免疫組化EnVision二步法染色

1、 石蠟切片免疫組化EnVision二步法染色 第一組2組1、 實(shí)驗?zāi)康模?.掌握石蠟切片免疫組化EnVision二步法染色的原理、步驟及結(jié)果分析2.了解石蠟切片免疫組化EnVision二步法染色的臨床應(yīng)用二、實(shí)驗原理： 免疫組織化學(xué)技術(shù)是應(yīng)用抗原與抗體接觸后可形成“抗原抗體復(fù)合物”的化學(xué)反應(yīng)，以檢測組織或細(xì)胞內(nèi)抗原（或抗體）的技術(shù)。EnVision二步法染色是通過一個葡聚糖分子，將多個抗小鼠或抗兔的二抗與多個辣根過氧化物酶（）或堿性磷酸酶（AP)聚合在一起，形成一個免疫組化檢測系統(tǒng)。顯色原理：將抗原抗體結(jié)合的部位顯示出來。常用（二氨基聯(lián)苯胺）：陽性細(xì)胞染成棕黃色(顯色劑)，蘇木素復(fù)染，核淡蘭色

2、，顯色反應(yīng)穩(wěn)定，不褪色，應(yīng)用最廣。顯色原理： 酶催化劑 2底物 供氫體 反應(yīng)原理： 2 2 (第一復(fù)合物) 2 電子供體 (氧化型)生成不溶于水和有機(jī)溶劑的有色終產(chǎn)物(棕褐色顆粒)和水，沉著在原來的位置上。3、 實(shí)驗試劑與器材：試劑：二甲苯試劑，梯度乙醇（70%、80%、90%、100%、），蒸餾水，3%H2O2，檸檬酸鹽緩沖液，PBS（磷酸鹽緩沖液），鼠抗人CK，鼠抗人C-erbB-2，HRPanti-Mouse/Rabbit，DAB顯色劑，蘇木素試劑，1%鹽酸乙醇，中性樹膠，自來水器材：試劑缸、試劑瓶若干；載玻片及蓋玻片若干；架子；石蠟切片；微波爐;37度恒溫箱；顯微鏡四、實(shí)驗地點(diǎn)：科技十

3、樓，病理實(shí)驗室五、實(shí)驗時間：2011.12.21六、組員及分工：11120062申海濤，11120111黃冉冉，11120114譚輝，11120140譚麗，11120145張力，分別參與各步驟操作與計時。七、記錄人：黃冉冉八、實(shí)驗步驟：1.二甲苯10minX 2 次 2.梯度梯度乙醇水化，100%、90%、80%、70%由高到低每缸浸泡1min 3.蒸餾水洗片刻4. 3%H2O2 去除內(nèi)源性酶，室溫 10min5. 蒸餾水洗 3minX 2 次 6. 食管癌（CK）、乳腺癌（C-erbB-2）切片微波抗原修復(fù)（將切片放入檸檬酸鹽緩沖液放入微波爐待煮沸后沸騰15min，室溫冷卻）7. 蒸餾水洗

4、3minX 2 次 8. PBS洗 3minX 2 次 9. 加鼠抗人CK（50微升）孵育1小時 37C，鼠抗人C-erbB-2（50微升）孵育1小時 37C10. PBS洗 3minX 2 次11. （CK、C-erbB-2）：加HRPanti-Mouse/Rabbit孵育30min 37C12. PBS洗 3minX 2 次13. DAB顯色（棕褐色），鏡下控制；（鏡下觀察細(xì)胞膜染色即可沖洗）14. 自來水沖洗5min15. 蘇木素復(fù)染，水洗16. 1%鹽酸乙醇分色2s，水洗17. 梯度梯度乙醇脫水，70%、80%、90%、100%由低到高每缸浸泡2min18. 切片風(fēng)干后中性樹膠封片9、

5、 實(shí)驗結(jié)果與分析：食管癌CK：結(jié)果：低倍顯微鏡下觀察染色陽性染色強(qiáng)，陽性顆粒定位性佳，組織結(jié)構(gòu)清晰，除了出血部位和炎性區(qū)域有輕度背景外，多數(shù)組織片均無顯著背景染色 。 高倍鏡下見癌巢組織內(nèi)，可見大量細(xì)胞，胞漿呈棕黃色、核呈藍(lán)紫色，堆積成癌巢。細(xì)胞間隙可見透明或淡色的背景為未染色間質(zhì)成分。部分可見無核、疏松淡染的結(jié)構(gòu)堆積為壞死成分。部分可見細(xì)胞核藍(lán)紫色胞漿淡色或透明為壞死細(xì)胞核固縮。分析：由原理得胞漿呈棕黃色為抗原抗體結(jié)合的部位，可以得知在食管癌CK因子表達(dá)在細(xì)胞胞漿。乳腺癌C-erbB-2：結(jié)果：低倍顯微鏡下觀察染色陽性染色強(qiáng)，陽性顆粒定位性佳，組織結(jié)構(gòu)清晰，除了出血部位和炎性區(qū)域有輕度背景外，多數(shù)組織片均無顯著背景染色 。 高倍鏡下見癌巢組織內(nèi)，可見大量細(xì)胞，胞膜呈棕黃色、胞漿透明或淡色、核呈淡藍(lán)色，堆積成癌巢。細(xì)胞間隙可見透明或淡色的背景為未染色間質(zhì)成分。部分可見無核、疏松淡染的結(jié)構(gòu)堆積為壞死成分。部分可見正常的腺體官腔結(jié)構(gòu)。分析： 由原理得胞膜呈棕黃色為抗原抗體結(jié)合的部位，可以得知在乳腺癌C-erbB-2因子表達(dá)在細(xì)胞胞膜。十、注意事項： 1.脫蠟要徹底，應(yīng)定期更換脫蠟液。 2.DAB染色時間控制要適當(dāng)。 3.染色、分化的時間