PCR常見問(wèn)題與對(duì)策分析

1、PCR 常見問(wèn)題與對(duì)策分析【摘要】 PCR (多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng).polymerase chain reaction)是從20世紀(jì)80年代發(fā)展的體外核算擴(kuò)增技術(shù)。 PCR 技術(shù)可以說(shuō)是生物工程、 生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)具有創(chuàng)時(shí) 代意義的程碑，它具有簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好、產(chǎn)率高、敏 感、特也等諸多突出的優(yōu)點(diǎn)， 本文針對(duì)一些有關(guān) PCR 技術(shù)中 常見問(wèn)題進(jìn)行了分析。【關(guān)鍵詞】 PCR 技術(shù)；常見問(wèn)題；問(wèn)題分析【中圖分類號(hào)】 Q503 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A 【文章編號(hào)】 1005-0019 ( 2014) 03-0559-02關(guān)于核算的研究已經(jīng)有一百多年的歷史了， 20 世紀(jì) 60 年代末開始， 人們便致力于

2、研究基因體外分的技術(shù)， 在 1985 年 Mullis 等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)，其原理是在試管中給 DNA 的體外合成提供了適合復(fù)制的條件， 與 DNA 的體內(nèi)復(fù) 制很相似。但 Mullis 所使用的 Klenow 酶不耐高溫， 90 攝氏 度時(shí)會(huì)變性失活。直到 1988 年， SaKi 等人從嗜熱桿菌中提 取了一種耐高溫的 DNA 聚合酶才得以解決這一問(wèn)題。 在 PCR 技術(shù)被人們廣泛使用過(guò)程中，也出現(xiàn)了很多見或少見的問(wèn) 題，筆者對(duì)此類問(wèn)題進(jìn)行了總結(jié)及歸納，并給出了相應(yīng)的對(duì)1 片狀帶或涂抹帶在 PCR 擴(kuò)增時(shí)偶爾會(huì)出現(xiàn)片狀帶、 涂抹帶或地毯樣帶等 現(xiàn)象。原因有可能是dNTP的濃度太高，Mg2

3、+的濃度太高， 循環(huán)次數(shù)太多或者脫貨溫度太低等引起的；也可能是模板降 解時(shí)，所使用的酶的質(zhì)量太差或是酶的使用量過(guò)多所引起 的。出現(xiàn)此類問(wèn)題時(shí)一般解決方法為： 可以適當(dāng)?shù)慕档?dNTP 的濃度和Mg2+濃度、減少循環(huán)次數(shù)、升高退火溫度、更換 模板或增加模板量、減少酶使用量等。2 擴(kuò)增條帶PCR 擴(kuò)增的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有很多，其中包括模板 DNA 的特 性、酶的活性及質(zhì)量、引物的特異性與質(zhì)量、 PCR 擴(kuò)增時(shí)的 反應(yīng)條件等，不出現(xiàn)條狀帶時(shí)應(yīng)該對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行針對(duì)性分 析。（1）模板的來(lái)源不同，則在反應(yīng)時(shí)所使用的量也會(huì)不 同，模板的質(zhì)和量不同，則反應(yīng)效果有可能不同，如當(dāng)真核 基因組 DNA 作為模板時(shí)， 所使

4、用的模板量應(yīng)該比原核的多。 模板的純度也會(huì)對(duì)PCR擴(kuò)增有一定的影響，如含有Taq或雜 蛋白時(shí)會(huì)影響反應(yīng)的效率。（2）引物的質(zhì)量、濃度、兩條引物濃度是否相同是相 影響 PCR 擴(kuò)增時(shí)常見原因之一。（3）由于 Taq 酶容易被污染或失活， 也會(huì)影響反應(yīng) PCR的反應(yīng)效果（4）PCR 產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)，最好為當(dāng)日檢測(cè)且一般 不要超過(guò)48h，超過(guò)48h后會(huì)出現(xiàn)帶形不規(guī)則，甚至消失等 現(xiàn)象。3 非特異性擴(kuò)增帶PCR 擴(kuò)增后所出現(xiàn)的條帶跟預(yù)計(jì)時(shí)的大小不同， 或同時(shí) 出現(xiàn)多個(gè)特異性擴(kuò)增帶或非特異性條帶等，此類現(xiàn)象的發(fā)生 可能以下幾種可能。第一種是引物與靶序列沒(méi)有完全互補(bǔ)、或引物發(fā)生了聚 合形成二聚體。第二種

5、是脫貨溫度過(guò)低、 Mg2+ 的濃度過(guò)高或者是與PCR 循環(huán)次數(shù)過(guò)多等因素有關(guān)。 第三種是酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量不合格。 對(duì)于此類現(xiàn)象的發(fā)生其對(duì)策主要包括重新設(shè)計(jì)引物，減 少酶量或調(diào)換為零一種來(lái)源的酶、適當(dāng)增加模板量，降低引 物量，減少；循環(huán)次數(shù)，適當(dāng)提高退火的溫度或者可以采用 二溫度點(diǎn)法等。4 假陽(yáng)性假陽(yáng)性是指樣品出現(xiàn)了目的 DNA 擴(kuò)增條帶的現(xiàn)象，其 原因是存在擴(kuò)增產(chǎn)物或模板的交叉污染，這種污染發(fā)生的原 因有以下兩種可能。第一種是空氣中的小片段核酸受到了污染，這些小片段 比靶序列短，但是具有一定的同源性?？苫ハ噙M(jìn)行拼接，與 引物進(jìn)行互補(bǔ)后， 可以擴(kuò)增出 PCR 的產(chǎn)物， 從而導(dǎo)致了假陽(yáng) 性的產(chǎn)生

6、。解決此類問(wèn)題的對(duì)策是利用巢式 PCR 方法來(lái)消除 或減輕。第二種是大片段或整個(gè)基因組的交叉污染，導(dǎo)致了假陽(yáng)性。當(dāng)出現(xiàn)這種假陽(yáng)性時(shí)有以下幾種解決方法：為了防止 目的 DNA 濺出離心管之外或吸入加樣槍內(nèi)，操作時(shí)應(yīng)該盡 量小心輕柔。將所有可以高壓的器材或試劑進(jìn)行高壓消 毒，所使用的進(jìn)樣槍頭或離心管等均應(yīng)一次性使用等。在 必要時(shí)，加入標(biāo)本之前，試劑和反應(yīng)管等物品要進(jìn)行紫外線 照射，這樣就可以破壞存在的核酸了。5 母鏈結(jié)合當(dāng)PCR反應(yīng)加熱至90 C95 C左右時(shí)，會(huì)使模板 DNA 產(chǎn)生變形，解開時(shí)為單鏈。當(dāng)退火冷卻至55C60 C左右時(shí)，因?yàn)橐锓肿恿枯^小，運(yùn)動(dòng)速度較快，和母鏈碰撞的機(jī) 會(huì)會(huì)很多，所

7、以退火時(shí)引物優(yōu)先會(huì)與母鏈互相結(jié)合。引物如 果太大，會(huì)導(dǎo)致退火時(shí)無(wú)法激發(fā)模板，即引物無(wú)法優(yōu)先與模 板鏈互相結(jié)合，而是與較多的互補(bǔ)模板鏈互相結(jié)合。所以引 物不能太大，一般不可以超過(guò) 30 個(gè)脫氧核苷酸的長(zhǎng)度。6 緩沖液PCR 緩沖液不僅對(duì) pH 的變化有緩沖作用，而且有利于 模板退火和引物的 K 離子，以及含有能夠激活 DNA 聚合酶 的 Mg2+ 離子， 還有 DNA 聚合酶的穩(wěn)定劑等。 所以緩沖液中 通常會(huì)含有 MgCI2、Tris?HCI （ pH =8.4，室溫）、KCI、明膠 等。Mg2+離子對(duì)Taq酶的活性以及專一性都具有一定的影 響，Mg2+離子濃度過(guò)高時(shí)，Taq酶專一性降低而活性會(huì)

8、加強(qiáng)， 所以當(dāng)Mg2+離子的濃度過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物積 累，而當(dāng) Mg2+ 離子的濃度過(guò)低， 會(huì)導(dǎo)至擴(kuò)增量降低。 MgCI2 最佳濃度一般為 1.5mmoI/mL 左右。7 原料以及反應(yīng)體系加入 PCR 反應(yīng)體系中的 dNTP （是四種脫氧核苷磷酸的 統(tǒng)稱），即：dCTP、dTTP、dGTP、Datp，它們分別由，四種 普通的脫氧核苷酸在消耗 ATP 的基礎(chǔ)之上活化而形成的。 例 如如: ATP+dNDP ADP+dNTP。由此可見 dNTP 是消耗了 ATP 活化的脫氧核苷酸，已經(jīng)具備了反應(yīng)時(shí)所需要的所有能量， 所以 PCR 反應(yīng)體系不需要再添加 ATP 了。8 結(jié)語(yǔ)近幾年來(lái)， 眾多學(xué)者對(duì) PCR 技術(shù)進(jìn)行了研究與改進(jìn)， 經(jīng) 過(guò)他們不斷的探索與創(chuàng)新， PCR 技術(shù)有了進(jìn)一步的發(fā)展與完 善，并且已經(jīng)派生出反轉(zhuǎn)錄 PCR、原位PCR、熒光PCR、單 細(xì)胞 PCR 等各式各樣的新型的 PCR 技術(shù)， 并且這些 PCR 技 術(shù)進(jìn)行相互融合，繼而為分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究的深入開展 提供了高質(zhì)量的技術(shù)方面的保障，為公共衛(wèi)生事業(yè)提供了快 捷、方便、靈敏的檢測(cè)手段，為生命科學(xué)的研究及發(fā)展打開 了一扇扇嶄新的大門。參考文獻(xiàn)1 劉本舉 .與 PCR 技術(shù)有關(guān)的常見問(wèn)題答疑 J. 生