遺傳學(xué)專(zhuān)業(yè)畢業(yè)論文[精品論文]人胚胎干細(xì)胞體內(nèi)分化途徑獲取神經(jīng)干細(xì)胞及DNA甲基化酶Dnmt3a和Dnmt3b表達(dá)下調(diào)對(duì)人胚胎干細(xì)胞的影響

1、遺傳學(xué)專(zhuān)業(yè)畢業(yè)論文 精品論文 人胚胎干細(xì)胞體內(nèi)分化途徑獲取神經(jīng)干細(xì)胞及dna甲基化酶dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)對(duì)人胚胎干細(xì)胞的影響關(guān)鍵詞：人胚胎干細(xì)胞 神經(jīng)干細(xì)胞 dna甲基化酶 dnmt3a 體內(nèi)分化途徑摘要：人類(lèi)胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells，hescs）來(lái)源于早期胚胎、具有自我更新和分化發(fā)育為三個(gè)胚層組織潛能的多能性細(xì)胞。hescs在多個(gè)領(lǐng)域，如細(xì)胞治療、組織工程、發(fā)育生物學(xué)、基因功能研究、藥物篩選等領(lǐng)域展示了巨大的應(yīng)用前景。 第一章：人胚胎干細(xì)胞株hsf6培養(yǎng)。 目的：探索和建立人胚胎干細(xì)胞株hsf6的培養(yǎng)方法。 方法：從icr胎鼠（e13.5

2、）中分離胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblast，mef），檢測(cè)絲裂霉素c處理或射線(xiàn)照射后mef的生長(zhǎng)狀態(tài)并作為hescs飼養(yǎng)層；將hescs培養(yǎng)于含10ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的ko-dmem培養(yǎng)基中，采用hescs的酶消化法傳代和機(jī)械法（巴氏德管制作的傳代工具）傳代；并對(duì)培養(yǎng)的hsf6進(jìn)行堿性磷酸酶染色、表面標(biāo)記檢測(cè)、體外擬胚體（embryoidbody，eb）分化能力檢測(cè)等特征鑒定。 結(jié)果：第3-5代的mef經(jīng)10g/ml絲裂霉素c處理1-3小時(shí)或經(jīng)3000rad射線(xiàn)照射后能抑制增殖。酶消化法傳代后hescs克隆大小不均，分化克隆容易殘留和擴(kuò)增；機(jī)械法

3、傳代的hescs克隆大小較均勻，分化克隆殘留較少或培養(yǎng)中容易被剔除，但機(jī)械法傳代過(guò)程繁瑣、操作時(shí)間較長(zhǎng)、工作量大；培養(yǎng)的hsf6能維持未分化狀態(tài)。 結(jié)論：建立了icr胎鼠（e13.5）mef的分離和培養(yǎng)方法，10g/ml絲裂霉素c處理1-3小時(shí)，或3000rad射線(xiàn)照射后可作為hsf6的飼養(yǎng)層；酶消化法和機(jī)械法均可用于hescs的傳代。 第二章：hescs體內(nèi)分化途徑獲取神經(jīng)干細(xì)胞。 目的：從hescs畸胎瘤中分離人神經(jīng)干細(xì)胞（neural progenitor cells，npc）。 方法：將hescs注射到scid鼠體內(nèi)分化為畸胎瘤，采用貼壁培養(yǎng)法從中分離人npc；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)npc

4、標(biāo)記-巢蛋白（nestin）；檢測(cè)npc分化能力，對(duì)分化細(xì)胞檢測(cè)神經(jīng)元標(biāo)記-微管蛋白（neuron-specific class beta-tubulin，tuj）和膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記-膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，gfap）。 結(jié)果：hescs注射scid鼠后5-8周后可分化為畸胎瘤，經(jīng)過(guò)貼壁培養(yǎng)和連續(xù)傳代從中分離到npc，免疫組織化學(xué)檢測(cè)nestin呈陽(yáng)性，能分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，分別表達(dá)tuj和gfap。 結(jié)論：利用貼壁培養(yǎng)法可從hescs畸胎瘤中分離到npc；“hescs-scid鼠-畸胎瘤”模型為細(xì)胞組織工程、發(fā)育分化研究提供了一個(gè)

5、新的方法。 第三章：dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)對(duì)hescs的影響。 目的：研究dna新生甲基化酶dnmt3a（dna methyltransferase 3a）和dnmt3b（dna methyltransferase 3b）表達(dá)下調(diào)后對(duì)hescs的影響。 方法：觀察dnmt3a與dnmt3b表達(dá)下調(diào)后hescs的生長(zhǎng)特性；免疫熒光檢測(cè)hescs表面標(biāo)記；rt-pcr檢測(cè)維持胚胎干細(xì)胞自我更新和維持未分化的相關(guān)基因；檢測(cè)hescs體外eb分化情況，在不同分化時(shí)間行akp染色和rt-pcr檢測(cè)三個(gè)胚層基因表達(dá)情況；檢測(cè)hescs在scid鼠體內(nèi)分化能力。 結(jié)果：dnmt3a和dnmt3b

6、表達(dá)下調(diào)后hescs：在mef上呈克隆式生長(zhǎng)，表面標(biāo)記檢測(cè)呈hesc特征，表達(dá)oct3/4、sox2和nanog；eb分化障礙、akp消退延遲，dnmt3b下調(diào)后hescs分化時(shí)神經(jīng)外胚層標(biāo)記基因提前出現(xiàn)；dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)后hescs在scid小鼠體內(nèi)未形成畸胎瘤。 結(jié)論：dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)后不影響hescs未分化狀態(tài)的維持，推測(cè)dnmt3a和dnmt3b不是hescs未分化狀態(tài)維持所必需的；dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致hescs分化缺陷，推測(cè)dnmt3a和dnmt3b是hescs正常分化所必需的。正文內(nèi)容 人類(lèi)胚胎干細(xì)胞（human embryon

7、ic stem cells，hescs）來(lái)源于早期胚胎、具有自我更新和分化發(fā)育為三個(gè)胚層組織潛能的多能性細(xì)胞。hescs在多個(gè)領(lǐng)域，如細(xì)胞治療、組織工程、發(fā)育生物學(xué)、基因功能研究、藥物篩選等領(lǐng)域展示了巨大的應(yīng)用前景。 第一章：人胚胎干細(xì)胞株hsf6培養(yǎng)。 目的：探索和建立人胚胎干細(xì)胞株hsf6的培養(yǎng)方法。 方法：從icr胎鼠（e13.5）中分離胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblast，mef），檢測(cè)絲裂霉素c處理或射線(xiàn)照射后mef的生長(zhǎng)狀態(tài)并作為hescs飼養(yǎng)層；將hescs培養(yǎng)于含10ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的ko-dmem培養(yǎng)基中，采用hescs的酶消化

8、法傳代和機(jī)械法（巴氏德管制作的傳代工具）傳代；并對(duì)培養(yǎng)的hsf6進(jìn)行堿性磷酸酶染色、表面標(biāo)記檢測(cè)、體外擬胚體（embryoidbody，eb）分化能力檢測(cè)等特征鑒定。 結(jié)果：第3-5代的mef經(jīng)10g/ml絲裂霉素c處理1-3小時(shí)或經(jīng)3000rad射線(xiàn)照射后能抑制增殖。酶消化法傳代后hescs克隆大小不均，分化克隆容易殘留和擴(kuò)增；機(jī)械法傳代的hescs克隆大小較均勻，分化克隆殘留較少或培養(yǎng)中容易被剔除，但機(jī)械法傳代過(guò)程繁瑣、操作時(shí)間較長(zhǎng)、工作量大；培養(yǎng)的hsf6能維持未分化狀態(tài)。 結(jié)論：建立了icr胎鼠（e13.5）mef的分離和培養(yǎng)方法，10g/ml絲裂霉素c處理1-3小時(shí)，或3000rad

9、射線(xiàn)照射后可作為hsf6的飼養(yǎng)層；酶消化法和機(jī)械法均可用于hescs的傳代。 第二章：hescs體內(nèi)分化途徑獲取神經(jīng)干細(xì)胞。 目的：從hescs畸胎瘤中分離人神經(jīng)干細(xì)胞（neural progenitor cells，npc）。 方法：將hescs注射到scid鼠體內(nèi)分化為畸胎瘤，采用貼壁培養(yǎng)法從中分離人npc；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)npc標(biāo)記-巢蛋白（nestin）；檢測(cè)npc分化能力，對(duì)分化細(xì)胞檢測(cè)神經(jīng)元標(biāo)記-微管蛋白（neuron-specific class beta-tubulin，tuj）和膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記-膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，

10、gfap）。 結(jié)果：hescs注射scid鼠后5-8周后可分化為畸胎瘤，經(jīng)過(guò)貼壁培養(yǎng)和連續(xù)傳代從中分離到npc，免疫組織化學(xué)檢測(cè)nestin呈陽(yáng)性，能分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，分別表達(dá)tuj和gfap。 結(jié)論：利用貼壁培養(yǎng)法可從hescs畸胎瘤中分離到npc；“hescs-scid鼠-畸胎瘤”模型為細(xì)胞組織工程、發(fā)育分化研究提供了一個(gè)新的方法。 第三章：dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)對(duì)hescs的影響。 目的：研究dna新生甲基化酶dnmt3a（dna methyltransferase 3a）和dnmt3b（dna methyltransferase 3b）表達(dá)下調(diào)后對(duì)hescs的影響

11、。 方法：觀察dnmt3a與dnmt3b表達(dá)下調(diào)后hescs的生長(zhǎng)特性；免疫熒光檢測(cè)hescs表面標(biāo)記；rt-pcr檢測(cè)維持胚胎干細(xì)胞自我更新和維持未分化的相關(guān)基因；檢測(cè)hescs體外eb分化情況，在不同分化時(shí)間行akp染色和rt-pcr檢測(cè)三個(gè)胚層基因表達(dá)情況；檢測(cè)hescs在scid鼠體內(nèi)分化能力。 結(jié)果：dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)后hescs：在mef上呈克隆式生長(zhǎng)，表面標(biāo)記檢測(cè)呈hesc特征，表達(dá)oct3/4、sox2和nanog；eb分化障礙、akp消退延遲，dnmt3b下調(diào)后hescs分化時(shí)神經(jīng)外胚層標(biāo)記基因提前出現(xiàn)；dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)后hescs在scid

12、小鼠體內(nèi)未形成畸胎瘤。 結(jié)論：dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)后不影響hescs未分化狀態(tài)的維持，推測(cè)dnmt3a和dnmt3b不是hescs未分化狀態(tài)維持所必需的；dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致hescs分化缺陷，推測(cè)dnmt3a和dnmt3b是hescs正常分化所必需的。人類(lèi)胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells，hescs）來(lái)源于早期胚胎、具有自我更新和分化發(fā)育為三個(gè)胚層組織潛能的多能性細(xì)胞。hescs在多個(gè)領(lǐng)域，如細(xì)胞治療、組織工程、發(fā)育生物學(xué)、基因功能研究、藥物篩選等領(lǐng)域展示了巨大的應(yīng)用前景。 第一章：人胚胎干細(xì)胞株hsf6培養(yǎng)。 目的：探索和建立

13、人胚胎干細(xì)胞株hsf6的培養(yǎng)方法。 方法：從icr胎鼠（e13.5）中分離胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblast，mef），檢測(cè)絲裂霉素c處理或射線(xiàn)照射后mef的生長(zhǎng)狀態(tài)并作為hescs飼養(yǎng)層；將hescs培養(yǎng)于含10ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的ko-dmem培養(yǎng)基中，采用hescs的酶消化法傳代和機(jī)械法（巴氏德管制作的傳代工具）傳代；并對(duì)培養(yǎng)的hsf6進(jìn)行堿性磷酸酶染色、表面標(biāo)記檢測(cè)、體外擬胚體（embryoidbody，eb）分化能力檢測(cè)等特征鑒定。 結(jié)果：第3-5代的mef經(jīng)10g/ml絲裂霉素c處理1-3小時(shí)或經(jīng)3000rad射線(xiàn)照射后能抑制增殖。酶

14、消化法傳代后hescs克隆大小不均，分化克隆容易殘留和擴(kuò)增；機(jī)械法傳代的hescs克隆大小較均勻，分化克隆殘留較少或培養(yǎng)中容易被剔除，但機(jī)械法傳代過(guò)程繁瑣、操作時(shí)間較長(zhǎng)、工作量大；培養(yǎng)的hsf6能維持未分化狀態(tài)。 結(jié)論：建立了icr胎鼠（e13.5）mef的分離和培養(yǎng)方法，10g/ml絲裂霉素c處理1-3小時(shí)，或3000rad射線(xiàn)照射后可作為hsf6的飼養(yǎng)層；酶消化法和機(jī)械法均可用于hescs的傳代。 第二章：hescs體內(nèi)分化途徑獲取神經(jīng)干細(xì)胞。 目的：從hescs畸胎瘤中分離人神經(jīng)干細(xì)胞（neural progenitor cells，npc）。 方法：將hescs注射到scid鼠體內(nèi)分化

15、為畸胎瘤，采用貼壁培養(yǎng)法從中分離人npc；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)npc標(biāo)記-巢蛋白（nestin）；檢測(cè)npc分化能力，對(duì)分化細(xì)胞檢測(cè)神經(jīng)元標(biāo)記-微管蛋白（neuron-specific class beta-tubulin，tuj）和膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記-膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，gfap）。 結(jié)果：hescs注射scid鼠后5-8周后可分化為畸胎瘤，經(jīng)過(guò)貼壁培養(yǎng)和連續(xù)傳代從中分離到npc，免疫組織化學(xué)檢測(cè)nestin呈陽(yáng)性，能分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，分別表達(dá)tuj和gfap。 結(jié)論：利用貼壁培養(yǎng)法可從hescs畸胎瘤中分離到npc；“hesc

16、s-scid鼠-畸胎瘤”模型為細(xì)胞組織工程、發(fā)育分化研究提供了一個(gè)新的方法。 第三章：dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)對(duì)hescs的影響。 目的：研究dna新生甲基化酶dnmt3a（dna methyltransferase 3a）和dnmt3b（dna methyltransferase 3b）表達(dá)下調(diào)后對(duì)hescs的影響。 方法：觀察dnmt3a與dnmt3b表達(dá)下調(diào)后hescs的生長(zhǎng)特性；免疫熒光檢測(cè)hescs表面標(biāo)記；rt-pcr檢測(cè)維持胚胎干細(xì)胞自我更新和維持未分化的相關(guān)基因；檢測(cè)hescs體外eb分化情況，在不同分化時(shí)間行akp染色和rt-pcr檢測(cè)三個(gè)胚層基因表達(dá)情況；檢測(cè)he

17、scs在scid鼠體內(nèi)分化能力。 結(jié)果：dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)后hescs：在mef上呈克隆式生長(zhǎng)，表面標(biāo)記檢測(cè)呈hesc特征，表達(dá)oct3/4、sox2和nanog；eb分化障礙、akp消退延遲，dnmt3b下調(diào)后hescs分化時(shí)神經(jīng)外胚層標(biāo)記基因提前出現(xiàn)；dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)后hescs在scid小鼠體內(nèi)未形成畸胎瘤。 結(jié)論：dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)后不影響hescs未分化狀態(tài)的維持，推測(cè)dnmt3a和dnmt3b不是hescs未分化狀態(tài)維持所必需的；dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致hescs分化缺陷，推測(cè)dnmt3a和dnmt3b是hescs正常

18、分化所必需的。人類(lèi)胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells，hescs）來(lái)源于早期胚胎、具有自我更新和分化發(fā)育為三個(gè)胚層組織潛能的多能性細(xì)胞。hescs在多個(gè)領(lǐng)域，如細(xì)胞治療、組織工程、發(fā)育生物學(xué)、基因功能研究、藥物篩選等領(lǐng)域展示了巨大的應(yīng)用前景。 第一章：人胚胎干細(xì)胞株hsf6培養(yǎng)。 目的：探索和建立人胚胎干細(xì)胞株hsf6的培養(yǎng)方法。 方法：從icr胎鼠（e13.5）中分離胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblast，mef），檢測(cè)絲裂霉素c處理或射線(xiàn)照射后mef的生長(zhǎng)狀態(tài)并作為hescs飼養(yǎng)層；將hescs培養(yǎng)于含10ng/ml堿性成纖維細(xì)胞

19、生長(zhǎng)因子的ko-dmem培養(yǎng)基中，采用hescs的酶消化法傳代和機(jī)械法（巴氏德管制作的傳代工具）傳代；并對(duì)培養(yǎng)的hsf6進(jìn)行堿性磷酸酶染色、表面標(biāo)記檢測(cè)、體外擬胚體（embryoidbody，eb）分化能力檢測(cè)等特征鑒定。 結(jié)果：第3-5代的mef經(jīng)10g/ml絲裂霉素c處理1-3小時(shí)或經(jīng)3000rad射線(xiàn)照射后能抑制增殖。酶消化法傳代后hescs克隆大小不均，分化克隆容易殘留和擴(kuò)增；機(jī)械法傳代的hescs克隆大小較均勻，分化克隆殘留較少或培養(yǎng)中容易被剔除，但機(jī)械法傳代過(guò)程繁瑣、操作時(shí)間較長(zhǎng)、工作量大；培養(yǎng)的hsf6能維持未分化狀態(tài)。 結(jié)論：建立了icr胎鼠（e13.5）mef的分離和培養(yǎng)方法

20、，10g/ml絲裂霉素c處理1-3小時(shí)，或3000rad射線(xiàn)照射后可作為hsf6的飼養(yǎng)層；酶消化法和機(jī)械法均可用于hescs的傳代。 第二章：hescs體內(nèi)分化途徑獲取神經(jīng)干細(xì)胞。 目的：從hescs畸胎瘤中分離人神經(jīng)干細(xì)胞（neural progenitor cells，npc）。 方法：將hescs注射到scid鼠體內(nèi)分化為畸胎瘤，采用貼壁培養(yǎng)法從中分離人npc；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)npc標(biāo)記-巢蛋白（nestin）；檢測(cè)npc分化能力，對(duì)分化細(xì)胞檢測(cè)神經(jīng)元標(biāo)記-微管蛋白（neuron-specific class beta-tubulin，tuj）和膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記-膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glia

21、l fibrillary acidic protein，gfap）。 結(jié)果：hescs注射scid鼠后5-8周后可分化為畸胎瘤，經(jīng)過(guò)貼壁培養(yǎng)和連續(xù)傳代從中分離到npc，免疫組織化學(xué)檢測(cè)nestin呈陽(yáng)性，能分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，分別表達(dá)tuj和gfap。 結(jié)論：利用貼壁培養(yǎng)法可從hescs畸胎瘤中分離到npc；“hescs-scid鼠-畸胎瘤”模型為細(xì)胞組織工程、發(fā)育分化研究提供了一個(gè)新的方法。 第三章：dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)對(duì)hescs的影響。 目的：研究dna新生甲基化酶dnmt3a（dna methyltransferase 3a）和dnmt3b（dna methylt

22、ransferase 3b）表達(dá)下調(diào)后對(duì)hescs的影響。 方法：觀察dnmt3a與dnmt3b表達(dá)下調(diào)后hescs的生長(zhǎng)特性；免疫熒光檢測(cè)hescs表面標(biāo)記；rt-pcr檢測(cè)維持胚胎干細(xì)胞自我更新和維持未分化的相關(guān)基因；檢測(cè)hescs體外eb分化情況，在不同分化時(shí)間行akp染色和rt-pcr檢測(cè)三個(gè)胚層基因表達(dá)情況；檢測(cè)hescs在scid鼠體內(nèi)分化能力。 結(jié)果：dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)后hescs：在mef上呈克隆式生長(zhǎng)，表面標(biāo)記檢測(cè)呈hesc特征，表達(dá)oct3/4、sox2和nanog；eb分化障礙、akp消退延遲，dnmt3b下調(diào)后hescs分化時(shí)神經(jīng)外胚層標(biāo)記基因提前出現(xiàn)；

23、dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)后hescs在scid小鼠體內(nèi)未形成畸胎瘤。 結(jié)論：dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)后不影響hescs未分化狀態(tài)的維持，推測(cè)dnmt3a和dnmt3b不是hescs未分化狀態(tài)維持所必需的；dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致hescs分化缺陷，推測(cè)dnmt3a和dnmt3b是hescs正常分化所必需的。人類(lèi)胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells，hescs）來(lái)源于早期胚胎、具有自我更新和分化發(fā)育為三個(gè)胚層組織潛能的多能性細(xì)胞。hescs在多個(gè)領(lǐng)域，如細(xì)胞治療、組織工程、發(fā)育生物學(xué)、基因功能研究、藥物篩選等領(lǐng)域展示了巨大的應(yīng)用前景。

24、 第一章：人胚胎干細(xì)胞株hsf6培養(yǎng)。 目的：探索和建立人胚胎干細(xì)胞株hsf6的培養(yǎng)方法。 方法：從icr胎鼠（e13.5）中分離胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblast，mef），檢測(cè)絲裂霉素c處理或射線(xiàn)照射后mef的生長(zhǎng)狀態(tài)并作為hescs飼養(yǎng)層；將hescs培養(yǎng)于含10ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的ko-dmem培養(yǎng)基中，采用hescs的酶消化法傳代和機(jī)械法（巴氏德管制作的傳代工具）傳代；并對(duì)培養(yǎng)的hsf6進(jìn)行堿性磷酸酶染色、表面標(biāo)記檢測(cè)、體外擬胚體（embryoidbody，eb）分化能力檢測(cè)等特征鑒定。 結(jié)果：第3-5代的mef經(jīng)10g/ml絲裂霉素c

25、處理1-3小時(shí)或經(jīng)3000rad射線(xiàn)照射后能抑制增殖。酶消化法傳代后hescs克隆大小不均，分化克隆容易殘留和擴(kuò)增；機(jī)械法傳代的hescs克隆大小較均勻，分化克隆殘留較少或培養(yǎng)中容易被剔除，但機(jī)械法傳代過(guò)程繁瑣、操作時(shí)間較長(zhǎng)、工作量大；培養(yǎng)的hsf6能維持未分化狀態(tài)。 結(jié)論：建立了icr胎鼠（e13.5）mef的分離和培養(yǎng)方法，10g/ml絲裂霉素c處理1-3小時(shí)，或3000rad射線(xiàn)照射后可作為hsf6的飼養(yǎng)層；酶消化法和機(jī)械法均可用于hescs的傳代。 第二章：hescs體內(nèi)分化途徑獲取神經(jīng)干細(xì)胞。 目的：從hescs畸胎瘤中分離人神經(jīng)干細(xì)胞（neural progenitor cells

26、，npc）。 方法：將hescs注射到scid鼠體內(nèi)分化為畸胎瘤，采用貼壁培養(yǎng)法從中分離人npc；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)npc標(biāo)記-巢蛋白（nestin）；檢測(cè)npc分化能力，對(duì)分化細(xì)胞檢測(cè)神經(jīng)元標(biāo)記-微管蛋白（neuron-specific class beta-tubulin，tuj）和膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記-膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，gfap）。 結(jié)果：hescs注射scid鼠后5-8周后可分化為畸胎瘤，經(jīng)過(guò)貼壁培養(yǎng)和連續(xù)傳代從中分離到npc，免疫組織化學(xué)檢測(cè)nestin呈陽(yáng)性，能分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，分別表達(dá)tuj和gfap。 結(jié)論：利用

27、貼壁培養(yǎng)法可從hescs畸胎瘤中分離到npc；“hescs-scid鼠-畸胎瘤”模型為細(xì)胞組織工程、發(fā)育分化研究提供了一個(gè)新的方法。 第三章：dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)對(duì)hescs的影響。 目的：研究dna新生甲基化酶dnmt3a（dna methyltransferase 3a）和dnmt3b（dna methyltransferase 3b）表達(dá)下調(diào)后對(duì)hescs的影響。 方法：觀察dnmt3a與dnmt3b表達(dá)下調(diào)后hescs的生長(zhǎng)特性；免疫熒光檢測(cè)hescs表面標(biāo)記；rt-pcr檢測(cè)維持胚胎干細(xì)胞自我更新和維持未分化的相關(guān)基因；檢測(cè)hescs體外eb分化情況，在不同分化時(shí)間行a

28、kp染色和rt-pcr檢測(cè)三個(gè)胚層基因表達(dá)情況；檢測(cè)hescs在scid鼠體內(nèi)分化能力。 結(jié)果：dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)后hescs：在mef上呈克隆式生長(zhǎng)，表面標(biāo)記檢測(cè)呈hesc特征，表達(dá)oct3/4、sox2和nanog；eb分化障礙、akp消退延遲，dnmt3b下調(diào)后hescs分化時(shí)神經(jīng)外胚層標(biāo)記基因提前出現(xiàn)；dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)后hescs在scid小鼠體內(nèi)未形成畸胎瘤。 結(jié)論：dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)后不影響hescs未分化狀態(tài)的維持，推測(cè)dnmt3a和dnmt3b不是hescs未分化狀態(tài)維持所必需的；dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致hescs

29、分化缺陷，推測(cè)dnmt3a和dnmt3b是hescs正常分化所必需的。人類(lèi)胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells，hescs）來(lái)源于早期胚胎、具有自我更新和分化發(fā)育為三個(gè)胚層組織潛能的多能性細(xì)胞。hescs在多個(gè)領(lǐng)域，如細(xì)胞治療、組織工程、發(fā)育生物學(xué)、基因功能研究、藥物篩選等領(lǐng)域展示了巨大的應(yīng)用前景。 第一章：人胚胎干細(xì)胞株hsf6培養(yǎng)。 目的：探索和建立人胚胎干細(xì)胞株hsf6的培養(yǎng)方法。 方法：從icr胎鼠（e13.5）中分離胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblast，mef），檢測(cè)絲裂霉素c處理或射線(xiàn)照射后mef的生長(zhǎng)狀態(tài)并作為hescs

30、飼養(yǎng)層；將hescs培養(yǎng)于含10ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的ko-dmem培養(yǎng)基中，采用hescs的酶消化法傳代和機(jī)械法（巴氏德管制作的傳代工具）傳代；并對(duì)培養(yǎng)的hsf6進(jìn)行堿性磷酸酶染色、表面標(biāo)記檢測(cè)、體外擬胚體（embryoidbody，eb）分化能力檢測(cè)等特征鑒定。 結(jié)果：第3-5代的mef經(jīng)10g/ml絲裂霉素c處理1-3小時(shí)或經(jīng)3000rad射線(xiàn)照射后能抑制增殖。酶消化法傳代后hescs克隆大小不均，分化克隆容易殘留和擴(kuò)增；機(jī)械法傳代的hescs克隆大小較均勻，分化克隆殘留較少或培養(yǎng)中容易被剔除，但機(jī)械法傳代過(guò)程繁瑣、操作時(shí)間較長(zhǎng)、工作量大；培養(yǎng)的hsf6能維持未分化狀態(tài)。 結(jié)

31、論：建立了icr胎鼠（e13.5）mef的分離和培養(yǎng)方法，10g/ml絲裂霉素c處理1-3小時(shí)，或3000rad射線(xiàn)照射后可作為hsf6的飼養(yǎng)層；酶消化法和機(jī)械法均可用于hescs的傳代。 第二章：hescs體內(nèi)分化途徑獲取神經(jīng)干細(xì)胞。 目的：從hescs畸胎瘤中分離人神經(jīng)干細(xì)胞（neural progenitor cells，npc）。 方法：將hescs注射到scid鼠體內(nèi)分化為畸胎瘤，采用貼壁培養(yǎng)法從中分離人npc；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)npc標(biāo)記-巢蛋白（nestin）；檢測(cè)npc分化能力，對(duì)分化細(xì)胞檢測(cè)神經(jīng)元標(biāo)記-微管蛋白（neuron-specific class beta-tubul

32、in，tuj）和膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記-膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，gfap）。 結(jié)果：hescs注射scid鼠后5-8周后可分化為畸胎瘤，經(jīng)過(guò)貼壁培養(yǎng)和連續(xù)傳代從中分離到npc，免疫組織化學(xué)檢測(cè)nestin呈陽(yáng)性，能分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，分別表達(dá)tuj和gfap。 結(jié)論：利用貼壁培養(yǎng)法可從hescs畸胎瘤中分離到npc；“hescs-scid鼠-畸胎瘤”模型為細(xì)胞組織工程、發(fā)育分化研究提供了一個(gè)新的方法。 第三章：dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)對(duì)hescs的影響。 目的：研究dna新生甲基化酶dnmt3a（dna methyltransf

33、erase 3a）和dnmt3b（dna methyltransferase 3b）表達(dá)下調(diào)后對(duì)hescs的影響。 方法：觀察dnmt3a與dnmt3b表達(dá)下調(diào)后hescs的生長(zhǎng)特性；免疫熒光檢測(cè)hescs表面標(biāo)記；rt-pcr檢測(cè)維持胚胎干細(xì)胞自我更新和維持未分化的相關(guān)基因；檢測(cè)hescs體外eb分化情況，在不同分化時(shí)間行akp染色和rt-pcr檢測(cè)三個(gè)胚層基因表達(dá)情況；檢測(cè)hescs在scid鼠體內(nèi)分化能力。 結(jié)果：dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)后hescs：在mef上呈克隆式生長(zhǎng)，表面標(biāo)記檢測(cè)呈hesc特征，表達(dá)oct3/4、sox2和nanog；eb分化障礙、akp消退延遲，dnm

34、t3b下調(diào)后hescs分化時(shí)神經(jīng)外胚層標(biāo)記基因提前出現(xiàn)；dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)后hescs在scid小鼠體內(nèi)未形成畸胎瘤。 結(jié)論：dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)后不影響hescs未分化狀態(tài)的維持，推測(cè)dnmt3a和dnmt3b不是hescs未分化狀態(tài)維持所必需的；dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致hescs分化缺陷，推測(cè)dnmt3a和dnmt3b是hescs正常分化所必需的。人類(lèi)胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells，hescs）來(lái)源于早期胚胎、具有自我更新和分化發(fā)育為三個(gè)胚層組織潛能的多能性細(xì)胞。hescs在多個(gè)領(lǐng)域，如細(xì)胞治療、組織工程、發(fā)育生

35、物學(xué)、基因功能研究、藥物篩選等領(lǐng)域展示了巨大的應(yīng)用前景。 第一章：人胚胎干細(xì)胞株hsf6培養(yǎng)。 目的：探索和建立人胚胎干細(xì)胞株hsf6的培養(yǎng)方法。 方法：從icr胎鼠（e13.5）中分離胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblast，mef），檢測(cè)絲裂霉素c處理或射線(xiàn)照射后mef的生長(zhǎng)狀態(tài)并作為hescs飼養(yǎng)層；將hescs培養(yǎng)于含10ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的ko-dmem培養(yǎng)基中，采用hescs的酶消化法傳代和機(jī)械法（巴氏德管制作的傳代工具）傳代；并對(duì)培養(yǎng)的hsf6進(jìn)行堿性磷酸酶染色、表面標(biāo)記檢測(cè)、體外擬胚體（embryoidbody，eb）分化能力檢測(cè)等特征

36、鑒定。 結(jié)果：第3-5代的mef經(jīng)10g/ml絲裂霉素c處理1-3小時(shí)或經(jīng)3000rad射線(xiàn)照射后能抑制增殖。酶消化法傳代后hescs克隆大小不均，分化克隆容易殘留和擴(kuò)增；機(jī)械法傳代的hescs克隆大小較均勻，分化克隆殘留較少或培養(yǎng)中容易被剔除，但機(jī)械法傳代過(guò)程繁瑣、操作時(shí)間較長(zhǎng)、工作量大；培養(yǎng)的hsf6能維持未分化狀態(tài)。 結(jié)論：建立了icr胎鼠（e13.5）mef的分離和培養(yǎng)方法，10g/ml絲裂霉素c處理1-3小時(shí)，或3000rad射線(xiàn)照射后可作為hsf6的飼養(yǎng)層；酶消化法和機(jī)械法均可用于hescs的傳代。 第二章：hescs體內(nèi)分化途徑獲取神經(jīng)干細(xì)胞。 目的：從hescs畸胎瘤中分離人神

37、經(jīng)干細(xì)胞（neural progenitor cells，npc）。 方法：將hescs注射到scid鼠體內(nèi)分化為畸胎瘤，采用貼壁培養(yǎng)法從中分離人npc；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)npc標(biāo)記-巢蛋白（nestin）；檢測(cè)npc分化能力，對(duì)分化細(xì)胞檢測(cè)神經(jīng)元標(biāo)記-微管蛋白（neuron-specific class beta-tubulin，tuj）和膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記-膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，gfap）。 結(jié)果：hescs注射scid鼠后5-8周后可分化為畸胎瘤，經(jīng)過(guò)貼壁培養(yǎng)和連續(xù)傳代從中分離到npc，免疫組織化學(xué)檢測(cè)nestin呈陽(yáng)性，能分化為神經(jīng)

38、元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，分別表達(dá)tuj和gfap。 結(jié)論：利用貼壁培養(yǎng)法可從hescs畸胎瘤中分離到npc；“hescs-scid鼠-畸胎瘤”模型為細(xì)胞組織工程、發(fā)育分化研究提供了一個(gè)新的方法。 第三章：dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)對(duì)hescs的影響。 目的：研究dna新生甲基化酶dnmt3a（dna methyltransferase 3a）和dnmt3b（dna methyltransferase 3b）表達(dá)下調(diào)后對(duì)hescs的影響。 方法：觀察dnmt3a與dnmt3b表達(dá)下調(diào)后hescs的生長(zhǎng)特性；免疫熒光檢測(cè)hescs表面標(biāo)記；rt-pcr檢測(cè)維持胚胎干細(xì)胞自我更新和維持未分化的相關(guān)

39、基因；檢測(cè)hescs體外eb分化情況，在不同分化時(shí)間行akp染色和rt-pcr檢測(cè)三個(gè)胚層基因表達(dá)情況；檢測(cè)hescs在scid鼠體內(nèi)分化能力。 結(jié)果：dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)后hescs：在mef上呈克隆式生長(zhǎng)，表面標(biāo)記檢測(cè)呈hesc特征，表達(dá)oct3/4、sox2和nanog；eb分化障礙、akp消退延遲，dnmt3b下調(diào)后hescs分化時(shí)神經(jīng)外胚層標(biāo)記基因提前出現(xiàn)；dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)后hescs在scid小鼠體內(nèi)未形成畸胎瘤。 結(jié)論：dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)后不影響hescs未分化狀態(tài)的維持，推測(cè)dnmt3a和dnmt3b不是hescs未分化狀態(tài)維持所

40、必需的；dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致hescs分化缺陷，推測(cè)dnmt3a和dnmt3b是hescs正常分化所必需的。人類(lèi)胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells，hescs）來(lái)源于早期胚胎、具有自我更新和分化發(fā)育為三個(gè)胚層組織潛能的多能性細(xì)胞。hescs在多個(gè)領(lǐng)域，如細(xì)胞治療、組織工程、發(fā)育生物學(xué)、基因功能研究、藥物篩選等領(lǐng)域展示了巨大的應(yīng)用前景。 第一章：人胚胎干細(xì)胞株hsf6培養(yǎng)。 目的：探索和建立人胚胎干細(xì)胞株hsf6的培養(yǎng)方法。 方法：從icr胎鼠（e13.5）中分離胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblast，mef），檢測(cè)絲

41、裂霉素c處理或射線(xiàn)照射后mef的生長(zhǎng)狀態(tài)并作為hescs飼養(yǎng)層；將hescs培養(yǎng)于含10ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的ko-dmem培養(yǎng)基中，采用hescs的酶消化法傳代和機(jī)械法（巴氏德管制作的傳代工具）傳代；并對(duì)培養(yǎng)的hsf6進(jìn)行堿性磷酸酶染色、表面標(biāo)記檢測(cè)、體外擬胚體（embryoidbody，eb）分化能力檢測(cè)等特征鑒定。 結(jié)果：第3-5代的mef經(jīng)10g/ml絲裂霉素c處理1-3小時(shí)或經(jīng)3000rad射線(xiàn)照射后能抑制增殖。酶消化法傳代后hescs克隆大小不均，分化克隆容易殘留和擴(kuò)增；機(jī)械法傳代的hescs克隆大小較均勻，分化克隆殘留較少或培養(yǎng)中容易被剔除，但機(jī)械法傳代過(guò)程繁瑣、操作

42、時(shí)間較長(zhǎng)、工作量大；培養(yǎng)的hsf6能維持未分化狀態(tài)。 結(jié)論：建立了icr胎鼠（e13.5）mef的分離和培養(yǎng)方法，10g/ml絲裂霉素c處理1-3小時(shí)，或3000rad射線(xiàn)照射后可作為hsf6的飼養(yǎng)層；酶消化法和機(jī)械法均可用于hescs的傳代。 第二章：hescs體內(nèi)分化途徑獲取神經(jīng)干細(xì)胞。 目的：從hescs畸胎瘤中分離人神經(jīng)干細(xì)胞（neural progenitor cells，npc）。 方法：將hescs注射到scid鼠體內(nèi)分化為畸胎瘤，采用貼壁培養(yǎng)法從中分離人npc；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)npc標(biāo)記-巢蛋白（nestin）；檢測(cè)npc分化能力，對(duì)分化細(xì)胞檢測(cè)神經(jīng)元標(biāo)記-微管蛋白（neur

43、on-specific class beta-tubulin，tuj）和膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記-膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，gfap）。 結(jié)果：hescs注射scid鼠后5-8周后可分化為畸胎瘤，經(jīng)過(guò)貼壁培養(yǎng)和連續(xù)傳代從中分離到npc，免疫組織化學(xué)檢測(cè)nestin呈陽(yáng)性，能分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，分別表達(dá)tuj和gfap。 結(jié)論：利用貼壁培養(yǎng)法可從hescs畸胎瘤中分離到npc；“hescs-scid鼠-畸胎瘤”模型為細(xì)胞組織工程、發(fā)育分化研究提供了一個(gè)新的方法。 第三章：dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)對(duì)hescs的影響。 目的：研究dna新

44、生甲基化酶dnmt3a（dna methyltransferase 3a）和dnmt3b（dna methyltransferase 3b）表達(dá)下調(diào)后對(duì)hescs的影響。 方法：觀察dnmt3a與dnmt3b表達(dá)下調(diào)后hescs的生長(zhǎng)特性；免疫熒光檢測(cè)hescs表面標(biāo)記；rt-pcr檢測(cè)維持胚胎干細(xì)胞自我更新和維持未分化的相關(guān)基因；檢測(cè)hescs體外eb分化情況，在不同分化時(shí)間行akp染色和rt-pcr檢測(cè)三個(gè)胚層基因表達(dá)情況；檢測(cè)hescs在scid鼠體內(nèi)分化能力。 結(jié)果：dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)后hescs：在mef上呈克隆式生長(zhǎng)，表面標(biāo)記檢測(cè)呈hesc特征，表達(dá)oct3/4、s

45、ox2和nanog；eb分化障礙、akp消退延遲，dnmt3b下調(diào)后hescs分化時(shí)神經(jīng)外胚層標(biāo)記基因提前出現(xiàn)；dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)后hescs在scid小鼠體內(nèi)未形成畸胎瘤。 結(jié)論：dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)后不影響hescs未分化狀態(tài)的維持，推測(cè)dnmt3a和dnmt3b不是hescs未分化狀態(tài)維持所必需的；dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致hescs分化缺陷，推測(cè)dnmt3a和dnmt3b是hescs正常分化所必需的。人類(lèi)胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells，hescs）來(lái)源于早期胚胎、具有自我更新和分化發(fā)育為三個(gè)胚層組織潛能的多能性

46、細(xì)胞。hescs在多個(gè)領(lǐng)域，如細(xì)胞治療、組織工程、發(fā)育生物學(xué)、基因功能研究、藥物篩選等領(lǐng)域展示了巨大的應(yīng)用前景。 第一章：人胚胎干細(xì)胞株hsf6培養(yǎng)。 目的：探索和建立人胚胎干細(xì)胞株hsf6的培養(yǎng)方法。 方法：從icr胎鼠（e13.5）中分離胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblast，mef），檢測(cè)絲裂霉素c處理或射線(xiàn)照射后mef的生長(zhǎng)狀態(tài)并作為hescs飼養(yǎng)層；將hescs培養(yǎng)于含10ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的ko-dmem培養(yǎng)基中，采用hescs的酶消化法傳代和機(jī)械法（巴氏德管制作的傳代工具）傳代；并對(duì)培養(yǎng)的hsf6進(jìn)行堿性磷酸酶染色、表面標(biāo)記檢測(cè)、體外擬

47、胚體（embryoidbody，eb）分化能力檢測(cè)等特征鑒定。 結(jié)果：第3-5代的mef經(jīng)10g/ml絲裂霉素c處理1-3小時(shí)或經(jīng)3000rad射線(xiàn)照射后能抑制增殖。酶消化法傳代后hescs克隆大小不均，分化克隆容易殘留和擴(kuò)增；機(jī)械法傳代的hescs克隆大小較均勻，分化克隆殘留較少或培養(yǎng)中容易被剔除，但機(jī)械法傳代過(guò)程繁瑣、操作時(shí)間較長(zhǎng)、工作量大；培養(yǎng)的hsf6能維持未分化狀態(tài)。 結(jié)論：建立了icr胎鼠（e13.5）mef的分離和培養(yǎng)方法，10g/ml絲裂霉素c處理1-3小時(shí)，或3000rad射線(xiàn)照射后可作為hsf6的飼養(yǎng)層；酶消化法和機(jī)械法均可用于hescs的傳代。 第二章：hescs體內(nèi)分化

48、途徑獲取神經(jīng)干細(xì)胞。 目的：從hescs畸胎瘤中分離人神經(jīng)干細(xì)胞（neural progenitor cells，npc）。 方法：將hescs注射到scid鼠體內(nèi)分化為畸胎瘤，采用貼壁培養(yǎng)法從中分離人npc；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)npc標(biāo)記-巢蛋白（nestin）；檢測(cè)npc分化能力，對(duì)分化細(xì)胞檢測(cè)神經(jīng)元標(biāo)記-微管蛋白（neuron-specific class beta-tubulin，tuj）和膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記-膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，gfap）。 結(jié)果：hescs注射scid鼠后5-8周后可分化為畸胎瘤，經(jīng)過(guò)貼壁培養(yǎng)和連續(xù)傳代從中分離到

49、npc，免疫組織化學(xué)檢測(cè)nestin呈陽(yáng)性，能分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，分別表達(dá)tuj和gfap。 結(jié)論：利用貼壁培養(yǎng)法可從hescs畸胎瘤中分離到npc；“hescs-scid鼠-畸胎瘤”模型為細(xì)胞組織工程、發(fā)育分化研究提供了一個(gè)新的方法。 第三章：dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)對(duì)hescs的影響。 目的：研究dna新生甲基化酶dnmt3a（dna methyltransferase 3a）和dnmt3b（dna methyltransferase 3b）表達(dá)下調(diào)后對(duì)hescs的影響。 方法：觀察dnmt3a與dnmt3b表達(dá)下調(diào)后hescs的生長(zhǎng)特性；免疫熒光檢測(cè)hescs表面標(biāo)記；

50、rt-pcr檢測(cè)維持胚胎干細(xì)胞自我更新和維持未分化的相關(guān)基因；檢測(cè)hescs體外eb分化情況，在不同分化時(shí)間行akp染色和rt-pcr檢測(cè)三個(gè)胚層基因表達(dá)情況；檢測(cè)hescs在scid鼠體內(nèi)分化能力。 結(jié)果：dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)后hescs：在mef上呈克隆式生長(zhǎng)，表面標(biāo)記檢測(cè)呈hesc特征，表達(dá)oct3/4、sox2和nanog；eb分化障礙、akp消退延遲，dnmt3b下調(diào)后hescs分化時(shí)神經(jīng)外胚層標(biāo)記基因提前出現(xiàn)；dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)后hescs在scid小鼠體內(nèi)未形成畸胎瘤。 結(jié)論：dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)后不影響hescs未分化狀態(tài)的維持，推測(cè)

51、dnmt3a和dnmt3b不是hescs未分化狀態(tài)維持所必需的；dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致hescs分化缺陷，推測(cè)dnmt3a和dnmt3b是hescs正常分化所必需的。人類(lèi)胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells，hescs）來(lái)源于早期胚胎、具有自我更新和分化發(fā)育為三個(gè)胚層組織潛能的多能性細(xì)胞。hescs在多個(gè)領(lǐng)域，如細(xì)胞治療、組織工程、發(fā)育生物學(xué)、基因功能研究、藥物篩選等領(lǐng)域展示了巨大的應(yīng)用前景。 第一章：人胚胎干細(xì)胞株hsf6培養(yǎng)。 目的：探索和建立人胚胎干細(xì)胞株hsf6的培養(yǎng)方法。 方法：從icr胎鼠（e13.5）中分離胚胎成纖維細(xì)胞（mouse e

52、mbryonic fibroblast，mef），檢測(cè)絲裂霉素c處理或射線(xiàn)照射后mef的生長(zhǎng)狀態(tài)并作為hescs飼養(yǎng)層；將hescs培養(yǎng)于含10ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的ko-dmem培養(yǎng)基中，采用hescs的酶消化法傳代和機(jī)械法（巴氏德管制作的傳代工具）傳代；并對(duì)培養(yǎng)的hsf6進(jìn)行堿性磷酸酶染色、表面標(biāo)記檢測(cè)、體外擬胚體（embryoidbody，eb）分化能力檢測(cè)等特征鑒定。 結(jié)果：第3-5代的mef經(jīng)10g/ml絲裂霉素c處理1-3小時(shí)或經(jīng)3000rad射線(xiàn)照射后能抑制增殖。酶消化法傳代后hescs克隆大小不均，分化克隆容易殘留和擴(kuò)增；機(jī)械法傳代的hescs克隆大小較均勻，分化克

53、隆殘留較少或培養(yǎng)中容易被剔除，但機(jī)械法傳代過(guò)程繁瑣、操作時(shí)間較長(zhǎng)、工作量大；培養(yǎng)的hsf6能維持未分化狀態(tài)。 結(jié)論：建立了icr胎鼠（e13.5）mef的分離和培養(yǎng)方法，10g/ml絲裂霉素c處理1-3小時(shí)，或3000rad射線(xiàn)照射后可作為hsf6的飼養(yǎng)層；酶消化法和機(jī)械法均可用于hescs的傳代。 第二章：hescs體內(nèi)分化途徑獲取神經(jīng)干細(xì)胞。 目的：從hescs畸胎瘤中分離人神經(jīng)干細(xì)胞（neural progenitor cells，npc）。 方法：將hescs注射到scid鼠體內(nèi)分化為畸胎瘤，采用貼壁培養(yǎng)法從中分離人npc；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)npc標(biāo)記-巢蛋白（nestin）；檢測(cè)np

54、c分化能力，對(duì)分化細(xì)胞檢測(cè)神經(jīng)元標(biāo)記-微管蛋白（neuron-specific class beta-tubulin，tuj）和膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記-膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，gfap）。 結(jié)果：hescs注射scid鼠后5-8周后可分化為畸胎瘤，經(jīng)過(guò)貼壁培養(yǎng)和連續(xù)傳代從中分離到npc，免疫組織化學(xué)檢測(cè)nestin呈陽(yáng)性，能分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，分別表達(dá)tuj和gfap。 結(jié)論：利用貼壁培養(yǎng)法可從hescs畸胎瘤中分離到npc；“hescs-scid鼠-畸胎瘤”模型為細(xì)胞組織工程、發(fā)育分化研究提供了一個(gè)新的方法。 第三章：dnmt3a和dn

55、mt3b表達(dá)下調(diào)對(duì)hescs的影響。 目的：研究dna新生甲基化酶dnmt3a（dna methyltransferase 3a）和dnmt3b（dna methyltransferase 3b）表達(dá)下調(diào)后對(duì)hescs的影響。 方法：觀察dnmt3a與dnmt3b表達(dá)下調(diào)后hescs的生長(zhǎng)特性；免疫熒光檢測(cè)hescs表面標(biāo)記；rt-pcr檢測(cè)維持胚胎干細(xì)胞自我更新和維持未分化的相關(guān)基因；檢測(cè)hescs體外eb分化情況，在不同分化時(shí)間行akp染色和rt-pcr檢測(cè)三個(gè)胚層基因表達(dá)情況；檢測(cè)hescs在scid鼠體內(nèi)分化能力。 結(jié)果：dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)后hescs：在mef上呈克隆

56、式生長(zhǎng)，表面標(biāo)記檢測(cè)呈hesc特征，表達(dá)oct3/4、sox2和nanog；eb分化障礙、akp消退延遲，dnmt3b下調(diào)后hescs分化時(shí)神經(jīng)外胚層標(biāo)記基因提前出現(xiàn)；dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)后hescs在scid小鼠體內(nèi)未形成畸胎瘤。 結(jié)論：dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)后不影響hescs未分化狀態(tài)的維持，推測(cè)dnmt3a和dnmt3b不是hescs未分化狀態(tài)維持所必需的；dnmt3a和dnmt3b表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致hescs分化缺陷，推測(cè)dnmt3a和dnmt3b是hescs正常分化所必需的。人類(lèi)胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells，hescs）來(lái)源于早期胚胎、具有自我更新和分化發(fā)育為三個(gè)胚層組織潛能的多能性細(xì)胞。hescs在多個(gè)領(lǐng)域，如細(xì)胞治療、組織工程、發(fā)育生物學(xué)、基因功能研究、藥物篩選等領(lǐng)域展示了巨大的應(yīng)用前景。 第一章：人胚胎干細(xì)胞株hsf6培養(yǎng)。 目的：探索和建立人胚胎干細(xì)胞株hsf6的培養(yǎng)方法。 方法：從icr胎鼠（e13.5）中分離胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblast，mef），檢測(cè)絲裂霉素c處理或射線(xiàn)照射后mef的生長(zhǎng)狀態(tài)并作為hescs飼養(yǎng)層；將hescs培養(yǎng)于含10n