各種DNA提取方法

1、各種DNA提取方法提取方法提取方法提取方法 一，基因組DNA提取方法 制備基因組DNA是進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和功能研究的重要步驟，通常要求得到的片段的長(zhǎng) 度不小于100-200kb。在DNA提取過程中應(yīng)盡量避免使 DNA斷裂和降解的各種因素， 以保 證DNA的完整性，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。主要是 CTAB方法，其他的方法還有 1物理方 式:玻璃珠法超聲波法研磨法凍融法。 2化學(xué)方式：異硫氰酸胍法堿裂解法 3生物方式：酶法。 根據(jù)核酸分離純化方式的不同有 ：硅質(zhì)材料、陰離子交換樹脂等 試驗(yàn)步驟：1、貼壁細(xì)胞用胰酶消化，離心收集。2、細(xì)胞重懸于冰冷的 PBS漂洗 一次，離心收集。試驗(yàn)步驟2再重新作一邊。3

2、、加入5mlDNA 提取緩沖液， (10mmol/LTris-cl0.1mol/LEDTAo.5%SDS) 混勻。 4、加入 25ul 蛋白酶 K 使終濃度達(dá)到 100ug/ml混勻，50C水浴3h 5、用等體積的酚抽提一次，2500rpm離心收集水相，用等體 積的(酚，氯仿，異戊醇)混合物抽提一次，2500r/min離心收集水相 6、用等體積的氯仿， 異戊醇抽提一次。加入等體積的5mol/L的LiCL混勻，冰浴，10min.。7、2500rpm離心10min. 轉(zhuǎn)上清于一離心管中。加入等體積的異丙醇。室溫10min。2500rpm離心10min。棄上清。 8、加入0.1倍體積3mol/L乙酸

3、鈉(PH5.2)與2倍體積-20C預(yù)冷無水乙醇。-20 C20min。9、 12000r/min室溫離心 5min。棄上清。將 DNA 溶于適量 TE中。 二，外周血DNA提取技術(shù) 分離外周血白細(xì)胞提取方法：試驗(yàn)步驟：1、取人肘靜脈血5ml ,EDTA抗凝，2500rpm 離心10min。 2、小心吸取上層血漿，分裝到 3個(gè)0.5ml離心管中。3、在血細(xì)胞中加入 3 倍體積的溶血液，搖勻，冰浴15min。 4、2500rpm離心10min，棄上清。 5、加入10ml 溶血液，搖勻，冰浴 15min。 6、3000rpm離心10min，棄上清。7、倒置離心管，去掉殘 液。8、得白細(xì)胞，一80C凍

4、存。 試驗(yàn)要求： 血至分離白細(xì)胞之間隔時(shí)間在室溫下放置不 超過2h，4C放置不超過5h，以防白細(xì)胞自溶。 三，氯仿法抽提外周血白細(xì)胞基因組DNA: 試驗(yàn)試齊U : Ligsisbuffer :133mM NH4Cl NHCI7.12g0.9mMNH4HC03NH4HC030.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml;最后加滅菌去 離子水至1000ml，高壓滅菌。ACD抗凝劑： 檸檬酸1.68g檸檬酸鈉4.62g葡萄 糖5.15g ;最后加滅菌去離子水至350ml，高壓滅菌。提取緩沖液（Extractionbufer ）: 10mMTrisCI（PH=8.0）1MTris.CI（P

5、H=8.0）1ml0.1mMEDTA（PH=8.0）0.5mMEDTA（PH=8.0）20ml0 .5%SDS10%SDS0.5ml ；最后滅去離子水至 100ml，高壓滅菌 試驗(yàn)步驟：1、在500 d抗凝 血中加入ligsisbuffer1000 I,充分顛混至清亮。以 4000rpm，離心5min。棄上清液。2、沉 淀中加入ligsisbuffer1500 I,充分勻漿。以 6000rpm，離心5min。3、徹底棄去上清，加入 extractionbuffer500 l （裂解細(xì)胞），混勻置于37C,水溶1h。4、加入8d的蛋白酶K，顛 混，37 C過夜（或55 C, 3h，但是37 C效

6、果要好些）。5、每管加入450訕飽和酚（取溶 液下層）緩慢搖晃 10min，以5500rpm ,離心15min。 6、取上清，每管加入 250訕飽和酚 和250訕氯仿一異戊醇，搖勻10min ,以5500rpm,離心15min。7、取上清，每管加入500訕 氯仿一異戊醇，搖勻 10min，以5500rpm，離心15min。8、取上清，每管加 50訕的3M的 NaAC + ,適量無水乙醇（預(yù)冷）至滿，搖勻放入-20C保存2h以上。9、以12000rpm,離 心20min。去上清，加入 70%乙醇500訕，以12000rpm，離心5min，去上清，50- 60C干 燥。10、加入50訕滅菌去離子水

7、，轉(zhuǎn)彈，混勻。 四，Nal提取法提取外周血白細(xì)胞基因組： 實(shí)驗(yàn)步驟：1、取外周抗凝血（全血）100ul于eppendof管中，12000rpm離心12min。 2、棄上清，加雙蒸水 200ul溶解，搖勻20s。 3、混勻后加6MNal溶液200ul,搖勻20s。 4、加入氯仿/異戊醇（24： 1） 400ul，邊加邊搖，搖勻 20s，12000rpm離心12min。 5、取 上層液350ul，加入另一新eppendof管中，加0.6倍體積異丙醇，搖勻20s，室溫放置15min， 靜置后的反應(yīng)體系 15000rpm離心12min，使沉淀緊貼 eppendof管壁。6、棄異丙醇，加 70%乙醇1m

8、l （不振動(dòng)），以15000rpm離心12min。7、棄乙醇，敞開 eppendof管蓋，烘 干（37C恒溫箱）后，力口 1xTE溶液30ul，溶解DNA 12h以上，制成的 DNA液-20C冰箱 保存?zhèn)溆谩?五，常用的外周血白細(xì)胞基因提取方法： 試驗(yàn)原理：苯酚/氯仿提取DNA是利用峴_Q酚是蛋白質(zhì)的變性劑，反復(fù)抽提, 使蛋白質(zhì)變性，SDS（十二烷基磺酸鈉）將細(xì)胞膜裂解，在蛋白酶 K、EDTA的存在下消化蛋 白質(zhì)或多肽或小肽分子，核蛋白變性降解，使 DNA從核蛋白中游離出來。 DNA易溶于水, 不溶于有機(jī)溶劑。蛋白質(zhì)分子表面帶有親水基團(tuán)， 也容易進(jìn)行水合作用， 并在表面形成一層 水化層，使蛋白

9、質(zhì)分子能順利地進(jìn)入到水溶液中形成穩(wěn)定的膠體溶液。當(dāng)有機(jī)溶液存在時(shí), 蛋白質(zhì)的這種膠體穩(wěn)定性遭到破壞，變性沉淀。離心后有機(jī)溶劑在試管底層（有機(jī)相），DNA 存于上層水相中，蛋白質(zhì)則沉淀于兩相之間。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白質(zhì)。 氯仿的作用是有助于水相與有機(jī)相分離和除去DNA溶液中的酚。抽提后的 DNA溶液用2 倍體積的無水乙醇在 1/103mol/LNaCI存在下沉淀 DNA，回收DNA用70%乙醇洗去 DNA 沉淀中的鹽，真空干燥，用 TE緩沖液溶解DNA備用。 試驗(yàn)步驟：1、將ImlEDTA抗凝貯凍血液于室溫解凍后移入5ml離心管中，加入 1ml磷酸緩沖鹽溶液 （PBS）,混勻，3

10、500rpm離心15min傾去含裂解紅細(xì)胞的上清。重復(fù)一 次。用0.7mlDNA提取液混懸白細(xì)胞沉淀，37C水浴溫育1h。2、將上述DNA提取液混懸 白細(xì)胞，37C水浴溫育1h后，加入1mg/ml蛋白酶K0.2ml至終濃度為100-200ug/ml上下 轉(zhuǎn)動(dòng)混勻，液體變粘稠。50C水浴保溫3h，裂解細(xì)胞，消化蛋白。保溫過程中，應(yīng)不時(shí)上 下轉(zhuǎn)動(dòng)幾次，混勻反應(yīng)液。3、反應(yīng)液冷卻至室溫后，加入等體積的飽和酚溶液，溫和地上 下轉(zhuǎn)動(dòng)離心管 5-10min，直至水相與酚相混勻成乳狀液。5000rpm離心15min，用大口吸管 小心吸取上層粘稠水相， 移至另一離心管中。重復(fù)酚抽提一次。加等體積的氯仿：異戊醇

11、 （24 :1）,上下轉(zhuǎn)動(dòng)混勻，5000rpm離心15min，用大口吸管小心吸取上層粘稠水相，移至另一 離心管中。重復(fù)一次。4、加入1/5體積的3mol/LNaAc及2倍體積的預(yù)冷的無水乙醇，室 溫下慢慢搖動(dòng)離心管，即有乳白色云絮狀DNA出現(xiàn)。用玻璃棒小心挑取云絮狀的DNA , 轉(zhuǎn)入另一 1.5ml離心管中，力口 70%乙醇0.2ml，以5000rpm離心5min。洗滌DNA ,棄上清， 去除殘留的鹽。重復(fù)一次。室溫?fù)]發(fā)殘留的乙醇，但不要讓DNA完全干燥。加TE液20ul 溶解DNA置于搖床平臺(tái)緩慢搖動(dòng)，DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20C冰 箱保存?zhèn)溆谩?六，真核細(xì)胞DN

12、A的制備 一般真核細(xì)胞基因組 DNA有107-9bp，可以從新鮮組織、培養(yǎng)細(xì)胞或低溫保存的組 織細(xì)胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等試劑存在下用蛋白酶 K消化細(xì)胞，隨后用酚 抽提而實(shí)現(xiàn)的。這一方法獲得的DNA不僅經(jīng)酶切后可用于 Southern分析，還可用于 PCR 的模板、文庫(kù)構(gòu)建等實(shí)驗(yàn)。根據(jù)材料來源不同，采取不同的材料處理方法，而后的DNA提 取方法大體類似，但都應(yīng)考慮以下兩個(gè)原則：1、防止和抑制 DNase對(duì)DNA的降解。2、 盡量減少對(duì)溶液中 DNA 的機(jī)械剪切破壞。試劑準(zhǔn)備： 1、 TE:10mMTris-HCI（pH7.8）;1mMEDTA（pH8.0）。2、 TBS:25m

13、MTris-HCI(pH7.4);200mMNaCI;5mMKCI 。3、裂解緩沖液：250mMSDS;使用前加 入蛋白酶 K 至 100mg/ml。4、20%SDS 5、2mg/ml 蛋白酶 K 6、Tris 飽和酚（pH8.0）、酚/ 氯仿（酚：氯仿=1 ： 1）、氯仿7、無水乙醇、75%乙醇試驗(yàn)步驟：材料處理：1、新鮮或 冰凍組織處理：1）取組織塊0.3-0.5cm3剪碎，加TE0.5ml，轉(zhuǎn)移到勻漿器中勻漿。2）將勻 漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中。3）加20%SDS25ml，蛋白酶 K（2mg/ml）25ml，混勻。4）60 C 水浴1-3hr。 2、培養(yǎng)細(xì)胞處理：1）將培養(yǎng)細(xì)胞懸浮后

14、，用TBS洗滌一次。2）離心4000g 5min， 去除上清液。3）加10倍體積的裂解緩沖液。4）50-55 C水浴1-2hr。 DNA提?。?、加等 體積飽和酚至上述樣品處理液中，溫和、充分混勻3min。 2、離心5000g 10min，取上層水 相到另一 1.5ml離心管中。3、加等體積飽和酚，混勻，離心 5000g 10min，取上層水相到 另一管中。4、加等體積酚/氯仿，輕輕混勻，離心5000g 10min，取上層水相到另一管中。 如水相仍不澄清，可重復(fù)此步驟數(shù)次。5、加等體積氯仿，輕輕混勻，離心5000g 10min， 取上層水相到另一管中。6、加1/10體積的3M醋酸鈉（pH5.2

15、）和2.5倍體積的無水乙醇， 輕輕倒置混勻。7、待絮狀物出現(xiàn)后，離心5000g 5min，棄上清液。8、沉淀用75%乙醇 洗滌，離心5000g 3min，棄上清液。9、室溫下?lián)]發(fā)乙醇， 待沉淀將近透明后加 50-100mlTE 溶解過夜。 七，細(xì)菌DNA的提取方法 針對(duì)一些不易于提取的細(xì)菌的方法：試驗(yàn)試劑： 抽提緩沖液： 2%CTAB（W/V）2%PVPK25（w/v） （去色素）100mMTris-HCl（pH8.0） 25mMEDTA（pH8.0）2.0MNaCI 10MliCl 2MliCl DEPC-water （抑制 RNA 酶活性） 3MNaAc（pH5.2）96%乙醇70%乙醇

16、試驗(yàn)步驟： 1、抽提緩沖液65 C預(yù)熱 。 2、加菌體到已經(jīng)預(yù)熱的緩沖液（700ul）中混勻，65 C, 10min。 3、加酚/ 氯仿/異戊醇（25 : 24： 1）,振蕩，以12000rpm，離心10min。 4、取上清，加氯仿/異戊醇 （24 : 1）振蕩，以12000rpm，離心10min。5、重復(fù)再作一次步驟 4。 6、加入1/10體積 的3M醋酸鈉和1.5倍體積的乙醇（或加入等體積的異丙醇），一20C下沉淀。7、以2000rpm， 離心10min。 &棄上清，以 70%乙醇條洗沉淀，也可以再用100%乙醇洗，然后溶解于 100ml水中。 十，較為常用的細(xì)菌DNA提取方法： 實(shí)驗(yàn)步驟

17、：1、將菌株接種于液體LB培養(yǎng)基，37C震蕩培養(yǎng)過夜。2、取1.5ml 培養(yǎng)物12000rpm離心2min。3、沉淀中加入567ul的TE緩沖液，反復(fù)吹打使之重新懸浮， 加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶 K，混勻，于 37C溫育1h. 4、加入100ul5mol/LNaCI 充分混勻，再加入 80ulCTAB/NaCI溶液，混勻后再 65C溫育10min。5、加入等體積的酚 /氯仿/異戊醇混勻，離心 4-5min將上清轉(zhuǎn)入一只新管中，加入 0.6-0.8倍體積的異丙醇，輕 輕混合直到 DNA沉淀下來，沉淀可稍加離心。6、沉淀用1ml的70%乙醇洗滌后，離心 棄乙醇. 十一，真菌DNA

18、提取總結(jié)的兩種方法： 第一種方法：試驗(yàn)步驟：1、取真菌菌絲0.5g在液氮中迅速研磨成粉。2、加入4mL 提取液，快速振蕩混勻。3、加入等體積的4mL的氯仿：異戊醇(24:1)，渦旋35min (此處 是粗提沒有加酚)。4、以4C, 1000rpm，離心5min。 5、上清再用等體積的氯仿：異戊醇 (24:1)抽提一次。以 4C，10000rpm，離心5min。 6、取上清，加入 2/3倍體積的-20C預(yù)冷 的異丙醇或2.5倍體積的無水乙醇沉淀混勻靜置約30min。 7、用毛細(xì)玻棒挑出絮狀沉淀用 75%乙醇反復(fù)漂洗數(shù)次再用無水乙醇漂洗1次吹干，重懸于500UITE中。&加入1ulRNaseA (10mg/mL )，37 C下處理1h。9、用酚(pH8.0):氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿：異戊醇(24:1) 各抽提1次。以4 C，1