RP—HPLC法測(cè)定黔產(chǎn)大接骨丹根皮藥材中紫丁香苷的含量論文

1、RPHPLC法測(cè)定黔產(chǎn)大接骨丹根皮藥材中紫丁香苷的含量論文【摘要】目的：采用高效液相色譜法測(cè)定黔產(chǎn)大接骨丹根皮藥材中紫丁香苷的含量，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。方法：采用Agela Promosil C18色譜柱（46mmx250mm，5μm），以乙腈-05%磷酸水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為10mL/min，柱溫為35，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，分析時(shí)間為65 min，對(duì)16批黔產(chǎn)大接骨丹根皮藥材中紫丁香苷進(jìn)行了含量測(cè)定。結(jié)果：紫丁香苷在0288128805μg（r=09995）范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系；平均加樣回收率（n=6）為10053%，RSD為168%。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、快速

2、、準(zhǔn)確，可為大接骨丹根皮藥材的質(zhì)量控制提供參考?！娟P(guān)鍵詞】大接骨丹；高效液相色譜法；紫丁香苷；質(zhì)量控制【中圖分類號(hào)】R914【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2017）04-0030-03Determination of Syringin Contents in Root Bark of Toricellia Angulata OlivvarIntermedia（Harms） Hu in Guizhou by RP-HPLCHAN Zhongyao1LI Yan1LI Fangfang1LU Tingxiang1YANG Shuxiang1WEI Xuejun1*1Qianna

3、n Medical College for Nationalities，Duyun 558000，China；2ShangCai County Peoples Hospital， ShangCai 463800，ChinaAbstract：Objective To establish an HPLC method for the content determination of syringin in the root bark of Toricellia Angulata Olivvarintermedia（Harms） Hu for its quality controlMethod Ag

4、ela Promosil C18（46mmx250mm，5μm）column was used and eluted with the mobile phase of acetonitrile-05% phosphoric acid solution in a gradient mode，the flow rate was 10mL/min，column temperature was 35 The detection wavelength was at 220 nm，the analytical time was 65 min Syringin of 16 batches in the

5、 root bark of Toricellia Angulata Olivvarintermedia （Harms） Huwere detectedResult The linear ranges for syringin was 0288128805μg（r=09995）Their average recoveries（n=6） were 10053% and the RSD was 168%，respectivelyConclusion The method is simple，rapid，accurate and can be used for quality control o

6、f the root bark of Toricellia Angulata Olivvarintermedia（Harms） HuKeywords： Toricellia Angulata Olivvarintermedia（Harms） Hu；HPLC； Syringin；Quality Control大接骨丹為山茱萸科鞘柄木屬植物齒裂鞘柄木Toricellia Angulata Olivvarintermedia（Harms） Hu的根、葉、花，收載于貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，是貴州少數(shù)民族聚集地、苗醫(yī)院及市（州）級(jí)中醫(yī)院應(yīng)用廣泛的民族藥之一，別名水冬瓜、水五加、接骨丹等，具有活血

7、祛瘀、舒筋接骨的功效，主要用于哮喘、瘀血?jiǎng)趥?、骨折、跌撲損傷等【1】。中華本草等記載該藥味苦、辛、微麻，性平，用于風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、產(chǎn)后腰痛、慢性腸炎、腹瀉，外用治骨折、跌打損傷等。由于該藥臨床療效好，是治療各類骨折、跌打損傷、肌肉勞傷等癥的理想用藥，該藥被黔南本草【4】、貴州民間方藥集【5】等諸多地方本草收載。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)大接骨丹藥材的研究主要集中在化學(xué)成分相關(guān)研究，如大接骨丹藥材主含苯丙素苷、環(huán)烯醚萜苷、黃酮苷、二萜等化學(xué)成分，已確定的單體化合物如紫丁香苷【6】、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、黃芪苷、β-谷甾醇、硬脂酸、軟脂酸、10-Griselinosidic acid等，同時(shí)，現(xiàn)代生

8、物活性實(shí)驗(yàn)研究表明大接骨丹樹(shù)皮具有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫抑制等作用，而關(guān)于大接骨丹根皮含量測(cè)定相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。研究表明，紫丁香苷具有抗炎、保肝作用等生物活性，這可能與該藥在臨床與民間的廣泛應(yīng)用有密切關(guān)系，紫丁香苷為該藥的活性成分之一。課題組根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果并結(jié)合后期實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，首次采用反相高效液相色譜梯度洗脫法建立了黔產(chǎn)大接骨丹根皮藥材中紫丁香苷的含量測(cè)定方法，并對(duì)收集到的16批黔產(chǎn)大接骨丹根皮藥材進(jìn)行了含量測(cè)定，為大接骨丹根皮藥材的質(zhì)量控制及合理開(kāi)發(fā)利用資源提供參考與依據(jù)。1儀器與材料11儀器Agilent 1260型高效液相色譜儀（二極管陣列檢測(cè)器，在線真空脫氣機(jī)、四元梯度泵、自

9、動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱及Chemstaion化學(xué)工作站，美國(guó)安捷倫科技公司）；BP211型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯）。12材料紫丁香苷對(duì)照品（批號(hào)：160120，成都克洛瑪生物科技有限公司），乙腈（色譜純，批號(hào)：20160710，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司），磷酸（分析純，批號(hào)：20140201，重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司），水為娃哈哈礦泉水（批號(hào)：20160504，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司），乙醇（分析純，批號(hào)：20160401，重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司），其他試劑均為分析純。16批大接骨丹根皮藥材均為自采，所有藥材均經(jīng)黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系中藥教研室王傳明副教授鑒定為山茱萸科植物有

10、齒鞘柄木Toricellia Angulata Olivvarintermedia（Harms） Hu的根皮。見(jiàn)表1。2方法與結(jié)果21溶液的制備211對(duì)照品溶液精密稱取紫丁香苷對(duì)照品適量，置于25mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得到紫丁香苷照品儲(chǔ)備液濃度為05761mg/mL。表1大接骨丹根皮藥材來(lái)源NO.產(chǎn)地NO.產(chǎn)地S1貴州都勻S9貴州長(zhǎng)順S2貴州惠水S10貴州都勻S3貴州惠水S11貴州都勻S4貴州惠水S12貴州綏陽(yáng)S5貴州長(zhǎng)順S13貴州綏陽(yáng)S6貴州長(zhǎng)順S14貴州綏陽(yáng)S7貴州都勻S15貴州黔西S8貴州惠水S16貴州黔西212供試品溶液稱取大接骨丹根皮藥材粉末（過(guò)四號(hào)篩）約05g

11、，精密稱定，置50mL圓底燒瓶中，精密加入甲醇10mL，稱定重量，回流提取1h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液用045 μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得。22色譜條件采用Agela Promosil C18色譜柱（46mmx250mm，5μm），檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為35 ，流速為10 mL/min，流動(dòng)相為乙腈（A）-05%磷酸水（B）梯度洗脫（020min，10%25% A；2050min，25%65% A；50501min，65%10% A；50165min，10% A），記錄65 min的色譜圖。對(duì)照品和大接骨丹根皮藥材

12、樣品的色譜圖見(jiàn)圖1。23方法學(xué)考察231線性關(guān)系考察分別精密吸取紫丁香苷對(duì)照儲(chǔ)備液05、1、2、3、4、5 mL于10mL量瓶中，分別用甲醇稀釋到刻度，搖勻，即得。分別注入高效液相色譜儀并測(cè)定各成分的色譜峰面積，得到進(jìn)樣量C（μg）與峰面積A的線性方程。結(jié)果表明，紫丁香苷進(jìn)樣量在0288128805μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性方程分別為A=69689C+ 21178 （r=09995）。232精密度試驗(yàn)取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定紫丁香苷峰面積。結(jié)果表明，計(jì)算紫丁香苷的RSD值為108%，表明儀器精密度良好。233重復(fù)性試驗(yàn)取大接骨丹根皮藥材樣品6份，按照212;項(xiàng)

13、下的方法進(jìn)行操作，制備供試品溶液，按22;項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣分析，測(cè)得紫丁香苷峰面積的RSD值為224%，表明該分析方法重復(fù)性良好。234穩(wěn)定性試驗(yàn)取大接骨丹根皮（S3）供試品溶液，分別于0、2、4、6、12、24、36h進(jìn)行分析，考察紫丁香苷峰面積，結(jié)果表明，紫丁香苷峰面積的RSD值為236%，表明供試品溶液在36 h內(nèi)基本穩(wěn)定。235加樣回收率試驗(yàn)精密稱取已知含量的大接骨丹根皮（S3）藥材粉末約025g，共6份，每組分別精密加入05701g/L紫丁香苷對(duì)照品溶液1mL，混合均勻，按照212;項(xiàng)下的方法進(jìn)行操作，制備供試品溶液，按22;項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，紫丁香苷平均加樣回

14、收率（n=6）為10053%，RSD為168%，結(jié)果見(jiàn)表2。表2加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）成分取樣量/g原有量/mg加入量/mg測(cè)得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%紫丁香苷0253105796057011151100230251805766057011143993502519057690570111389842025410581905701117110333025240578005701115510121025070574105701114810067100531682 4樣品含量測(cè)定分別按照212;項(xiàng)下的方法進(jìn)行操作，制備供試品溶液，按22;項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣分析，對(duì)16批自采

15、大接骨丹根皮（即水冬瓜根皮）藥材進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算紫丁香苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。表316批大接骨丹根皮藥材中紫丁香苷的含量NO產(chǎn)地紫丁香苷/mg-g-1S1貴州都勻059S2貴州惠水185 S3貴州惠水229 S4貴州惠水171 S5貴州長(zhǎng)順256S6貴州長(zhǎng)順068S7貴州都勻313 S8貴州惠水133 S9貴州長(zhǎng)順101 S10貴州都勻176S11貴州都勻187 S12貴州綏陽(yáng)265 S13貴州綏陽(yáng)402 S14貴州黔西555 S15貴州黔西115S16貴州綏陽(yáng)118 3討論31樣品提取條件的優(yōu)化試驗(yàn)考察比較了甲醇、70%乙醇、90%乙醇等不同溶劑和超聲、回流、冷浸等方法，其中，以甲醇回流提取

16、1h 提取效果較好。32色譜條件的優(yōu)化預(yù)試驗(yàn)應(yīng)用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)大接骨丹根皮藥材波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，參照3D立體圖構(gòu)向分析，發(fā)現(xiàn)在220nm 處，紫丁香苷色譜吸收相對(duì)較大且分離度高，在線梯度洗脫時(shí)，基線平穩(wěn)，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm。考察了甲醇-水、甲醇-磷酸水、乙腈-水、乙腈-磷酸水等流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)采用乙腈-磷酸水具有較高的分離度?？疾炝瞬煌V柱、不同柱溫及不同流速下的分離效果，最終確定了本實(shí)驗(yàn)的色譜分析條件。33含量測(cè)定指標(biāo)性成分的選擇含量測(cè)定指標(biāo)性成分的選擇時(shí)，通常選擇峰面積較大且保留時(shí)間居中的色譜峰作為指標(biāo)性成分，但是，由于2-8號(hào)峰為未知化學(xué)成分，根據(jù)文獻(xiàn)，課題組利用液質(zhì)

17、聯(lián)用技術(shù)及對(duì)照品比較法嘗試對(duì)大接骨丹根皮藥材中的多種化學(xué)成分進(jìn)行指征，但由于該藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究相對(duì)薄弱，課題組通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)及對(duì)照品比較法，僅指征了圖譜中1號(hào)峰為紫丁香苷;，并最終確定1號(hào)峰紫丁香苷作為本研究含量測(cè)定的指標(biāo)性成分。含量測(cè)定結(jié)果表明，自采的16批黔產(chǎn)大接骨丹根皮藥材中紫丁香苷的含量差異較大，說(shuō)明各批次藥材質(zhì)量存在明顯差異，各產(chǎn)地藥材成分含量差異較大的原因可能是由于大接骨丹藥材的生長(zhǎng)環(huán)境、不同采收期、不同生長(zhǎng)期等影響因素造成。同時(shí)，應(yīng)加強(qiáng)針對(duì)大接骨丹根皮（即水冬瓜根皮）物質(zhì)基礎(chǔ)的深入研究，同時(shí)，基于物質(zhì)基礎(chǔ)，開(kāi)展指紋圖譜的深入研究，對(duì)大接骨丹根皮（即水冬瓜根皮）不同部位、不同采收期

18、確定研究以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升。參考文獻(xiàn)【1】林亞平，葉陽(yáng)明.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn). 貴陽(yáng)：貴州科技出版社，2003：107.【2】 南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典. 2版.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1995：197.【3】 貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院.中華本草（苗藥卷）.貴陽(yáng)：貴州科技出版社，2005：164.【4】 司有奇.黔南本草（上冊(cè)）. 貴陽(yáng)：貴州科技出版社，2015：107.【5】 楊濟(jì)秋，楊濟(jì)中.貴州民間方藥集. 3版.貴陽(yáng)：貴州人民出版社，1978：126.【6】 吳少華，馬云保，羅曉東，等.大接骨丹化學(xué)成分 .云南植物研究，2000，22（2）：214-218.【7】 張錦文，郭潔茹，唐菲，等.大接骨丹化學(xué)成分研究 .中藥材，2010，33（11）：1725-1727. 王燕燕，涂念，張勇慧，等.大接骨丹化學(xué)成分研究（）.中草藥，2009，40（10）：1551-1553. 張錦文，郭潔茹，唐菲，等.大接骨丹化學(xué)成分研究（）.中草藥，2011，42（1）：15-17. 王晶.大接骨丹免疫活性成分研究 .武漢：華中科技大學(xué)，2008：9-30. 涂念.大接骨丹免疫調(diào)節(jié)活性成分研究.武漢：華中科技大學(xué)，2009：7-35. 陳華棟，張錦文，張勇慧.大接骨丹干燥樹(shù)皮抗炎鎮(zhèn)痛活性有效部位篩選.海峽藥學(xué)，2012，24（2）：29-3