蛋白濃度測(cè)定(完成)

1、For personal use only in study and research; not for commercial use蛋白濃度測(cè)定蛋白質(zhì)的定量分析是生物化學(xué)和其它生命學(xué)科最常涉及的分析內(nèi)容，是臨床上診斷疾病及檢查康 復(fù)情況的重要指標(biāo)，也是許多生物制品，藥物、食品質(zhì)量檢測(cè)的重要指標(biāo)。在生化實(shí)驗(yàn)中，對(duì)樣品中 的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確可靠的定量分析，則是經(jīng)常進(jìn)行的一項(xiàng)非常重要的工作。蛋白質(zhì)是一種十分重要的生物大分子：它的種類很多，結(jié)構(gòu)不均一，分子量又相差很大，功能各 異，這樣就給建立一個(gè)理想而又通用的蛋白質(zhì)定量分析的方法代來了許多具體的困難。目前測(cè)定蛋白 質(zhì)含量的方法有很多種，下面列出根據(jù)蛋

2、白質(zhì)不同性質(zhì)建立的一些蛋白質(zhì)測(cè)定方法： 物理性質(zhì)：紫外分光光度法 化學(xué)性質(zhì)：凱氏定氮法、雙縮脲法、Lowry法，BCA法，膠體金法染色性質(zhì)：考馬氏亮藍(lán)染色法、銀染法其他性質(zhì)：熒光法蛋白質(zhì)測(cè)定的方法很多，但每種方法都有其特點(diǎn)和局限性，因而需要在了解各種方法的基礎(chǔ)上根 據(jù)不同情況選用恰當(dāng)?shù)姆椒?，以滿足不同的要求。例如凱氏定氮法結(jié)果最精確，但操作復(fù)雜，用于大 批量樣品的測(cè)試則不太合格；雙縮脲法操作簡(jiǎn)單，線性關(guān)系好，但靈敏度差，樣品需要量大，測(cè)量范 圍窄，因此在科研上的應(yīng)用受到限制；而酚試劑法彌補(bǔ)了它的缺點(diǎn)，因而在科研中被廣泛采用，但是 它的干擾因素多；考馬氏亮蘭染色法因其靈敏而又簡(jiǎn)便開始重新受到關(guān)注

3、；BCA法又以其試劑穩(wěn)定，抗干擾能力較強(qiáng)，結(jié)果穩(wěn)定，靈敏度高而受到歡迎； 膠體金法具有較高的靈敏度，可達(dá)到毫微克水平，用于微量蛋白的測(cè)定。常用的測(cè)定蛋白質(zhì)含量方法的比較方?法測(cè)定范圍(卩 g/m)不同種類蛋 白的差異最大吸收波長(nm)特?占凱氏定氮法?小?標(biāo)準(zhǔn)方法，準(zhǔn)確，操作麻煩，費(fèi)時(shí)，靈敏度低， 適用于標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定:紫外分光光度法1001000大280205靈敏，快速，不消耗樣品，核酸類物質(zhì)有影響雙縮脲法100010000小540重復(fù)性、線性關(guān)系好，靈敏度低，測(cè)定范圍窄， 樣品需要量大:Folin-酚試劑法20500大750靈敏，費(fèi)時(shí)較長，干擾物質(zhì)多考馬氏亮藍(lán)G-25050500大595靈敏

4、度咼，穩(wěn)定，誤差較大，顏色會(huì)轉(zhuǎn)移BCA50500大562靈敏度高，穩(wěn)定，干擾因素少，費(fèi)時(shí)較長由于凱氏定氮法的操作作過于復(fù)雜，雙縮脲法的靈敏度又太低，下面介紹Folin 酚試劑法，考馬氏亮藍(lán)G250染色法，紫外分光光度法、膠體金法等幾種最常用使用的方法。試驗(yàn)一：BCA法BCA法測(cè)定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響。在組織細(xì)胞裂解實(shí)驗(yàn)中，常用濃度的去垢劑SDS Triton X-100，Tween不影響檢測(cè)結(jié)果，但受螯合劑（EDTA EGTA）還原劑（DTT,巰基乙醇）和脂類的影響?；驹恚簤A性條件下，蛋白將 Cu2+還原為Cu+, Cu+與BCA試劑形成紫顏色的絡(luò)合物，測(cè)定其 在56

5、2nm處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，即可計(jì)算待測(cè)蛋白的濃度。主要特點(diǎn)1. 準(zhǔn)確靈敏，線性范圍廣：BCA試劑的蛋白質(zhì)測(cè)定范圍是10 2000ug/ml ;2快速：45分鐘內(nèi)完成測(cè)定，比經(jīng)典的Lowry法快4倍而且更加方便。3. 經(jīng)濟(jì)實(shí)用：在微孔板中進(jìn)行測(cè)定，可大大節(jié)約樣品和試劑用量。4. 不受樣品中離子型和非離子型去污劑影響。5. 檢測(cè)不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)遠(yuǎn)小于考馬氏亮藍(lán)。試劑要求BCA試劑A, B液室溫保存，蛋白標(biāo)準(zhǔn)（5mg/ml） -20 C保存儀器準(zhǔn)備96孔板，酶標(biāo)儀，37 C恒溫箱使用說明1. 配制工作液：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按體積比A : B （50： 1 ）配制適量 BCA工作

6、液，充分混勻。BCA工作液室溫24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。2. 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：取10微升標(biāo)準(zhǔn)品用 PBS稀釋至100ul （標(biāo)準(zhǔn)品一般可用 PBS稀釋），使終濃 度為0.5mg/ml。將標(biāo)準(zhǔn)品按 0, 1,2, 4, 8, 12, 16, 20ul加到96孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加 PBS補(bǔ)足 到20ul?；蛘咭勒障旅娴谋砀裰性O(shè)置的濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。3. 加適當(dāng)體積樣品到 96孔板的樣品孔中，補(bǔ)加 PBS到20ul。一般蛋白樣品可以幾個(gè)不同的稀釋比例檢測(cè)，常用的是每孔中加入1ul, 2ul, 4ul樣品，補(bǔ)加PBS到 20ul。4. 各孔加入200ul BCA工作液，37C放置30分鐘。5. 冷卻到室溫，用酶標(biāo)

7、儀 562nm測(cè)定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。20ul體系蛋白濃度mg/ml加入C液量ul補(bǔ)足PBS量ul00200.050.219.80.10.419.60.20.819.20.31.218.80.41.618.40.52180.62.417.60.7:2.817.20.83.216.80.93.616.41P4161.561428122.5101031283.514641645200注意事項(xiàng)1. 在低溫條件或長期保存出現(xiàn)沉淀時(shí)，可攪拌或37C溫育使溶解，如發(fā)現(xiàn)細(xì)菌污染則應(yīng)丟棄。2. 樣品中若含有EDTA EGTA DTT、硫酸銨、脂類會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，請(qǐng)?jiān)囉?Bradford蛋白濃度

8、測(cè)定試劑盒；高濃度的去垢劑也影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可用TCA沉淀去除干擾物質(zhì)。3. 要得到更為精確的蛋白濃度結(jié)果，每個(gè)蛋白梯度和樣品均需做復(fù)孔，每次均應(yīng)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。4當(dāng)試劑A和B混合時(shí)可能會(huì)有渾濁，但混勻后就會(huì)消失，工作液在密閉情況下可保存1周。5.需準(zhǔn)備37C水浴或溫箱、酶標(biāo)儀或普通分光光度計(jì)，測(cè)定波長為540-595nm之間，562nm最佳。酶標(biāo)儀需與96孔酶標(biāo)板配套使用。使用分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度時(shí)，試劑盒測(cè)定的樣品數(shù)量會(huì)因此而減 少。使用溫箱孵育時(shí)，應(yīng)注意防止因水粉蒸發(fā)影響檢測(cè)結(jié)果。二、考馬氏亮藍(lán) G 250染色法（Bradford法）此方法是1976年Bradform建立。染料結(jié)合法測(cè)定蛋白

9、質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度較高，可檢測(cè)到微量蛋白，操作簡(jiǎn)便、快迅，試劑配制極簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，但干擾因素多?！驹?理】考馬氏亮藍(lán)G 250具有紅色和青色兩種色調(diào)、在酸性溶液中游離狀度下為棕紅色，當(dāng)它通過疏水作用與蛋白質(zhì)結(jié)合后，變成藍(lán)色，最大吸收波長從465nm轉(zhuǎn)移到595nm處，在一定的范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)含量與 595nm的吸光度成正比，測(cè)定 595nm處光密度值的增加即可進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量?！静僮鞑襟E】1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：按下表操作，在試管中分別加入0、20、40、80、100微克蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水補(bǔ)足到100微升,加入3ml的染色液，混勻后室溫放置15分鐘。編號(hào)123456蛋白標(biāo)準(zhǔn)（ml）00.020.040

10、.060.080.10水(ml)0.100.080.060.040.020染色液（ml）333333在595nm波長比色，讀出吸光度，以各管的標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)，以其吸光度為縱坐標(biāo)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、血清蛋白質(zhì)測(cè)定稀釋血清（或其它蛋白樣品溶液），準(zhǔn)確吸取 0.1ml血清，置入50ml容量瓶中，用生理鹽水稀釋 至刻度（此為稀釋 500倍，其它蛋白樣品酌情而定）。再取三只試管，分別標(biāo)以1、2、3號(hào)，按下表操作。混勻后室溫放置15分鐘，在595nm波長比色，計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。試劑（毫升）1（空白管）2（標(biāo)準(zhǔn)管）3（樣品管）蒸餾水0.1蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)0.1稀釋血清0.1染色液333【計(jì)?算】每100毫升血清

11、中蛋白質(zhì)的含量（g%） =【試?劑】1、考馬氏亮藍(lán) G 250染色液：稱取100mg考馬氏亮藍(lán)G 250溶解于50毫升95%的乙醇中，加入 100毫升85 %的磷酸，加入 稀釋到1升。2、蛋白標(biāo)準(zhǔn)（0.1mg/ml）準(zhǔn)確稱取10mg牛血清白蛋白，在 100ml容量瓶中加生理鹽水至刻度，溶后分裝，20C冰箱保存?！咀⒁馐马?xiàng)】1常用試劑的干擾：有些常用試劑在測(cè)定中會(huì)受到不同程度的干擾。、巰基乙醇、蔗糖、甘油、 及少量有較少影響，而 1%、1% TritonX-100及1% Hemosol的干擾嚴(yán)重。2、顯色結(jié)果受時(shí)間與溫度影響較大，須注意保證樣品與標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定控制在同一條件下進(jìn)行。3、考馬氏亮藍(lán) G

12、 - 250染色能力很強(qiáng)，特別要注意的清洗。顏色的吸附對(duì)本次測(cè)定影響很大?？?將測(cè)量杯在0.1mol/L HCI中浸泡數(shù)小時(shí)，再?zèng)_洗干凈即可。三、紫外分光光度法紫外光譜吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量是將蛋白質(zhì)溶液直接在紫外中測(cè)定的方法，不需要任何試劑，操 作很簡(jiǎn)便，而且樣品可以回收?！驹?理】蛋白質(zhì)溶液在 280nm附近有強(qiáng)烈的吸收，這是由于蛋白質(zhì)中酪氨酸、色氨酸殘基而 引起的，所以光密度受這兩種含量的支配。另外或提取過程中雜有的核酸對(duì)測(cè)定結(jié)果引起極大誤 差，其最大吸收在 260nm。所以同時(shí)測(cè)定280及260nm兩種波長的吸光度，通過計(jì)算可得較為正 確的蛋白質(zhì)含量?！静?作】將待測(cè)蛋白質(zhì)溶液適當(dāng)稀釋K

13、倍，在紫外分光度計(jì)中分別測(cè)定樣品在10mm光徑石英中，分別在 280nm及260nm兩種波長下的吸光度值 A280和A260?！居?jì)?算】1、當(dāng)?shù)鞍讟悠返奈馐毡戎礎(chǔ)280/ A260約為1.8,可用下面的公試進(jìn)行計(jì)算：蛋白質(zhì)濃度（mg/ml ） = （ 1.45A280 0.74A260）冰（稀釋倍數(shù)）2、也可以先計(jì)算出A280 /A260的比值后從下表中查出校正因子“ F值，由下面的經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算出溶液的蛋白質(zhì)濃度。同時(shí)從表中還可以查出樣品中混雜的核酸的百分含量：蛋白質(zhì)濃度（mg/ml ）= F280 XKA280/A260核酸()FA280/A260核酸(%)F1.750.001.1160.

14、8465.500.6561.630.251.0810.8226.000.632 二1.520.501.0540.8046.500.607 1.400.751.0230.7847.000.5851.361.000.9940.7677.500.565 J1.301.250.9750.7538.000.5451.251.500.9440.7309.000.508 n1.162.000.8990.70510.000.478 J1.092.500.8520.67112.000.4221.033.000.8140.64414.000.3770.9793.500.7760.61517.000.322 二0.

15、9394.000.7430.59520.000.2780.8745.000.682?注：一般純凈蛋白質(zhì)的光吸收比值A(chǔ)280/A260約為1.8，而核酸A280/A260的比值約為0.5。【方法評(píng)價(jià)】操作簡(jiǎn)便、樣品溶液可回收，同時(shí)可估計(jì)核酸含量。但核酸含量小于20%或溶液混濁、則測(cè)定結(jié)果誤差較大。在使用上表和公式計(jì)算時(shí)也應(yīng)注意各種蛋白質(zhì)和各種核酸在280nm及260nm處的光吸收值也不盡相同，故計(jì)算結(jié)果有一定誤差。四、雙縮脲法【原?理】利用半飽和硫酸銨或 27.8 %硫酸鈉亞硫酸鈉可使血清球蛋白沉淀下來，而此時(shí)血清白蛋白仍處于溶解狀態(tài)，因此可把兩者分開，這種利用不同濃度的中性鹽分離蛋白的方法稱為

16、鹽方法。鹽析分離蛋白質(zhì)的方法不僅用于臨床醫(yī)學(xué)，而且還廣泛地用于生物化學(xué)研究工作中，如一些特殊蛋白質(zhì)一酶、蛋白等的分離和純化。蛋白質(zhì)和雙縮脲一樣，在堿性溶液中能與銅離子形成紫色絡(luò)合物（雙縮脲反應(yīng)），且其呈色深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比，因此可于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。但必須注意，此反應(yīng)并非蛋白質(zhì)所特有，凡分子內(nèi)有兩個(gè)或兩個(gè)以上的肽鍵的化合物以及分子內(nèi)有一CH2 NH2等結(jié)構(gòu)化合物，雙縮脲反應(yīng)也呈陽性。 本實(shí)驗(yàn)用27.8%硫酸鈉一亞硫酸鈉溶液稀釋血清，取出一部分用雙縮脲反應(yīng)測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，剩余部分則用過濾，使析出的球蛋白與白蛋白分離，取出濾液用同一反應(yīng)測(cè)定白蛋白的含量。與白蛋白含量之差即球蛋白 的含量。白

17、蛋白與球蛋白之比即所謂的白/球比值?！静?作】1、 取中試管4支，分別標(biāo)以“1、” “ 2、“ 3” “ 4,”吸取27.8%硫酸鈉一亞硫酸鈉1ml，置“ 1管中 備用。2、 吸取血清0.2ml于另一試管中，加 27.8 %硫酸鈉一亞硫酸鈉 4.8ml，用拇指壓住管口倒轉(zhuǎn)混合56次，放置約15秒，用1ml刻度管吸取1ml置于管 “4中 （測(cè)定管）。3、 將剩余的血清混懸液（如濾液不清，可重復(fù)過濾，直至澄清為止），用另一支1ml刻度取此液1ml，置于管 “ 3”（白蛋白測(cè)定管）。4、 另用一支1ml刻度吸取標(biāo)準(zhǔn)血清1ml，置管“ 2中（標(biāo)準(zhǔn)管）。5、 于上述4支試管中分別加入雙縮脲試劑4ml，混

18、勻。6、在室溫下放置10分鐘后，以管“1”空白管）調(diào)零，在540nm的波長下進(jìn)行比色，分別記錄“ 2、”“ 3、”“ 4管”的光密讀數(shù)【計(jì)? 算】血清球蛋白含量（克/100ml）=總蛋白含量一白蛋白含量白：球比值=白蛋白含量/球蛋白含量?！九R床意義】正常人每100ml血清中含蛋白質(zhì)68克，平均7克左右，白/球比為1.52.5:1。長期營養(yǎng)不良， 肝臟疾病，慢性腎炎時(shí)，總蛋白含量降低；大量失水（如嘔吐、腹瀉）時(shí)則升高。肝臟疾病、慢 性腎炎以及慢性傳染病有大量抗體生成時(shí)，白/球比值變小，甚至倒置。【試劑與器材】（一）器材1 、中試管 6 支。2、刻度吸管： 0.2ml、 5ml、 10ml、 1m

19、l。3、玻璃。4、快速。5、。（二）試劑1、27.8硫酸鈉 一亞硫酸鈉溶液：取濃硫酸 2ml 加到 900ml 蒸餾水中，將此含酸蒸餾水加于盛有無水硫酸鈉 208 克及無水亞硫酸鈉 70 克，的中，邊加邊攪拌，待液解后全部移至 1000ml 容量瓶 中，加蒸餾水至刻度。取此溶液1ml，加蒸餾水24ml，檢查其pH，應(yīng)為7或略高于 乙本試劑應(yīng)貯于25 C溫箱中。2、 雙縮脲試劑：稱取硫酸銅（CUSO45H2O） 1.5克及石酒石酸鉀鈉（C4H4O6KNa4H2O） 6克，分別用適量蒸餾水溶解，混合后加入10% NaOH溶液300ml，最后加蒸餾水至1000ml。3、 標(biāo)準(zhǔn)血清：取經(jīng)凱氏定氮標(biāo)定后

20、的血清用15的 NaCl 溶液稀釋 25倍，貯于冰箱中備用。 【注意事項(xiàng)】（一）硫酸鈉的溶解度與溫度有關(guān)，溫度低于30C易結(jié)晶析出，故室溫較低時(shí)應(yīng)在 37C或進(jìn)行保溫。（二）血清樣品必須新鮮，如有細(xì)菌污染或溶血，則不能得到正確的結(jié)果。（三）含脂類較多的血清，可用乙醚3ml 抽提一次后再進(jìn)行測(cè)定。五、Folin 酚試劑法（又名 Lowry ）法目前實(shí)驗(yàn)室較多用用 Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，此法的特點(diǎn)是靈敏度高，較雙縮脲高兩個(gè)數(shù)量級(jí)，較紫外法略高，操作稍微麻煩，反應(yīng)約在15分鐘有最大顯色，并最少可穩(wěn)定幾個(gè)小時(shí)，其不足之處是干擾因素較多，有較多種類的物質(zhì)都會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。【原?理】蛋白

21、質(zhì)中含有酚基的酪氨酸，可與酚試劑中的磷鉬鎢酸作用產(chǎn)生蘭色化合物，顏色深淺與蛋白含 量成正比?！静?作】1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：按下表操作，在中分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，用生理鹽水補(bǔ)足到1ml。加入5ml的堿性酮試劑，混勻后室溫放置20分鐘后，再加入0.5ml酚試劑混勻。編?號(hào)123456蛋白標(biāo)準(zhǔn)（ml）00.20.40.60.81.00.9% NaCl( ml)1.00.80.60.40.20堿性酮試劑（ml）555555混勻后室溫（25 C）放置20分鐘酚試劑（ml）0.50.50.50.50.50.530分鐘后，以第1管為空白，在650nm波長比色，讀出吸

22、光度，以各客的標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo), 以其吸光度為縱坐標(biāo)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、蛋白質(zhì)測(cè)定。稀釋（或其它蛋白樣品濃度）：準(zhǔn)確吸取 0.1ml血清，置于50ml中，用生理鹽水釋釋至刻度（此 為稀釋500倍，其它蛋白樣品酌情而定）。再取三只，分別標(biāo)以1、2、3號(hào)，按下表操作：編?號(hào)測(cè)定管標(biāo)準(zhǔn)管空白管稀釋標(biāo)本（ml）0.2稀釋標(biāo)準(zhǔn)液（ml）0.20.9%NaCI(ml)0.2堿性酮液（ml）1.01.01.0混勻后于室溫放置20分鐘酚試劑（ml）0.1 0.10.1混勻各管，30分鐘后，在波長 650nm比色，讀取吸光度?！居?jì)?算】1、以測(cè)定管讀數(shù)查找標(biāo)準(zhǔn)曲線求得血清蛋白含量。2、無標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，可以與測(cè)定

23、管同樣操作的標(biāo)準(zhǔn)管按下式計(jì)算蛋白含量：血清蛋白含量（g% ）=【試劑配制】1、堿性酮溶液：甲液： Na2CO32g 溶于 0.1mol/L NaOH 100ml 溶液中。乙液： CuSO4?5H2O 0.5 克溶于 1酒石酸鉀 100ml 中。 取甲液 50ml ，乙液 1ml 混合。此液只能臨用前配制。2、酚試劑：取 Na2WO4?2H2O 100g 和 Na2MoO3?2H2O 25g,溶于水 700ml 中，再加 85% H3PO4, 50ml 和 HCI（濃）100ml，將上物混合后，置1500ml園底燒瓶中溫和地回流 10小時(shí)再加硫酸鋰（LJSOz?。） 150g，水50ml及溴水?dāng)?shù)滴，繼續(xù)沸騰15分鐘以除