流式細胞儀的臨床應(yīng)用

1、流式細胞儀的原理及其臨床應(yīng)用作者：zfy5956 （站內(nèi)聯(lián)系 TA）發(fā)布：2006-05-11流式細胞技術(shù)（FCM是70年代發(fā)展起來得一種快速對單細胞定量分析的新技術(shù)，它借簦了熒光顯微鏡技術(shù)，同時利用與熒光染料，激光技術(shù),單抗技術(shù)以及計算機 技術(shù)的發(fā)展，將熒光顯微鏡的激發(fā)光源改為激光，使之具有更好的單色性與激發(fā) 效率,因而大大提高了檢測靈敏度，同時將固定的標本臺改為流動的單細胞懸液， 用計算機進行數(shù)據(jù)處理，因而大大提高了檢測速度與統(tǒng)計精確性，而且從同一個 細胞中可以同時測得多種參數(shù)，為生物醫(yī)學與臨床檢驗學發(fā)展提供了一個全新的 視角和強有力的手段.目前，該技術(shù)已經(jīng)廣泛用于基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用，在免

2、疫學, 遺傳學,血液學,腫瘤學等領(lǐng)域內(nèi)發(fā)揮前重要的作用.本文著重介紹流式細胞儀基 本原理及其在臨床上的應(yīng)用.一. 基本原理流式細胞儀的主要結(jié)構(gòu)可以大致分為這樣幾個組成部分：激光系統(tǒng),流式系統(tǒng)，信號處理及放大，計算機系統(tǒng).圖一，圖二概括了流式細胞儀的基本原理，當待 測標本被制務(wù)成單細胞懸液，經(jīng)染色后進入流動室，流動室內(nèi)充滿流動的鞘液，鞘 液壓力與樣品流壓力是不同的，當二者的壓力差異達到一定程度時，鞘液裹挾著 的樣品流中細胞排成單列逐個經(jīng)過激光聚焦區(qū).如果我們將細胞中感興趣的部分 特異性地標上熒光染料，那么這些染料將在細胞通過激光檢測區(qū)時受激發(fā)出特定 波長的熒光，通過一些波長選擇通逶性的濾色片，我

3、們可以將不同波長的散射光， 熒光信號區(qū)分開來，并送到不同的光電配增管中，經(jīng)過一系列信號轉(zhuǎn)換，放大，數(shù) 字化處理,我們就可以在計算機上直觀地統(tǒng)計染上各種熒光染料的細胞各自的百 分率.選擇不同的單克隆抗體及熒光染料，我們可以利用流式細胞儀同時測定一 個細胞上的多個不同的特征，如果對具有某種特征的細胞有興趣，我們還可以利 用流式的分選功能將其分選出來，以便于進一步培養(yǎng)，研究二. 流式細胞儀在免疫學中的應(yīng)用1. 淋巴細胞亞群分析淋巴細胞是正常機體免疫系統(tǒng)功能最重要的一大細胞群，在免疫應(yīng)答過程中，未 梢血淋巴細胞發(fā)育成為功能不同的亞群.各亞群的數(shù)量和功能了生異常時，就能 導致機體免疫紊亂并產(chǎn)生病理變化.

4、FCM可以同時檢測一種或幾種淋巴細胞細胞 表面抗原,將不同的淋巴細胞亞群數(shù)量的測定來監(jiān)控病人的免疫狀態(tài)，指導治療.2. 感染及其治療效果觀察由于T淋巴細胞在人體免疫系統(tǒng)中承擔著重要的功能，因此，當感染發(fā)生時,T淋 巴細胞各亞群的變化往往能很敏感地反映感染的狀態(tài)與程度.例如,細胞膜外CD4分子有HIV識別部位,因此CD4細胞是HIV病毒受體,AIDS病人CD4+Tffl胞明 顯減少,該指標是診斷AIDS的重要標志.當病毒感染發(fā)生時（如乙型肝炎,EB病毒 和巨細胞包涵體病毒）,CD8+T細胞增多,對CD8細胞的測定有助于對感染的診斷, 治療效果的動態(tài)觀察.利用流式細胞儀可對器官或骨髓移植后病人進行

5、監(jiān)控 .當病人CD3+,CD25持續(xù) 增加提示已經(jīng)開始發(fā)生排異,CD4/CD8持續(xù)下降表明有感染發(fā)生,當其比值小于 0.2時必須停用免疫抑制劑.由于流式細胞儀將靜態(tài)的，顯微鏡下肉眼觀察改為動態(tài)的，計算機信號處理，因此, 在流式細胞儀上T細胞亞群統(tǒng)計方式已從傳統(tǒng)的熒光顯微鏡下計數(shù)200個細胞成 為幾秒鐘內(nèi)計數(shù)上萬個 , 因此結(jié)果更真實 , 更具有統(tǒng)計意義 .3. 其他免疫功能性疾病分析 流式細胞儀便捷 , 準確的特點可以用來對自身免疫性疾病進行檢測與療效觀察 . SLE病人的淋巴細胞變化可以反映該病的活動情況和器官侵犯程度.活動或非活 動性SLE伴有多系統(tǒng)疾病但無腎臟損害的病人可出現(xiàn)CD4/CD

6、8比值升高,伴有嚴重腎臟損害的SLE病人可出現(xiàn)低CD4+高CD8+勺現(xiàn)象.有證據(jù)表明外周血HLAB27的表達及其表達程度與強直性脊髓炎的發(fā)生有很大程 度的相關(guān)性,利用流式細胞儀可以進行HLA-B27./HLA-B7雙標記來檢測HLA-B27 陽性細胞，同時排除交叉反應(yīng).另外,CD23表達的增加與變態(tài)反應(yīng)性疾病，自身免 疫性疾病 , 腎病綜合癥有關(guān) , 而且陽性率與病情嚴重程度呈正相關(guān) , 治療有效后 CD23+田胞減少.利用流式細胞儀檢測PNH血細胞的細胞膜所缺乏的糖化肌醇磷脂(GPI)錨連接的 蛋白如DAF(CD55.與MIRI(CD59.)來確診陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿傳統(tǒng)的血清 溶血試驗具

7、有更高的特異性與靈敏度 .一 . 流式細胞儀在血小板功能評價方面的應(yīng)用血小板膜糖蛋白(GP)是參與止血，血栓形成的重要分子基礎(chǔ)，這些膜糖蛋白是一 類重要得黏附分子.用搞GP.的單克隆抗體對血小板進行免疫熒光標記，用FCM 分析單個血小板或血小板亞群GP是血小板膜糖蛋白檢測分析方法的重大發(fā)展， 方法簡便,快速,標本用量少,靈敏度高,結(jié)果準確.與血小板有關(guān)的抗原的臨床意義有 :1. 診斷遺傳性血小板功能缺陷疾病巨血小板綜合癥(BSS)患者血小板CD42 ACD42B復合物先天缺陷,FCM中表現(xiàn) CD42Af CD42環(huán)僅嚴重缺乏，而且其平均熒光強度顯著低于陰性對照,CD61代償 性增加.血小板無力

8、癥(GT)患者FCM表現(xiàn)血小板GPIIBIIA(CD41,CD61)明顯缺乏,CD42A 和CD42B基本正?；蛏愿?并可出現(xiàn)異常血小板亞群.3. 血栓性疾病和血栓前狀態(tài) 由于活化血小板是血栓的主要成分之一 , 也是引起血栓形成的主要原因 , 所以血 小板活化程度增高與疾病發(fā)生發(fā)展有關(guān).CD62P.和CD63是活化血小板最特異和 靈敏的分子標志物,正常人血小板只有低水平活化，外周血CD62P只有3-5%. 有文獻報導糖尿病伴有微血管病變 , 冠心病 , 高血壓病 . 高血脂病 , 腦血栓形成 , 腦 動脈硬化患者活化血小板百分率和絕對數(shù)顯著高于正常人 , 而糖尿病無微血管病 變, 周圍血管病以

9、及深靜脈血栓形成患者活化血小板水平與正常人無顯著差 異.PTCA后 24小時發(fā)展成急性血管閉塞或高度再狹窄的患者CD62P.和CD63增多,FCM可用于測PTCAt急性缺血再發(fā)作的危險性.四, 流式細胞儀在白血病中的應(yīng)用血液病多種為腫瘤性免疫性和遺傳性疾病，但惡性血液病約占一半以上.FCM在 血液病的發(fā)病機制 ,診斷,分類,治療和預后判斷方面都有廣闊的應(yīng)用前景 .1. 白血病的分類研究 白血病分類是選擇化療方案和判斷預后的重要依據(jù) . 由于血細胞在其分化的不同 階段,承擔不同功能時有不同的特征抗原表達，因此FCM結(jié)合單克隆抗體可以提 高白血病分類診斷的附和率 ,根據(jù)白血病細胞所表達相關(guān)細胞的種

10、系抗原 ,可將 它分為B細胞系,T細胞系，髓細胞系，紅細胞系和巨核細胞系，可確診白細胞的分 類和分期 , 并可探明慢粒急變時的細胞來源 .2. 微小殘病變檢出 (MRD)MRDi白血病復發(fā)的主要根源,.FCM其高特異性與敏感性可以在患者緩解期檢 測是否有殘存病變細胞,早期探測MRD以避免復發(fā).五FCM在腫瘤學上的應(yīng)用1.DNA含量測定及細胞周期分析FMC在腫瘤學上的應(yīng)用主要是利用 DNA含量測定進行包括癌前病變及早期癌變的 檢出 , 化療指導以及預后評估等工作 .大量工作表明,癌前病變的癌變率與病變的增生程度一致,而增生程度與DNA含 量的異常改變又呈平行關(guān)系.FCM通過精確定量DNA含量,能

11、對癌前病變的性質(zhì)和 了展趨勢作出判斷 ,有助于癌變的早期診斷 .DNA非整倍體的出現(xiàn)可能是惡變細胞的重要標志，目前病理學尚無法從癌前病變 中發(fā)現(xiàn)癌變和即將癌變的細胞,而FCM檢測中DNA非整倍體細胞的出現(xiàn)可作為一 個有價值的參數(shù) .DNA咅體分析有助于臨界性腫瘤的診斷，如卵巢的交界性腫瘤，異倍體的出現(xiàn)與病變的惡性發(fā)展有關(guān) .細胞異常增殖和分化障礙是腫瘤細胞的特性，DNA含量不僅能非常敏感地反映細 胞代謝的異常，而且能通過DNA倍體分析，細胞周期各時相的細胞比例分析并結(jié) 合細胞抗原的表達多參數(shù)分析 , 全面了解細胞的生物學行為 , 從而幫助腫瘤的診 斷, 選擇治療方案和預后判斷 .DNA異倍體,

12、高S_PHAS細胞比值和高增殖細胞核抗原(PCNA)表達與細胞增殖能 力, 惡性程度和不良預后呈正相關(guān) .2. 為治療方案和藥理學研究提供依據(jù)不同類型的腫瘤對化療藥物的敏感程度是不同的.可以利用FCM進行細胞 期分析, 適當選用周期特異性藥物或非周期特異性藥物 .MDR是由多藥耐藥基因編的P糖蛋白(PGP)是親脂化合物,包括多種抗癌藥物和熒 光染料的跨膜性排出泵.從人淋巴細胞排出熒光染料與細胞內(nèi) P-GP的含量直接 相關(guān).當淋巴細胞出現(xiàn)MDR陽性細胞時，病人對化療藥物開始出現(xiàn)耐藥性，需要考 慮其他治療方式 .六, 活細胞內(nèi)活性酶的檢測據(jù)資料顯示活細胞內(nèi)活性酶的分析可以應(yīng)用在許多醫(yī)學領(lǐng)域 . 根

13、據(jù)酶的活性可以 鑒別不正常細胞 , 酶的活性也會因為受到藥物的作用而會有所改變 , 因為酶的活 動牽涉到細胞的新陳代謝 ,所以測量細胞內(nèi)酶的活性能夠提供許多細胞進展的訊 息,包括活化 ,分化,凋亡, 成熟, 增殖等. 傳統(tǒng)上應(yīng)用的測定細胞中酶的活性的方 法(如FLUOROMETRICCOLORIMDTRIC_ASSAYS是測定總體細胞的總酶活性而 非測定單一細胞的酶活性 .若要測定單一細胞的酶活性 , 通常都是涉及固定后的 死細胞.近來COULTE公司推出最新的技術(shù)及試劑 cellPROBE_REAGEiN于每一 個特定的酶都有其專一的受質(zhì) , 而受質(zhì)本身是由特別的化學品與熒光染料 flour

14、ensceiN rhodamineNO價結(jié)合的,能迅速進入活細胞,當其遇到特異性 酶時,會被酶破壞其共價結(jié)構(gòu)而釋放其熒光染料,從而能夠被FCM僉測到,因此, 活細胞酶探針能夠用來測量單一活體細胞內(nèi)酶的活性.七. 凋亡細胞檢測凋亡最初是作為形態(tài)學概念被提出來的 .細胞有兩種不同的死亡方式 . 即壞死 (MECROSIS口凋亡(APOPTOISI).凋亡典型的形態(tài)特征是核染色質(zhì)固縮并分離,細 胞質(zhì)濃縮 , 細胞膜和核膜皺曲 , 核斷裂形成片斷 , 最后形成數(shù)量不等的凋亡小體 . 利用FC剛以進行DNA斷裂點標記檢測.DNA片斷可以從細胞內(nèi)漏出,導致DNAt 量減少,利用FCMt行DNA含量分析,通

15、過二倍體細胞G0/G1期峰前的亞二倍體峰 來確定 .在凋亡早期 , 一些與膜通透性改變及凋亡有關(guān)的蛋白在細胞膜表面有特定表達 , 例如FAS基因蛋白(CD95),線粒體膜蛋白(AP027),磷脂酰絲氨酸 (ANNEXIN_V),FCMg合單克隆抗體可以檢測表達這些蛋白的細胞 ，從而確定細胞 的凋亡情況 .自70年代流式細胞儀成型以來 ,歷經(jīng)20多年的發(fā)展, 流式細胞儀應(yīng)用意義越來越 得以體現(xiàn) ,尤其是 1982年以后, 隨著白細胞分化抗原意義的確認以及單克隆抗體 技術(shù)的發(fā)展 , 給流式細胞儀的應(yīng)用發(fā)展提供了強大的推動力 .在我國, 不僅許多科 研單位早在 80 年代已經(jīng)開始使用流式細胞儀作為其科研工具 , 進入 90年代后, 以庫爾特原理及其相關(guān)血