HIF1α基因部分12外顯子序列生物信息學(xué)分析

1、hif-1基因12外顯子序列生物信息學(xué)分析張翠翠作者簡(jiǎn)介：張翠翠（1986-），女（漢族），碩士研究生，email:，聯(lián)系電話訊作者：賈青（1964-），男（漢族），教授，博士，研究方向：動(dòng)物遺傳育種email:，賈 青1.2，邢增喜1,魏星燦1，陶雋1（1、河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定071000；2、國(guó)家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心， 河北 保定 071000）摘要：為了探討不同物種的hif-1基因遺傳多樣性,使用生物信息學(xué)方法分析人、家鼠、豬、牛及獼猴等10個(gè)物種的hif-1基因的1

2、2外顯子序列。結(jié)果顯示，選取的10個(gè)物種44條序列中共篩查到130個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，生成13種單倍型。牦牛、家牛和豬三個(gè)物種hif-1基因12外顯子區(qū)域存在較為豐富的遺傳多樣性，而狨、人、獼猴、家鼠和犬五個(gè)物種的hif-1基因12外顯子相對(duì)保守。關(guān)鍵字：物種；hif-1基因；遺傳多樣性；生物信息學(xué)bioinformatics analysis of the 12th exon of hif-1genecuicuizhang1 qingjia1、2, zengxixing1, xingcanwei1, jun tao 1（1、college of animal science and technolo

3、gy, agricultural university of hebei, baoding, 071000,china;2 、national engineering research center for agriculture in northern mountainous area, baoding, 071000, china）abstract: this study aims to discuss the genetic diversity of the alpha subunit of hypoxia inducible factor 1(hif-1a). the 12th exo

4、n of ten species are analyzed by bioinformatics methods, such as homo sapiens, mus musculus, sus scrofa, macaca mulatta and so on. the result shows that 130 polymorphic sites were detected and 13 hapolotypes were sorted from 44 sequences of 10 species. there were rich genetic diversity of the 12th e

5、xon of the hif-1 a gene within and among three species, bos grunniens bos taurus and sus scrofa. but canis, homo sapiens, macaca mulatta, and callithrix jacchuss were conservation.key words: species; hif-1 a gene; genetic diversity; bioinformatics低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor-1，hif-1）是細(xì)胞缺氧后產(chǎn)生的一種適應(yīng)

6、性的dna結(jié)合蛋白，由亞基和亞基組成，亞基受低氧誘導(dǎo)，既是hif-1的活性亞基又是調(diào)節(jié)亞基。hif-1 對(duì)能被受低氧所誘導(dǎo)的低氧反應(yīng)性基因(hypoxia responsive genes，hrg)具有調(diào)控作用，如促紅細(xì)胞生成素( epo)，糖酵解代謝酶，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)，葡萄糖轉(zhuǎn)移子(glut)等在內(nèi)的多種基因。這些基因序列有著共同的特點(diǎn)，即其增強(qiáng)子或啟動(dòng)子上存在一個(gè)低氧反應(yīng)元件，是由hif-1結(jié)合點(diǎn)(核心序列為 5-cgtg- 3)及其兩側(cè)的功能序列構(gòu)成的1、2。當(dāng)丙酮酸激酶、磷酸果糖激酶、烯醇化酶等和包括這些酶的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄激活時(shí)，低氧誘導(dǎo)因子結(jié)合位點(diǎn)被暴露，hif-1通過(guò)激活

7、這些位點(diǎn)來(lái)激活這些酶基因3，進(jìn)而誘導(dǎo)epo、糖酵解酶等的合成，促進(jìn)糖酵解的進(jìn)行，通過(guò)糖酵解產(chǎn)生atp供機(jī)體能量代謝的需要。有關(guān)hif-1遺傳多態(tài)性的研究更多集中于某物種中，而在物種間的研究極少，另外應(yīng)用該基因探討物種間系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的報(bào)道也較為少見(jiàn)。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析牦牛、家牛、狨、人、獼猴、家鼠、大鼠、藏羚羊、豬和犬物種間的遺傳多態(tài)性，及這些物種間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，希望能為今后的研究提供理論依據(jù)。1 材料和方法1.1 基因序列來(lái)源 從national center for biotechnology information（ncbi）數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢下載不同物種的hif-1基因的編碼序列，

8、其中包含牦牛、家牛、狨、人、獼猴、家鼠、大鼠、藏羚羊、豬和犬10個(gè)物種的44條序列（見(jiàn)表1）。表1 不同物種的hif-1基因序列來(lái)源table 1 the source of sequences for hif-1 in different species物種species序列數(shù)sample size序列號(hào)access number牦牛 (bos grunniens)2ay621118、dq838046家牛 (bos taurus)2ab018398、nm174339狨屬 (callithrix jacchus)3xm002753990、xm002753989、xm002753988犬 (ca

9、nis)9xm847185、xm860420、xm860386、ay455802、xm86286、xm860313、xm537471、xm860335、xm860401人 (homo sapiens)14nm001530、bc012527、hsu22431、af207602、af207601、af208487、af304431、ab500182、ab385144、bt009776、ay890352、nm181054、fj790247、ab073325獼猴 (macaca mulatta)5xm001099149、xm002805060、xm002805061、xm002805059、xm001

10、098939家鼠(mus musculus)5mmu59496.1、nm0104312.2、af003695.1、x95580.1、bc26139.1藏羚羊(panthlolps hodqsonii )1ay971808.1大鼠（rattus norvegicus）1y09507.1豬 (sus scrofa)2nw_003299341.1、ak3442041.2 分析方法首先使用bioedit 軟件將下載的44個(gè)不同物種序列的hif-1基因編碼區(qū)比對(duì)分析，其共有序列為425bp，然后利用 dansp 5.10軟件對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行遺傳多樣性分析，生成單倍型，并計(jì)算出遺傳距離。最后利用mega4.

11、1軟件的upgma方法對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行聚類(lèi)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。2 結(jié)果與分析2.1 不同物種hif-1基因核苷酸多樣性2.1.1 多態(tài)位點(diǎn)分析在所分析的共有片段為425bp的44條序列中，共篩查到130個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，比率占30.59%，其中單一多態(tài)位點(diǎn)11個(gè)；簡(jiǎn)約多態(tài)位點(diǎn)119個(gè)。不同物種內(nèi)的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)也各不相同（見(jiàn)表2），其中狨、犬、人、獼猴四個(gè)物種的hif-1基因核苷酸多態(tài)位點(diǎn)為零，說(shuō)明他們的hif-1基因12外顯子序列保守性強(qiáng)。表2 不同物種hif-1基因序列多態(tài)信息table 2 polymorphic information of hif-1 in different species物

12、種species多態(tài)位點(diǎn)數(shù)number of polymorphic sites突變總數(shù)total number of mutations單一多態(tài)位點(diǎn)singleton variable sites簡(jiǎn)約多態(tài)位點(diǎn)parsimony informative sites牦牛(bos grunniens)2220家牛(bos taurus)1110狨(callithrix jacchus)0000犬(canis)0000人(homo sapiens)0000獼猴(macaca mulatta)0000家鼠(mus musculus)2211豬(sus scrofa)22202.1.2 單倍型及其多樣性

13、44條hif-1基因序列中共生成13種單倍型。不同物種的單倍型數(shù)目也不盡相同(表3)，牦牛和豬的核苷酸多樣性、平均核苷酸差異數(shù)目最大，其次是家牛和家鼠，而獼猴、犬、人、狨單倍型只有一種。說(shuō)明牦牛和豬兩物種中hif-1基因存在較為豐富的遺傳多樣性。表3 不同物種hif-1基因的單倍型多樣性table 3 haplotype diversity of hif-1in different species物種序列數(shù)n單倍型數(shù)h單倍型多樣性hd核苷酸多樣性pi平均核苷酸差異數(shù)k家牛(bos taurus)2210.002511.000牦牛(bos grunniens)2210.005032.000獼猴(

14、macaca mulatta)51000犬(canis)91000人(homo sapiens)141000狨(callithrix jacchus)31000家鼠(mus musculus)530.80.002511.000豬(sus scrofa)2210.005032.000n, 序列數(shù); np, 單倍型數(shù); hd 單倍型多樣性; k, 平均核苷酸差異數(shù)目; pi, 核苷酸多樣性n, number of sequences; h, no. of haplotype; hd, haplotype diversity;k, average number of nucleotide diffe

15、rences; pi, nucleotide diversity2.1.3 物種間核苷酸歧異度、凈遺傳距離和遺傳分化各種群間核苷酸歧異度(dxy) 在0.003770.22312之間，凈遺傳距離在0.000000.21683之間，遺傳分化在-0.142861.0000之間(表四)，不同物種間核苷酸歧異度、凈遺傳距離和遺傳分化的變化范圍相對(duì)都很大，其中人和獼猴以及家牛和牦牛間的核苷酸歧異度、凈遺傳距離均最小，說(shuō)明人與獼猴的親緣關(guān)系、家牛與牦牛的親緣關(guān)系較近，而鼠與其它物種間的核苷酸歧異度和凈遺傳距離均最大，說(shuō)明大鼠與本研究中其他物種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。表4 不同物種核苷酸歧異度、凈遺傳距離和遺傳分化

16、table 4 nucleotide divergence, net genetic distance and genetic differentiation of haplotype in different species不同物種sus_scrofabos_grunniensbos_tauruscallithrixcanishomo_sapiensmacacamus_musculussus_scrofa0.064070.064070.115580.077890.105530.110550.19925bos_grunniens0.0691000.128140.090450.115580.12

17、0600.21935bos_taurus0.067840.003770.128140.090450.115580.120600.21683callithrix0.118090.130650.129400.105530.022610.027640.17261canis0.080400.092960 .091710.105530.097990.103020.19020homo_sapiens0.108040.118090.116830.022610 .097990.005030.17010macaca0.113070.123120.121860.027640.103020.005030.17010

18、mus_musculus0.203020.223120.219350.173870 .191460 .17136 0.17136上三角為凈遺傳距離(da)，下三角為核苷酸歧異度(dxy)above diagonal is net genetic distance(da)；below diagonal is nucleotide divergence(dxy) 2.3 不同物種hif-1基因遺傳分化分析根據(jù)不同物種之間核苷酸奇異度（dxy），用mega4.0 軟件的upgma方法構(gòu)建不同物種分子聚類(lèi)圖（圖1）。根據(jù)聚類(lèi)圖分析得出，牦牛與家牛首先聚為一類(lèi)，再與豬聚為一類(lèi)，然后與犬聚為一類(lèi)；人與獼猴

19、先聚為一類(lèi)再與狨聚為一類(lèi)，這兩大類(lèi)聚合后再與家鼠聚合。這說(shuō)明牦牛與家牛的親緣關(guān)系較近，人與獼猴的親緣關(guān)系較近，而家鼠與其他物種的親緣關(guān)系是最遠(yuǎn)的。圖1 根據(jù)物種間的遺傳分化構(gòu)建的聚類(lèi)圖figure1 phylogenetic tree based on genetic differentiation of species3 討論hif-1是一種調(diào)節(jié)蛋白，亞基被認(rèn)為是hif-1所特有的、受缺氧調(diào)控的亞基，在常氧狀態(tài)下，hif-1無(wú)活性，缺氧環(huán)境中與亞基(hif-1)結(jié)合, 進(jìn)而表現(xiàn)其活性促進(jìn)糖酵解酶轉(zhuǎn)錄增加。該基因的研究多集中在疾病和耐低氧方面，c1772t和g1790a位點(diǎn)研究較多4-6，此兩

20、個(gè)位點(diǎn)均位于12外顯子上，其突變型能顯著性提高h(yuǎn)if-1a的轉(zhuǎn)錄激活能力。人和豬hif-1a基因的編碼蛋白相似度較高為95%，其結(jié)構(gòu)包括bhlh、pas、氧依賴降解區(qū)（odd）、n、c端反式激活域（ntad、ctad）。其中odd的531-601區(qū)段富含thr殘基，與hif-1快速降解密切相關(guān)；576-785區(qū)段位于ntad和ctad之間，屬于抑制結(jié)構(gòu)域（id），抑制hif-1a在常氧狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄活性7。本研究中發(fā)現(xiàn)，不同物種hif-1基因12外顯子上篩出的多態(tài)位點(diǎn)包含人c1772t、a1790g兩位點(diǎn)，這個(gè)多態(tài)位點(diǎn)與耐低氧能力和一些疾病相關(guān)，而其他128個(gè)位點(diǎn)snps作用機(jī)理還需要進(jìn)一步研究

21、驗(yàn)證。該10個(gè)物種中家牛、牦牛和豬的單倍型多樣性為1，說(shuō)明這3個(gè)物種的hif-1遺傳多樣性高，遺傳資源豐富；而獼猴、犬、人和狨四個(gè)物種hif-112外顯子較為保守。另外，計(jì)算出的不同物種間核苷酸歧異度和凈遺傳距離比較大，說(shuō)明不同物種間遺傳分化已十分明顯。不同物種的44條hif-1基因序列構(gòu)建的聚類(lèi)圖中說(shuō)明，牦牛與家牛的親緣關(guān)系較近，人與獼猴的親緣關(guān)系也較近，而家鼠與其他物種的親緣關(guān)系是最遠(yuǎn)的，此結(jié)果與動(dòng)物分類(lèi)學(xué)及人們對(duì)動(dòng)物進(jìn)化的認(rèn)識(shí)基本一致8。hif-1基因12外顯子處于氧依賴降解區(qū)和抑制結(jié)構(gòu)域，在低氧狀態(tài)下，其多態(tài)性可能會(huì)造成基因的不穩(wěn)定進(jìn)而引發(fā)一系列反應(yīng)，使機(jī)體適應(yīng)環(huán)境的變化，而物種間不同

22、的多態(tài)位點(diǎn)能夠證明哪些物種可以適應(yīng)在低氧環(huán)境中生存，哪些物種更適應(yīng)于常氧環(huán)境中生存，具體的多態(tài)位點(diǎn)值得繼續(xù)深入研究。參考文獻(xiàn)1 semenza gl. hif-1 and human disease: one highly involved factor j. genes dev,2000,14:1983-1991.2 jiang, bh, rue e, wang, gl, et al. dimerization, dna binding and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1j. biol. chem, 1996,271:17771-17778.3 riddle sr, ahmad a, ahmad s, et al. hypoxia induces hexokinase ii gene expression in human lung cell line a549j. am j physiol lung cell mol physiol.2000,278(2):l407-16.4 tanimoto k, yo shiga k, eg