血紅素加氧酶-1誘導對移植腎保護作用探討

1、血紅素加氧酶-1誘導對移植腎的保護作用劉迎，李學朝，王靜，楊江根急性腎功能衰竭是腎移植術后最常見的并發(fā)癥之一，且死亡率一直居高不下，因此腎移植術后腎功能的保護是研究的熱門課題。而血紅素加氧酶（heme oxygenase-1 H0-1）在急性腎損傷中對腎功能具有保護作 用，且H0-1的誘導用于動物模型中缺血/再灌注的腎損傷保護已見報 道。本實驗利用大鼠制作腎移植模型，通過誘導H0-1，探討其用于腎移植后腎功能保護的可行性。1材料與方法1. 1模型建立與分組SD雄性大鼠80只，鼠齡23個月，體重200350g，近交系， 由深圳市人民醫(yī)院動物實驗室提供。隨機取20只作為腎移植供體，其余隨機分為三組

2、，每組各 20只，分別為腎移植組（A組）、HO-1誘導劑 氯化高鐵血紅素（hemin，購自Sigma公司）預處理組（B組）和假手術組（C 組）。預處理組在術前每天氯化高鐵血紅素30mg/kg皮下注射，共注射2d，末次注射24h后行腎移植手術，假手術組僅分離左腎動脈。1. 2血肌酐測定在手術后4、12、24和48h，每個時間點取每組5只，分別測血肌 酐。1. 3病理學檢測各組在腎移植后4、12、24和48h，立即開腹取腎。腎組織經(jīng) 4% 的多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片厚4財，行HE、PAS、PASM、Masson 染色。檢查腎小球硬化采用 RAIF等的半定量法評估腎小球硬化程度， 每張切片觀察4

3、0個腎小球，根據(jù)腎小球硬化灶所占腎小球比例，分為 04+(0表示腎小球無病變，1+表示1個腎小球25%受損，2+表示26% 50%受損，3+表示50%75%受損，4+表示76%100%受損)，然后 計算腎小球硬化指數(shù)(glomerular seierotic intex, GSI)。觀察腎間質(zhì)炎癥 細胞浸潤及纖維化情況。1. 4 HO-1免疫組織化學檢測小鼠抗大鼠HO-1單抗購自santa crllz公司，免疫組織化學試劑盒 由北京中山生物技術有限公司提供，以SABC法進行免疫組織化學檢測，按試劑盒操作步驟進行，光學顯微鏡下觀察及攝片。半定量分析法， 根據(jù)光鏡下染色分為：無染色為 0分；偶有染

4、色為1分；局灶染色為2 分；彌漫染色為3分。1. 5統(tǒng)計學分析采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件分析，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)標準差表示，組間 差異用未配對資料t檢驗，以PV 0.05為差異有顯著性。2. 1腎功能變化與C組相比，腎移植后 A、B兩組血肌酐明顯升高(PV 0.05), 24h 達到峰值，但B組明顯低于A組(PV0.05),見表1。I表1各時間點血肌BH u mol/L)變化1組別12 h24 h48 haS 87.59 16.03 lS0.16i29.6811 240.54 44.1713 85.97 2O.93in B組 90,88 2078 11(113 21851294313W4胭 52

5、.75 24.1 卩加Cffl 46,58 24364432 19-6047.22 18.4S46.49 2285 注：1)與C組比較tP0.05i )U組與A組比較,P0.05；3)與 24h 比較fP 13,44 1047型B組20.79 14341)IJ 24.0626.33l2 6.83 t IIS1Cffi 2.98 1.362.16 0.94137 0.872.01 1.02注川)與C齟比較,P0 05；2) E組與A組比較,P0.05;3) 24 h 比較,P0.052. 3 HO-1在腎小管的表達A組、B組都較C組差異有顯著性(PV 0.05), B組與A組比較差異也有顯著性(

6、PV 0.05)，定量分析見表3。*3各時間HO-1的袁達組別4h12h24 h43hAffi0.21 + 0381.57 + 0.O31)139 + 0.491.34+0471J,3Bia139+OS3討 論在幾乎所有的移植手術中，臟器均有不同程度的缺血/再灌注。缺血/再灌注損傷不僅會導致移植物早期失去功能，而且是慢性排斥反應的重要因素。目前認為缺血/再灌注損傷的發(fā)生與氧自由基、鈣超載、 白細胞浸潤等有關，人們還發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮素、一氧化氮和細胞凋亡等也通過 各種途徑參與缺血/再灌注損傷。 缺血/再灌注損傷是腎移植后發(fā)生急2.59 + 155sW3*32 4 54問2,63+0.2S:bleta0.

7、01 + 0.0400.05 + 0,070注：】）與C組比較,P0.05:與扎組比較.P0.05；3）與24 h比較屮0.03性腎功能衰竭，導致腎移植失敗的重要原因。有實驗證實別嘌吟醇、超 氧化物歧化酶(superoxide dismutase SOD)、維生素E、維生素c、丹參 等中草藥都具有一定的抗缺血/再灌注損傷作用，但都不能完全消除缺血/再灌注對組織器官的影響。HO最早是由TENHUNEN等于1968年在動物肝臟微粒體中發(fā)現(xiàn)的。目前人們已知H0的同工酶有三種，即HO-1、HO-2和H0-3。1992年NATH等首次發(fā)現(xiàn)血紅蛋白的分解明顯增加了H0-1的表達。最近，他們進一步在H0-1

8、基因敲除的小鼠模型基礎上構建了兩種不同的急性 腎衰模型即缺血/再灌注及血紅素的刺激誘導H0-1mRNA蛋白的表達，6h內(nèi)達到最高峰。隨后他們用中卜啉抑制部分小鼠H0-1的活性，繼而其血紅素濃度增加、小管上皮細胞嚴重受損，腎功能惡化。相反，H0-1活性未被抑制的小鼠缺血-再灌注24h后的腎功能以及血紅素濃度 均恢復正常。這項研究表明，H0-1在防止腎小管上皮細胞氧化損傷中 的重要性，同時顯示其對急性腎小管損傷后腎功能恢復起到重要的作 用。氯化高鐵血紅素(hemin)對H0-1有較強的誘導作用，其機制是通過與H0-1轉錄起始位點上游的AP-1結合位點相結合，誘導氯霉素乙酰 轉移酶(CAT)的活性，

9、從而提高H0-1的mRNA含量。本實驗中hemin 誘導組的H0-1活性大大增強，與之相對應的該組大鼠腎臟結構和功能 的損害均得到明顯減輕，表明 hemin可以誘導H0-1的表達，并對腎移 植中腎細胞起保護作用。在腎衰竭模型中，H0-1表達上調(diào)參與腎小管上皮細胞的抗氧化保 護機制。H0-1mRNA隨腎缺血時間延長而表達增加， 而缺血超過60min 后H0-1mRNA反而下降，說明H0-1誘導性表達與缺血/再灌注腎損 傷的可逆性相關。利用血紅素誘導腎小管細胞H0-1的表達，發(fā)現(xiàn)處理后腎小管細胞具有抵抗缺血/再灌注損傷的能力，腎功能明顯改善，證實了 H0-1對腎小管細胞的保護作用。在缺血/再灌注損傷模型中，H0-1表達上調(diào)參與腎小管上皮細胞 的抗氧化保護，H0-1mRNA隨腎缺血時間延長而表達增加，而缺血超 過60min后H0-1mRNA反而下降，說明H0-1誘導性表達與缺血再灌 注腎損傷的可逆性相關。而本研究結果也顯示，缺血60min的缺血/再 灌注腎損傷的腎功能可恢復，同時，H0-1表達與腎小管上皮細胞缺血/再灌注損傷程度及腎功能受損呈正相關，其與缺血/再灌注損傷區(qū)域 嚴重程度有平行關系，但在損傷特別嚴重區(qū)域的腎小管H0-1表達反而不明顯，這與文獻報道相