654524101畢業(yè)設(shè)計（論文）中心組合設(shè)計優(yōu)化酶解藍圓鲹制備降血壓肽

1、中心組合設(shè)計優(yōu)化酶解藍圓鲹制備降血壓肽摘 要高血壓是引發(fā)心血管疾病，如心力衰竭、中風(fēng)、冠心病和心肌梗塞等的重要危險因子，在世界范圍內(nèi)已成為嚴(yán)重的社會公共衛(wèi)生問題。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(acei)是目前用于預(yù)防治療高血壓的重要藥物之一，但化學(xué)合成的acei易引起惡心、嘔吐、腹瀉等副作用。因此，具有安全性高、副作用小、易吸收等優(yōu)點的食源性acei尤其引人注目，已成為生物活性肽研究領(lǐng)域的熱點之一。蛋白酶水解法是一種新興的水解蛋白質(zhì)的方法。它和化學(xué)水解法相比，具有很多的優(yōu)點，如條件溫和，易控制，水解效率高，其在營養(yǎng)成分保持方面更是具有其獨特的優(yōu)點。目前人們利用酶工程技術(shù)已經(jīng)從雞肉、羅非魚、玉米蛋白、

2、雞蛋蛋白等食物原料中制取降血壓肽。蛋白酶的催化能力不但與本身的性質(zhì)有關(guān)，而且還和它所處的環(huán)境有較大關(guān)系，如催化環(huán)境的溫度、ph值、底物蛋白的性質(zhì)等。本實驗以藍圓鲹魚肉蛋白為原料，用木瓜蛋白酶酶解制備降壓肽。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，結(jié)合三因素五水平的central composite模型響應(yīng)面設(shè)計，通過design-expert軟件處理，建立木瓜蛋白酶酶解藍圓鲹蛋白制備降血壓肽的三元二次回歸正交模型。最終求得模型方程的最大值點為酶解溫度52.55、ph7.97、e/s 0.03371。在此條件下，預(yù)測的水解度為24.32，這與驗證實驗值存在可接受的誤差。結(jié)果表明：中心組合設(shè)計是優(yōu)化酶解藍圓鲹制備降

3、血壓肽的有效途徑。 關(guān)鍵詞：酶解 藍圓鲹 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑 中心組合optimization of prepareing antihypertensive peptides from decapterus maruadsi by central composite design process abstracthypertension is an important risk factor of triggering cardiovascular diseases such as heart failure,stroke,coronary heart diseases,myocardia

4、l infarction and so on.it had become a worldwide serious social problem of public health. angiotensin i-converting enzyme inhibitory (acei) is one kind of important drugs for prevention and treatment of hypertension, but chemical synthesis of acei is extremely easy to cause queasiness, vomit, diarrh

5、ea and other side effects. therefore, acei peptides from food protein are especially noticeable because of its advantages which includeing safty,little side effects, easily absorbed, and so on, and become one of the focuses in the bioactive peptides research fields.hydrolyzing with proteolytic enzym

6、e is a new method of protein hydrolysis. it has many advantages, compared with chemical hydrolysis , such as mild reactive conditions , fine control, hydrolysis of high efficiency, besides,in terms of nutrients to maintain, it has a unique advantage. at present,preparing of antihypertensive peptides

7、 from food-stuff,such as ingredients the chicken, tilapia, corn protein, egg protein and so on, by enzyme engineering technology, has been reported.the capability of catalysis by protease not only depends on the the very nature of itself, but also relates with its environment where the catalytic rea

8、ction takes place. it must not be disregarded the temperature of environment for catalytic reaction,ph, nature of the substrate protein etc.decapterus maruadsi proteins were hydrolyzed by papain to prepare antihypertensive peptides. the effects of four crucial factors on the degree of hydrolysis (dh

9、) of blue scad proteins were analyzed by single-factor method. subsequently, a three-factor/five-level central composite experimental design combining with response surface methodology (rsm) and quadratic pro-gramming (qp) was employed for maximizing the papain-catalyzed hydrolysis of decapterus mar

10、uadsi proteins and a quadratic regression model was obtained using the design-expert software.basing on the maximum point obtained by the model equations, the hydrolysis conditions were determined as follows: temperature 52.55, ph 7.97, and e/s 0.03371.under such conditions, the predicted hydrolytic

11、 of degree(hd) was 24.32, which had acceptable error with the experimental values. these results indicated that the central composite design(ccd) were efficient approaches for optimization of prepareing antihypertensive peptides from decapterus maruadsi.keyword: hydrolysis;decapterus maruadsi;angiot

12、ensin-converting enzyme inhibitor;central composite design目 錄摘 要iabstractii目 錄iv第一章 緒論11.1 高血壓及其危害11.2 食品源降血壓肽的研究與制備11.3 降血壓肽的作用機理21.4 酶法制備降血壓肽31.5 研究目的、意義及主要內(nèi)容4第二章 實驗部分52.1 實驗材料52.2 儀器設(shè)備52.3 脫脂藍圓鲹魚粉的制備52.4 蛋白質(zhì)含量的測定62.5 酶解藍圓鲹魚肉蛋白82.5.1 酶解工藝82.5.2 水解度的測定92.6 酶解條件優(yōu)化10第三章 實驗結(jié)果與分析113.1 藍圓鲹魚粉的蛋白質(zhì)含量113.2

13、響應(yīng)面實驗優(yōu)化酶解工藝條件113.2.1 響應(yīng)面實驗分析與回歸方程的建立113.2.2 響應(yīng)曲面的分析133.3 驗證實驗16第四章 結(jié)論與展望174.1結(jié)論174.1.1 藍圓鲹的蛋白質(zhì)含量174.1.2 酶解藍圓鲹魚肉蛋白174.1.3 中心組合優(yōu)化設(shè)計174.2 展望17參考文獻18附錄（一）英文文獻原文21附錄（二）英文翻譯36致 謝47第一章 緒論1.1 高血壓及其危害 高血壓病是最常見的心血管疾病，它不僅患病率高，而且是引起冠心病、心肌梗塞、腦卒中、心臟病及腎功能衰竭的最主要的發(fā)病因素。其根據(jù)起病和病情進展的緩急及病程的長短可分為兩型，緩進型（chronic type）和急進型（a

14、ccellerated type）高血壓，前者又稱良性高血壓，絕大部分患者屬此型，后者又稱惡性高血壓，僅占高血壓病患者的1%5%。這兩種高血壓都對人類健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。在世界范圍內(nèi)，每年有760萬的過早死亡（約占全球總量的13.5）和92萬的傷殘調(diào)整損失壽命年(dalys)（約占全球總量的6.0）是由高血壓引起的，全球約54的中風(fēng)和47的缺血性心臟病也是緣于高血壓1。隨著我國經(jīng)濟的飛速發(fā)展，人民生活水平的提高，人民平均壽命的延長，我國將步入老齡化社會，患病率將明顯上升。在過去的幾十年中，中國高血壓的患病率和絕對數(shù)正在快速增長。例如，中國成年人中估計的高血壓人數(shù)已經(jīng)從1960年的3000萬增

15、加到1980年的5900萬，1991年又增加到9400萬，2002年我國高血壓的患病率更是達到了27.2，人口數(shù)已達1.3 億2。這種升高的勢頭仍在持續(xù)，并且高血壓大大增加了冠心病、心力衰竭、腦卒中的危險，形勢十分嚴(yán)峻，直至發(fā)生臨床跡象如心臟病發(fā)作、腦血管破裂等導(dǎo)致死亡，因此高血壓被稱為“無聲殺手”，高血壓的這種高發(fā)病率、高并發(fā)癥、高致殘率嚴(yán)重影響了人體健康，其己成為成為全球性的重大公共衛(wèi)生問題。治療和預(yù)防高血壓對提高人類的健康水平，延長壽命有著重要的意義。因此，在日常生活中控制高血壓的發(fā)展進程具有特殊的意義。1.2 食品源降血壓肽的研究與制備天然食品中的降血壓肽通常是由蛋白質(zhì)水解酶在溫和條件

16、下水解蛋白質(zhì)而獲得的一類多肽，食用安全性高，且它們共同的突出優(yōu)點是對高血壓患者可以起到降壓作用，且對血壓正常的人無降壓作用，同時還具有免疫、促進減肥及消化吸收等生理功能3。因此，對其的研究發(fā)展非常迅速。oshima3等于1979年首次報道了利用細菌膠原酶水解凝膠并從其水解物中分離出了 6種降血壓肽。此后 ,研究者相繼成功地從大豆、酪蛋白、玉米、酒糟等眾多食物蛋白質(zhì)中獲得了ace抑制肽。日本是研究ace抑制肽最多的國家，主要從乳源蛋白質(zhì)中提取，其次是魚蛋白，其中已有一部分實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。我國在這方面的研究尚屬起步階段。但是我國具有豐富廉價的動植物蛋白資源。如何合理利用好現(xiàn)有的資源加工制備高活性a

17、ce 抑制肽是今后研究方向之一。這些研究的進展將促進具有良好的市場前景和社會效益的ace抑制肽的開發(fā)應(yīng)用。目前，酶解蛋白制備降血壓肽的研究從來源上主要集中在植物蛋白（包括大豆蛋白、玉米蛋白和其他一些植物蛋白資源），動物蛋白（包括陸地動物蛋白源、海洋蛋白源）。魚類蛋白是一種優(yōu)質(zhì)動物蛋白，不僅蛋白質(zhì)含量高，氨基酸模式更接近人體需要。酶水解法條件溫和，氨基酸不被破壞，構(gòu)型不發(fā)生變化。在各類多肽的生產(chǎn)中，酶解法是目前研究得最多的一種方法。自從發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)經(jīng)酶解處理可以釋放出具有各種活性多肽以后，酶解法處理蛋白質(zhì)就引起了人們的廣泛關(guān)注。它是目前生產(chǎn)生物活性肽主要采用的方法。如果能夠通過酶法加工魚類蛋白獲得

18、抑制ace 的活性肽，對充分利用我國的蛋白質(zhì)資源、促進人們生活質(zhì)量的提高將會收到很好的經(jīng)濟效益和社會效益。其中藍圓鲹因為價格低廉，富含蛋白質(zhì)，而具有較高的研究價值4。藍圓鲹，鱸形目鲹科圓鲹屬的一種。又稱池魚，巴浪魚。暖水性中上層魚類，分布于中國海南省到日本南部；在東海主要分布于中國福建沿岸；南海密集區(qū)在中國臺灣淺灘南部、粵東碣石灣外近海、珠江口、海陵島及海南省東北部近海。藍圓鲹為南海經(jīng)濟魚類之一，廣西的產(chǎn)量也很大，其資源密度在2000-2001年度為22.1kg/km，達到總漁獲比例的1.75。藍圓鲹肉質(zhì)堅實，口感普通，為低值魚，但是蛋白含量高，以藍圓鲹為研究對象具有高附加值。1.3 降血壓肽

19、的作用機理血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ace)是一種膜結(jié)合的二肽羧基肽酶(dipeptidly carbonoxypeptidase)，廣泛存在于體內(nèi)，在肺毛細管內(nèi)皮細胞的含量最為豐富。(ace)是多功能酶，在體內(nèi)腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system，ras)和激肽釋放酶激肽系統(tǒng)(kallikreinkinin system，kks)中，對血壓的調(diào)節(jié)起著重要的作用，見圖 11。ras和kks在血壓調(diào)節(jié)方面是一對相互拮抗的體系，其平衡協(xié)調(diào)對維持正常血壓有重要作用。ace在兩者系統(tǒng)中對血壓調(diào)節(jié)起重要作用，ace活力升高破壞了正常體液中升壓和降壓體系的平衡，導(dǎo)致血管緊張素生成過

20、多，而體系中擴血管物質(zhì)激肽和前列腺素合成減少，此三種因素共同存在使血壓升高。抑制ace活性對降低血壓有積極的影響，因而尋找更有效的抑制劑一起引起人們極大的興趣。圖 11 ace作用機制fig.11 mechanism of ace降血壓肽指的是一類具有抑制ace活性的多肽物質(zhì) ,這些多肽的氨基酸序列和肽鏈長度各有不同，但都具有類似的功能。ace擁有兩個具有活性的作用位置，分別為n區(qū)和c區(qū)，它們具有幾乎相同的功能，只是對不同底物的親和力不同。ace抑制肽是對活性區(qū)域親和力較強的競爭性抑制劑，它們與ace的親和力比血管緊張素i或舒緩激肽更強，而且也較不易從ace結(jié)合區(qū)釋放，從而阻礙ace催化水解血

21、管緊張素i成為血管緊張素ii，以及催化水解舒緩激肽成為失活片段的兩種生化反應(yīng)過程，起降血壓作用6。1.4 酶法制備降血壓肽目前，制備降血壓肽采用的工藝主要有：酶解法、化學(xué)合成、直接從發(fā)酵食品中分離提取法、化學(xué)水解法、微生物發(fā)酵法7等。這些方法都有一定的適應(yīng)范圍和特點。其中酶法生產(chǎn)活性肽安全性極高、能在溫和的條件下進行定位水解分裂產(chǎn)生特定的肽，且水解過程易控制，并且保存氨基酸的營養(yǎng)價值，近幾年報道的活性肽的制備方法皆為酶解法。酶法水解所生產(chǎn)的多肽具有極強的活性和多樣性，具有重要的生物學(xué)功能，最易被人體吸收，可參與人體生理過程，參與人體的神經(jīng)、激素內(nèi)分泌系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)，對人體健康起著奇特的作用8。

22、考慮到酶法生產(chǎn)活性肽的安全性和成熟性等優(yōu)點，本研究決定使用酶法制備降血壓肽。1.5 研究目的、意義及主要內(nèi)容廣西南臨北部灣。北部灣是南海西北部一個天然的半封閉海灣，這片海域區(qū)位優(yōu)越、資源豐富。北部灣海域?qū)贌釒ШＱ?，適于各種魚類繁殖生產(chǎn)，加之陸上河流攜帶大量的有機物及營養(yǎng)鹽類到海洋中去，使北部灣成為中國高生物量的海區(qū)之一。廣西魚類資源以優(yōu)質(zhì)、無污染而在國內(nèi)外市場享有聲譽。魚類總資源為75萬噸，其中底棲魚類資源量為35萬噸，約占總資源量47%，總可捕量約為40萬噸。但是海水魚特別是低值魚的加工利用率低，例如，傳統(tǒng)的加工工藝就是把魚體經(jīng)過煙熏烘炸烤鹽漬等初級加工后制成魚糜魚腸熏魚魚干等產(chǎn)品，不僅原料

23、得不到充分利用，加工所得產(chǎn)品附加值也低，科技含量也不高，因此，如何避免海水魚原料的浪費、合理的開發(fā)利用魚類優(yōu)質(zhì)蛋白使其增值成為低值魚加工方面亟待解決的問題。我國臨床常用的一線抗高血壓藥主要包括利尿藥、腎上腺素受體阻斷藥、鈣通道阻滯藥和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制藥等。雖然這些藥具有很好的降壓效果，但都具有一定的副作用或不良反應(yīng)。而來源于食品的降血壓肽是一類能夠降低人體血壓的小分子肽的總稱。由于其降血壓效果明顯且對正常血壓無影響、無副作用等優(yōu)點，已成為目前研究的熱點。而基于酶法制備蛋白質(zhì)的各種優(yōu)異性，本實驗將使用該法進行降血壓肽的優(yōu)化研究。酶解蛋白質(zhì)，需要對蛋白質(zhì)的原料的成分有充分的了解。而測定原料的蛋

24、白質(zhì)含量是最重要的一項成分測定。目前常用的蛋白質(zhì)測定方法包括分光光度法、雙縮脲法、凱氏定氮法、電泳分析法、質(zhì)譜分析法等。凱氏定氮法是目前分析含氮化合物最常用的方法，適用樣品范圍廣泛、 測試結(jié)果準(zhǔn)確9。而且考慮到本實驗室的設(shè)備條件，本實驗決定使用凱氏定氮法。不同的蛋白質(zhì)水解物的ace抑制活性各不相同，而且達到最大抑制活性所需的水解時間也各不相同。酶解蛋白質(zhì)制備高活性ace抑制肽存在一個最佳的時間點或是水解度。酶的水解程度受多個方面的因素影響，其主要的影響酶解反應(yīng)的四個因素：溫度，時間，ph值和酶添加量。這幾個因素影響可能是單獨的或者相互的。在此可以用響應(yīng)面模型描述因素間的組合獲得對酶解的最優(yōu)條件

25、。響應(yīng)面法(response surface methodology,rsm)，是一種實驗條件尋優(yōu)的方法，適宜于解決非線性數(shù)據(jù)處理的相關(guān)問題。它囊括了實驗設(shè)計、建模、檢驗?zāi)Ｐ偷暮线m性、尋求最優(yōu)組合條件等眾多試驗和統(tǒng)計技術(shù)；通過對過程的回歸擬合和應(yīng)曲面、等高線的繪制、可方便地求出相應(yīng)于各因素水平的響應(yīng)值。在各因素水平的響應(yīng)值的基礎(chǔ)上，可以找出預(yù)測的響應(yīng)最優(yōu)值以及相應(yīng)的實驗條件。響應(yīng)面優(yōu)化法，考慮了試驗隨機誤差；同時，響應(yīng)面法將復(fù)雜的未知的函數(shù)關(guān)系在小區(qū)域內(nèi)用簡單的一次或二次多項式模型來擬合，計算比較簡便，是降低開發(fā)成本、優(yōu)化加工條件、提高產(chǎn)品質(zhì)量、解決生產(chǎn)過程中的實際問題的一種有效方法。響應(yīng)面優(yōu)

26、化法，將實驗得出的數(shù)據(jù)結(jié)果，進行響應(yīng)面分析，得到的預(yù)測模型，一般是個面，即所獲得的預(yù)測模型是連續(xù)的。與正交實驗相比，其優(yōu)勢是：在實驗條件尋優(yōu)過程中，以連續(xù)的對實驗的各個水平進行分析，而正交實驗只能對一個個孤立的實驗點進行分析。在這里，將使用central composite design-響應(yīng)面優(yōu)化分析10。central composite design，簡稱ccd，即中心組合設(shè)計，有時也稱為星點設(shè)計。其設(shè)計表是在兩水平析因設(shè)計的基礎(chǔ)上加上極值點和中心點構(gòu)成的，通常實驗表是以代碼的形式編排的，實驗時再轉(zhuǎn)化為實際操作值，（一般水平取值為 0, 1, , 其中0為中值，為極值，=f*（1/ 4）

27、；f 為析因設(shè)計部分實驗次數(shù), f = 2k或f = 2 k（1/ 2），其中 k為因素數(shù)，f = 2 k1/ 2 一般5因素以上采用，設(shè)計表有下面三個部分組成：(1) 2k或 2 k （1/ 2）析因設(shè)計。(2)極值點。由于兩水平析因設(shè)計只能用作線性考察，需再加上第二部分極值點, 才適合于非線性擬合。 如果以坐標(biāo)表示, 極值點在相應(yīng)坐標(biāo)軸上的位置稱為軸點(axial point)或星點( star point)，表示為(,0, 0) , (0, , 0) , , (0, 0, )星點的組數(shù)與因素數(shù)相同。(3)一定數(shù)量的中心點重復(fù)試驗。中心點的個數(shù)與ccd設(shè)計的特殊性質(zhì)如正交(orthogon

28、al)或均一精密(uniform precision)有關(guān)。本實驗的目的是：以藍圓鲹魚粉為主要原料，用半微量凱氏定氮法測定藍圓鲹的蛋白質(zhì)含量；研究藍圓鲹蛋白在木瓜蛋白酶催化條件下酶解的最優(yōu)工藝參數(shù)，通過研究溫度，時間，ph和加酶量四因素對水解度的影響，確定單因素試驗的最優(yōu)工藝條件；而后根據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)計ccd響應(yīng)面，在底物濃度固定的條件下，優(yōu)化溫度、ph和加酶量對水解度的交互影響，從而確定交互影響的最優(yōu)酶解工藝條件。第二章 實驗部分2.1 實驗材料本實驗所采用的主要材料和試劑：藍圓鲹：采購于北海水產(chǎn)農(nóng)貿(mào)市場，-18冷凍備用；木瓜蛋白酶：廣州遠天酶制劑廠；硫酸：分析純，廉江市愛廉化試劑有限公

29、司；鹽酸: 分析純，汕頭市西隴化工廠有限公司；氫氧化鈉：分析純，成都市科龍化工試劑廠。2.2 儀器設(shè)備本實驗所采用的主要儀器：ae2045電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；101c-2電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海實驗儀器廠有限公司；hh-s型恒溫水浴鍋：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；a-88型組織搗碎勻漿機：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；凱氏定氮裝置：實驗室組裝；bs 110s型電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；s212恒速攪拌器：上海申順生物科技有限公司；starer 3c實驗室ph計：奧豪斯儀器（上海）有限公司；e-201-c型ph復(fù)合電極：上海精密科學(xué)儀器有限公司。2.3 脫脂藍圓鲹魚粉的

30、制備魚粉的細度、干燥方式和脫脂的效果對酶解實驗具有重要意義18。烘干對酶解蛋白的色澤，澄清度影響很大，經(jīng)過烘干處理的魚粉能有效減少水分含量，增加保質(zhì)期；脫脂魚粉制備的酶解蛋白的風(fēng)味、色澤，溶液澄清度較脫脂前有明顯改善，其氨基酸含量，水解得率，及水解效果均高于脫脂前。因此，原料處理采用烘干干燥和脂肪抽提可生產(chǎn)出高質(zhì)量的蛋白水解物，提高其附加值。本實驗的魚粉制備過程如下：自來水解凍備用藍圓鲹 去頭尾、去骨架 靜置0.5h去掉大部分的水 置于80的干燥箱干燥24h 用a-88型組織搗碎勻漿機將魚片粉碎成魚粉 過20目篩 選用正己烷做溶劑，魚粉和溶劑之比為1：3(v/w)，間歇震動1h 漿液過濾，固體

31、洗滌使用布氏漏斗和正己烷 置于80的干燥箱干燥24h 將脫脂藍圓鲹魚粉置于冰柜備用2.4 蛋白質(zhì)含量的測定蛋白質(zhì)含量的測定采用凱氏定氮法，凱氏定氮裝置如下圖 21所示： 圖 21 凱氏定氮裝置fig.21 equipment of kjeldahl determination （1）試驗原理 以硫酸銅為催化劑，用濃硫酸消化試樣，使有機氮分解為氨，與硫酸生成硫酸銨。然后加堿蒸餾使氨逸出，用硼酸溶液吸收，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定。根據(jù)鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定的消耗量計算蛋白質(zhì)的含量。（2）試劑 400g/l氫氧化鈉溶液：稱取40g氫氧化鈉溶于適量蒸餾水中，冷卻后，稀釋至100ml。20g/l硼酸溶液：稱取20

32、g硼酸加蒸餾水中稀釋至1000ml?；旌现甘緞? 份甲基紅乙醇溶液（1g/l）與 5 份溴甲酚綠乙醇溶液（1g/l）臨用時混合。（3）方法步驟：a. 消 化 稱取 0.5g左右藍圓鲹魚粉加入定氮瓶中，再向定氮瓶內(nèi)加入0.2g硫酸銅、6g硫酸鉀及20ml濃硫酸。加熱電爐開始消化。經(jīng)4小時后，溶液呈淺藍綠色透明液且消化瓶底部沒有黑色碳顆粒時，消化結(jié)束。冷卻后，向定氮瓶中加入20ml蒸餾水，冷卻后轉(zhuǎn)入100m1容量瓶中定容。b. 加 樣 打開夾子9，取下棒狀玻塞6，用吸量管吸取10ml稀釋好的消化液，加到反應(yīng)室小玻杯的棒狀玻塞6的下方。讓反應(yīng)液流入反應(yīng)室7中，塞上棒狀玻塞。取一只盛有硼酸-指示劑混

33、合液的錐形瓶，放在冷凝器之下口，冷凝器下口必須浸沒在硼酸液面之下。用量筒向小玻杯5加入10m1 40%的氫氧化鈉溶液，加完輕輕地旋轉(zhuǎn)著向上提起棒狀玻塞，使堿液慢慢流入反應(yīng)室7，在堿液尚未完全流入時，將玻塞蓋緊，向小玻杯5中加入約5ml蒸餾水。再輕提玻塞，使一半蒸餾水流入反應(yīng)室，另一半留在玻杯中作水封。夾緊夾子9，開始蒸餾，錐形瓶中硼酸-指示劑混合液吸收了氨，由紫色變?yōu)榫G色，變色后，再蒸餾35分鐘，將冷凝管口離開液面1分鐘再取出錐形瓶。c. 滴定 用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定各錐形瓶中收集的氨量。以硼酸液由藍綠色變回灰色或灰紫色，且半分鐘內(nèi)不褪色為滴定終點，記下所用鹽酸體積。本實驗標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的濃度為：0.010

34、1 mol/l（4）分析結(jié)果的表述 試樣中蛋白質(zhì)的含量按式（1）進行計算。 式中： x試樣中蛋白質(zhì)的含量，單位為克每百克（g/100 g） ； v1試液消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，單位為毫升（ml） ； v2試劑空白消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，單位為毫升 （ml） ； v3吸取消化液的體積，單位為毫升（ml） ； c硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度，單位為摩爾每升（mol/l） ； 0.01401.0 ml鹽酸c (hcl) 1.000 mol/l標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，單位為克（g） ； m試樣的質(zhì)量，單位為克（g） ； f氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)，取 6.25。 2.5 酶解藍圓鲹魚肉蛋

35、白 蛋白質(zhì)水解物的生產(chǎn)方式分為化學(xué)降解法和酶降解法?；瘜W(xué)法是用酸、堿等化學(xué)試劑在一定溫度下促使蛋白質(zhì)分子的肽鏈斷裂形成小分子物質(zhì)。酸法多采用鹽酸、硫酸等強酸在高溫下反應(yīng)，反應(yīng)強烈，設(shè)備腐蝕嚴(yán)重，水解 徹底，多生成氨基酸混合物，同時在高溫下色氨酸完全被破壞，目前已漸被淘汰；堿法水解使氨基酸大多消旋，如使 l氨基酸形成d氨基酸，還能形成有毒物質(zhì)11，無生物利用價值，因此不宜采用。而酶解法的效率較高，所需條件溫和，營養(yǎng)成分的破壞較少，并能產(chǎn)生富含多肽的產(chǎn)物，而二肽和三肽更有利于人體的吸收12。因此，與酸法或堿法相比，酶解法有著不可比擬的優(yōu)點。 蛋白酶的選擇通常以專一性、酶活性、酶的作用條件、價格和風(fēng)

36、味等為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)不同的需要采用不同專一性的蛋白酶，或采用雙酶或多酶來達到所要的酶解效果。常用的蛋白酶通常有:胃蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶等。目前從各種文獻來看，酶解藍圓鲹采用的蛋白酶有胰蛋白酶、alcalase2.4、復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶等幾種，酸堿條件一般為中堿性。參考楊萍等的研究13，目前最適合酶解藍圓鲹的普通酶為木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，再結(jié)合本實驗室先前的研究，本實驗決定使用木瓜蛋白酶對藍圓鲹魚粉進行酶解。2.5.1 酶解工藝 精確稱取含一定質(zhì)量蛋白質(zhì)的藍圓鲹魚粉，并且加150ml的去離子水混合均勻，置入三口燒瓶，煮沸15m

37、in后冷卻至木瓜蛋白酶酶解所需的反應(yīng)溫度，將裝有漿液的三口瓶置于已調(diào)節(jié)到所需溫度的恒溫水浴鍋中，開動攪拌槳，調(diào)節(jié)酸堿度到所需的ph值后保持溶液體系平衡30min。此時加入木瓜蛋白酶啟動反應(yīng)，并且滴加naoh溶液維持漿液的ph穩(wěn)定，每隔一段時間記錄相應(yīng)的用堿量，從實驗啟動到結(jié)束，一般共計時4h。酶解過程結(jié)束后，取出三口瓶置于100沸水中加熱10min滅活。酶解液置于冰柜中冷藏。 圖 22 酶解裝置fig.22 hydrolysis equipment2.5.2 水解度的測定 水解度的測定采用ph-start滴定法，為了從宏觀上表征整個酶促水解反應(yīng)，alder-nissen引入了水解度（dh）14

38、的概念，即蛋白水解中斷裂的肽鍵數(shù)占肽鍵總數(shù)的百分比，其定義式為： （2）式（2）中： h-單位質(zhì)量底物中已水解的肽鍵數(shù)目，mmol.g-1； ht-底物中蛋白質(zhì)肽鍵總數(shù)，mmol.g-1； b-堿液體積，l； cb -堿液的濃度，mol.l-1； -氨基的平均解離度； mp-底物中蛋白質(zhì)總量，g。其中，-氨基酸的平均解離度由下式計算： （3）上式中pk值受溫度的影響很大，但與底物關(guān)系不大，可用下式計算： （4）2.6 酶解條件優(yōu)化 在研究了底物濃度、酶濃度和ph值的單因素實驗基礎(chǔ)上，參考相關(guān)文獻，選用ccd進行響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化提取工藝參數(shù)。在底物濃度，即所反應(yīng)的蛋白質(zhì)總量不變的前提下，實驗設(shè)計以

39、反應(yīng)溫度()、ph值、e/s(加酶量與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比)為操作因素，分別用 a、b和c來表示 , 每個操作因素設(shè)置五個水平、并以+1.68、 + 1、0、-1、-1.68分別代表自變量從高到低的水平, 水解固定時間為4h，以水解度(dh)為響應(yīng)值，建立二次多項式回歸模型。實驗的自變量因素水平見表 21。表21 自變量因素和水平編碼 table 2-1 independent variable factors and level coding獨立變量編碼水平-1.68-10+1+1.68反應(yīng)溫度()a4547505355phb6.686.87.07.27.34e/sc0.01440.01980.0

40、2770.03560.0410設(shè)該二次多項式回歸模型是通過最小二乘法擬合的方程式為dh=x0+x1a+x2b+x3c+x12ab+x13ac+x23bc+x11a2+x22b2+x33c2 (5)式中：dh 預(yù)測響應(yīng)值x0 截距x1、x2、x3 線性系數(shù)x12、x13、x23 交互項系數(shù)x11、x22、x33 二次項系數(shù)第三章 實驗結(jié)果與分析3.1 藍圓鲹魚粉的蛋白質(zhì)含量 實驗取空白組一組、原料組兩組，各進行23次平行定氮實驗，分別取實驗結(jié)果最靠近的兩次數(shù)據(jù)，結(jié)果如下表31表31 凱氏定氮實驗結(jié)果table 3-1experimental results of kjeldahl determi

41、nation魚粉質(zhì)量（g）鹽酸滴加量（ml）空白組00.230.26魚粉組一0.518923.3323.19魚粉組二0.512722.2822.32將以上結(jié)果代入式（1），測得藍圓鲹魚粉的蛋白質(zhì)含量為78.41，符合相關(guān)文獻4的測量值。3.2 響應(yīng)面實驗優(yōu)化酶解工藝條件為了獲得具有更好降血壓效果的藍圓鲹魚粉蛋白酶解產(chǎn)物，在木瓜蛋白酶水解進行單因素實驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面優(yōu)化法進行最適水解條件的優(yōu)化，表32為響應(yīng)面實驗數(shù)據(jù)。3.2.1 響應(yīng)面實驗分析與回歸方程的建立實驗采用design-expert.v8.0.5軟件對表32的20組實驗數(shù)據(jù)根據(jù)方程（5）進行多元回歸分析，建立響應(yīng)面的回歸模型，得

42、到水解度(dh)對編碼自變量a(酶解溫度)、b(ph)及c(e/s)的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為：dh = 16.08 - 0.064a - 2.45b + 2.00c + 0.13ab + 0.42ac - 0.41bc + 0.12a2 + 0.28b2 - 0.24c2 （6）轉(zhuǎn)化為實際空間的方程為：dh = 520.69135 - 3.32395a - 114.61023b + 1409.28612c + 0.21458ab + 17.66878ac - 260.28481bc + 0.013111a2 + 7.05996b2 - 3915.97753c2 （7）該模型的方差分析及顯著性試驗見下表

43、33，由表33的方差分析結(jié)果能夠看出，本實驗所選用的回歸模型及其顯著（pmodel 0.0001），并且方程的失擬項不顯著（p = 0.0714），說明方程的誤差很小，這也說明各操作因素值與響應(yīng)值dh之間可以通過該回歸模型進行函數(shù)化。其中相關(guān)系數(shù)r2=0.9861，說明水解度的預(yù)測值和實驗值之間具有很好的擬合度。模型的校正系數(shù)radj=0.9736，這表明只有不到3的水解度的總變異不可以通過該方程模型進行解釋。從三個操作因素對水解度dh的影響來分析，回歸方程的一次項b(ph)和c(e/s)對水解度有非常顯著的影響，而反應(yīng)溫度a的影響不明顯，其影響順序為bc a。交互項ac和bc較顯著，而ab不

44、顯著。二次項只有b2的p值大于0.05。所以可以簡化模型，得到方程（8）：dh =520.69135-114.61023b + 1409.28612c + 17.66878ac - 260.28481bc +7.05996b2 （8）表32 響應(yīng)面實驗結(jié)果table 32 results of response surfaces experiment序號abcdh水解度153.00 6.80 0.0356 21.71 255.05 7.00 0.0277 16.20 350.00 7.00 0.0277 16.57 450.00 7.34 0.0277 12.78 547.00 6.80 0.

45、0198 16.60 644.95 7.00 0.0277 16.81 750.00 7.00 0.0277 16.06 853.00 7.20 0.0198 11.78 950.00 7.00 0.0277 16.10 1047.00 7.20 0.0198 12.02 1150.00 7.00 0.0410 18.26 1250.00 7.00 0.0277 15.73 1350.00 6.66 0.0277 21.16 1453.00 7.20 0.0356 16.00 1553.00 6.80 0.0198 15.24 1650.00 7.00 0.0277 15.93 1747.00

46、 7.20 0.0356 15.17 1847.00 6.80 0.0356 20.79 1950.00 7.00 0.0144 12.70 2050.00 7.00 0.0277 16.03 表 33 回歸模型方差分析表1table 33 variance analysis of regression equation1變異來源平方和ss自由度df均方msf 值 fp 值 prf顯著性模型142.26915.8178.730.0001a0.05610.0560.280.6084b82.00182.00408.420.0001c54.90154.90273.430.0001ab0.1310.1

47、30.660.4353ac1.4011.406.990.0246bc1.3511.356.740.0267a20.2010.201.000.3410b21.1511.155.720.0378c20.8610.864.200.0652殘差2.01100.20失擬項1.6250.324.180.0714誤差項0.3950.078總和144.2719r2=0.9861radj=0.97361、p值0.0001時極顯著，p值0.0500時顯著，p值0.1時不顯著；極顯著，顯著。3.2.2 響應(yīng)曲面的分析響應(yīng)曲面的分析主要是從響應(yīng)面圖形和回歸模型方程進行分析。從圖31看，在溫度與ph交互影響中，等高線幾

48、乎與溫度軸平行，在試驗范圍內(nèi)，隨著ph降低水解度上升，而溫度的影響幾乎沒有，這與a和ab項的p值偏大造成的顯著性極不明顯相對應(yīng)；同樣，圖32與圖33的情況具有和圖 31一定的類似性，只是由于e/s和ph對水解度的影響大于溫度的影響，所以其等高線的平行性沒有圖31明顯，曲面也有一定的彎折度，沒有顯著地表現(xiàn)出圖31中曲面的平整性。從三個圖分析，在溫度53，e/s0.3，ph6.8的范圍內(nèi)，曲面有向極大值點延伸的趨勢。但是這種趨勢不明顯，可能存在很大的偏差，因為試驗范圍取值較窄的緣故，不能從曲面圖像上直觀的估計極值點，這里僅能從回歸模型方程進行分析。圖 31 溫度與ph交互作用圖fig.31 int

49、eraction of temperature and ph圖 32 溫度與e/s交互影響圖fig.32 interaction of temperature and e/s 圖 33 ph與e/s交互影響圖fig.32 interaction of ph and e/s假設(shè)存在這樣的最優(yōu)點（a,b,c）能獲得水解度的極大值，則該點應(yīng)使偏導(dǎo)數(shù)。通過計算，獲得了這樣的一個穩(wěn)定點(stationary point)（52.55，7.97，0.03371）。穩(wěn)定點可以是：（1）響應(yīng)的最大值點，（2）響應(yīng)的最小值點，（3）鞍點(saddle point)。要知道該點的真正意義，及所謂的相應(yīng)曲面的刻畫，

50、最直接的方法就是去考察所擬合模型的等高線圖，但在這里不具有可行性。此外還可以將該點代入模型方程（7），再和各實驗值進行比較，這樣算得該點的預(yù)測水解度dh=24.32，因為這樣算出的水解度大于實驗所測得的最大的水解度，這使該方程存在極大值的可能性，為能更好的說明問題，在此引進了更加規(guī)范化的正則分析28。首先將所擬合的二階模型寫成矩陣記號形式，即：然后利用坐標(biāo)變換將模型放入一個新的坐標(biāo)系，原點在穩(wěn)定點xs處，此時旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)系直至它們與所擬合響應(yīng)面的主軸平行為止。這樣得到的擬合模型是 （10）其中i是變換后的自變量，i是常數(shù)且是矩陣 b 的特征值或特征根，dhs為穩(wěn)定點處取得的響應(yīng)值，而（10）式稱為

51、模型的正則形式。在本試驗中，操作因素有3個，所以特征值i有3個取值，此時行列式b-i= 0,這個行列式可以進一步化簡為相應(yīng)的一元三次方程，該方程用盛金公式29求解，求得的三個不同的實根分別為1=-0.4032，2=-0.3497，3=-0.2135。因為i的三個解值都是負值，所以該穩(wěn)定點為所擬合模型方程的最大值點28。當(dāng)然該點已經(jīng)超出了試驗范圍之外，為了驗證該點所對應(yīng)的優(yōu)化條件下的水解度和模型方程的擬合度，在此還要進行驗證試驗以檢測其可靠性。 通過對響應(yīng)曲面的分析，雖然在ph=6.80附近，水解度的實驗值有達到最大點的趨勢，但是方程擬合出的ph值超出了取值范圍，這可能是由于溫度和e/s的影響；

52、另一方面，溫度對實驗影響的顯著性很低，仍需要擴大其取值范圍；而e/s影響的顯著性雖然是最大的，但是其引起的響應(yīng)的變化一直有隨酶用量增大而增大的趨勢。所以要修正響應(yīng)曲面的設(shè)計，可以擴大溫度和e/s的水平取值的步長，這樣可以實現(xiàn)實驗考察的范圍擴大，實驗就可能獲得更加精確和可靠的最優(yōu)條件的確定。3.3 驗證實驗通過中心組合設(shè)計優(yōu)化和對擬合模型方程的分析，獲得了擬合方程的最大值點，即酶解溫度52.55、ph=7.97、e/s =0.03371。為考察該點和實際值的差異，特別是是在ph7.34這樣一種超出考察范圍的條件下的擬合度，決定在該條件下，進行酶解藍圓鲹魚肉蛋白的驗證性實驗。驗證實驗除所求的三個條

53、件不一樣之外，其余條件，包括設(shè)備，和設(shè)計響應(yīng)面的酶解實驗均相同。實驗所測得的水解度(dh)為21.78，這與24.32的預(yù)測值存在可接受的誤差。實驗表明，在本實驗中，在實驗考察范圍之外的該點處，方程失去了一定的擬合度，但是該方程仍然可用，最優(yōu)組合依然可靠。此外，本實驗沒有測定相應(yīng)條件下，降血壓肽的生物活性，這里僅從水解度最大值考慮最優(yōu)點，這也是實驗欠考慮的地方。第四章 結(jié)論與展望4.1結(jié)論4.1.1 藍圓鲹的蛋白質(zhì)含量 本次實驗使用凱氏定氮法對藍圓鲹魚粉進行了蛋白質(zhì)含量分析。結(jié)果表明藍圓鲹干魚粉的蛋白質(zhì)含量高達78.41，是優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)源，適合作為制備aceip的原料，具有較高的開發(fā)利用價值，

54、同時也證明了凱氏定氮法是測量蛋白質(zhì)含量的有效方法之一。4.1.2 酶解藍圓鲹魚肉蛋白本次實驗，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，引進了中心組合設(shè)計酶解藍圓鲹蛋白工藝，并獲得各組實驗相應(yīng)的水解度(dh)。通過模型分析，得到模型方程最優(yōu)組合為酶解溫度為52.55、ph為7.97、e/s 為0.03371，該條件下的實際水解度為21.78。實驗的誤差和一定的失擬性是由于實驗設(shè)計的范圍較小引起的。4.1.3 中心組合優(yōu)化設(shè)計 本次中心組合設(shè)計獲得酶解藍圓鲹制備降血壓肽的最優(yōu)條件，證實了響應(yīng)曲面法是實驗條件尋優(yōu)的有效方法之一。另一方面，實驗結(jié)果也說明了響應(yīng)面優(yōu)化法的局限性。即響應(yīng)面優(yōu)化的前提是：設(shè)計的實驗點應(yīng)包括最佳的實驗條件，如果實驗點的選取不當(dāng)，使用響應(yīng)面優(yōu)化法就不能得到很好的優(yōu)化結(jié)果。因而，在使用響應(yīng)面優(yōu)化法之前，應(yīng)當(dāng)確立合理的實驗因素與水平。4.2 展望本文通過原料分析證實了藍圓鲹魚粉的蛋白質(zhì)含量較高，對于酶解藍圓鲹制備降