體內(nèi)產(chǎn)生人Ab，再經(jīng)雜交瘤技術(shù)，產(chǎn)生 大量完全人源化抗體 一、人源化抗體 Fab：抗原結(jié)合片斷 Fv：可變區(qū)片段 ScFv：?jiǎn)捂溈勺儏^(qū)片段 SdAb：?jiǎn)螀^(qū)抗體 二、小分子抗體 其它生物活性蛋白融合 三、抗體融合蛋白 許多抗原抗體反應(yīng)要求雙價(jià)的抗原結(jié)合 位點(diǎn)，使抗原分子上的兩個(gè)表位交聯(lián)或使兩 個(gè)抗原分子連接。將識(shí)別腫瘤抗原的抗體和 識(shí)別細(xì)胞毒性免疫效應(yīng)細(xì)胞表面分子的抗體 連結(jié)在一起，可使效應(yīng)細(xì)胞更容易與腫瘤細(xì) 胞結(jié)合識(shí)別，取得殺傷腫瘤細(xì)

10、胞的作用。 四、雙特異性抗體 定義：將體外克隆的抗體基因片段插入 噬菌體載體，轉(zhuǎn)染工程細(xì)菌進(jìn)行表達(dá)， 然后用抗原篩選即可獲得特異的單克隆 噬菌體抗體。利用這一技術(shù)可以得到完 全人源性的抗體，在HIV等病毒感染和 腫瘤的診斷與治療方面有其獨(dú)特的優(yōu)越 性 五、噬菌體抗體庫(kù)技術(shù) 基因工程亦稱遺傳工程，即利用DNA 重組技術(shù)的方法，把DNA作為組件， 在細(xì)胞外將一種外源DNA（目的基因 ）和載體DNA重新組合連接（重組） ，最后將重組體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，使外 源基因DNA在宿主細(xì)胞中，隨細(xì)胞的 繁殖而增殖（cloning，克隆），或最 后得到表達(dá)，最終獲得基因表達(dá)產(chǎn)物 或改變生物原有的遺傳性狀。 Fore

11、ign DNA to be insertedPlansmid vector Joining Recombinant DNA molecule Introduction into host cells by transformation of viral infection Host chromateme Slection for cells coteining a recombinant DNA molecule Cloning + 1、體外基因重組 目的基因的制備 載體的構(gòu)建：質(zhì)?；?噬菌體 目的基因與載體重組 2、重組體DNA的轉(zhuǎn) 化增殖和表達(dá) 轉(zhuǎn)化 篩選 增殖和基因表達(dá) PCR技術(shù)原理示

12、意圖 靶序列 變性和引 物復(fù)姓 循環(huán)1 循環(huán)2 循環(huán)3 變性和引 物復(fù)姓 鏈延伸 Tag酶 鏈延伸 以脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP）為例： 首先要合成或購(gòu)買(mǎi)表達(dá)FABP的基因序 列并設(shè)計(jì)合成引物 ATGGTGGACGCTTTCCTGGGCACCTGGAAGCTAGTGGACAGCAAGAA TTTCGATGACTACATGAAGTCACTCGGTGTGGGTTTTGCTACCAGGCA GGTGGCCAGCATGACCAAGCCTACCACAATCATCGAAAAGAATGGGG ACATTCTCACCCTAAAAACACACAGCACCTTCAAGAACACAGAGATC AGCTTTAAGTT

13、GGGGGTGGAGTTCGATGAGACAACAGCAGATGACAG GAAGGTCAAGTCCATTGTGACACTGGATGGAGGGAAACTTGTTCACC TGCAGAAATGGGACGGGCAAGAGACCACACTTGTGCGGGAGCTAATT GATGGAAAACTCATCCTGACACTCACCCACGGCACTGCAGTTTGCAC TCGCACTTATGAGAAAGAGGCATGA 上游引物：HF15 CGGAATTCATGGTGGACGCTTTCCTGGGC 3 下游引物：HF25 GCCTCGAGTCATGCCTCTTTCTCATAAGT 3 基因序列 酶切 位

14、點(diǎn) NdeIXbaI CATATG GTATAC TCTAGA AGATCT TATG AC T AGATC CA GTAT CTAGA T 通過(guò)擴(kuò)增獲取足夠的聯(lián)結(jié)片段 PCR擴(kuò)增 0.5 L dNTP（2 mmol/L） 2.0 L Taq酶（5U/L） 0.25L 加ddH2O至 50 L 2、PCR 反應(yīng)循環(huán)條件設(shè)置 94變性反應(yīng)1min；55退 火反應(yīng)45s；72延伸反應(yīng) 1min。進(jìn)行25個(gè)循環(huán)后，最 后一個(gè)循環(huán)72延長(zhǎng)至10min 。迅速冷卻4。 到高效克隆的目的。因?yàn)?TA克隆法操作最簡(jiǎn)單，快 速和高效的原因，成為 Taq聚合酶PCR產(chǎn)物的最佳 克隆方法。 心機(jī)、 超凈工 作臺(tái)、

15、恒溫?fù)u床、電泳儀及電泳槽、凝膠成像 系統(tǒng) PCR產(chǎn)物 T載體 連接緩沖液 連接酶 5 倒置平皿，37過(guò)夜培養(yǎng)。 連接 CATATG GTATAC TCTAGA AGATCT 工作臺(tái)、恒溫?fù)u床、電泳儀及電泳槽、凝膠 成像系統(tǒng) 表達(dá)載體 目的片段 Solution I 重組子的鑒定 誘導(dǎo)表達(dá) 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-Page鑒定 離膠時(shí)就形成了彼此分離的清晰條帶，大大提 高了分辨率。 ，接好電源，開(kāi)始電泳。 4、染色與脫色 電泳結(jié)束后，分離玻璃板，取 出凝膠進(jìn)行染色，可將無(wú)色的凝膠直接放入考 馬氏亮藍(lán)中振蕩染色約1h，再轉(zhuǎn)入脫色液中脫 色。 5、用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。 表達(dá)產(chǎn)物的分離純化 復(fù)性緩沖液（10mmol/L Tris-HCl， 1mmol/L EDTA， pH8.0） 分離純化目的產(chǎn)物主要依賴于色譜分離技術(shù)。色譜技 術(shù)分為： Ion exchange chromatography (IEC) Reversed phase chromatography (RPC) Hydrophobic interaction chrom