灰氈毛忍冬花蕾總RNA的不同提取方法比較畢業(yè)論文

1、目錄摘要 .1關鍵詞 .1引言. .21 材料與儀器.21.1 實驗材料.21.2 實驗試劑.21.3 實驗器材.22 總rna提取方法及電泳.32.1 sds法.32.2 ctab法.32.3 sds改進法.32.4 瓊脂糖凝膠電泳.42.4.1 瓊脂糖凝膠（25ml；0.8%）的制備.42.4.2 rna進行電泳.42.4.3 rna的od值測定.43 實驗結果與分析. 43.1 結果.43.2 分析.44 討論.55 參考文獻.5灰氈毛忍冬花蕾總rna的不同提取方法比較 摘要：目的：通過比較三種不同的rna提取方法提取灰氈毛忍冬花蕾總rna，選取最佳提取方法提取高質量總rna,以滿足后續(xù)

2、基因克隆實驗。方法：以灰氈毛忍冬花蕾為實驗材料，分別采用sds法、ctab法、sds改進法提取總rna，并采用紫外及瓊脂糖凝膠電泳的方法進行檢測rna純度及完整性。結果：sds改進法提取效果最佳，od值最接近標準，電泳條帶清晰，sds法od值偏小，rna條帶清晰，ctab法提取的總rna出現(xiàn)降解現(xiàn)象。結論：這三種方法的提取結果不能滿足灰氈毛忍冬花蕾總rna的后續(xù)試驗。關鍵詞：灰氈毛忍冬； 花蕾； 總rna； sds法； ctab法； lonicera macranthoides hand.-mazz.buds of honeysuckle comparing different extract

3、ing method of total rnaabstract objective： by comparing three different types of rna extraction method to extract lonicera macranthoides hand.-mazz. total rna, selecting the best extraction method to extract high quality total rna and subsequent gene cloning experiments. methods: lonicera macranthoi

4、des hand.-mazz.buds of honeysuckle as experimental material,the sds method, ctab method and sds were used respectively to improve method of extracting total rna, and adopts the method of uv and agarose gel electrophoresis to detect rna purity and integrity. result: sds improved method of extracting

5、effect is best, od value closest to standard, electrophoresis stripe is clear, od value small sds method, rna the stripe is clear, ctab method to extract total rna degradation occurs. conclusion: the three methods of extraction result cant satisfy lonicera macranthoides hand.-mazz.buds of honeysuckl

6、e total rna of the follow-up test.key words flower bud； total rna； sds method； ctab method；引言： 灰氈毛忍冬（lonicera macranthoides hand.-mazz）系忍冬科（caprifoliaceae）忍冬屬（lonicera）植物，產安徽南部、浙江、江西、福建西北部、湖北西南部、湖南南部至西部、廣東(翁源)、廣西東北部、四川東南部及貴州東部和西北部，花蕾灰綠色或棕黃色，疏生氈毛1，別名山銀花，具有清熱解毒，疏散風熱的功效，用于癰腫療瘡，喉痹，丹毒，熱毒血痢，風熱感冒，溫熱發(fā)病等，也可作

7、為提取綠原酸或揮發(fā)油的原料，廣泛用于制藥、香料、化妝品、保健食品、保健飲料等領域，具有很高的經濟價值。國內近年來對于灰氈毛忍冬及其變異品種繁殖的相關研究越來越多，汪治等2詳細介紹了湘蕾金銀花的嫁接技術，繁殖方法和栽培管理技術；張雪等3對灰氈毛忍冬扦插繁殖過程中生營養(yǎng)物質含量變化進行了研究;稅丕先等4按照gap的要求對灰氈毛忍冬開展了規(guī)范化種植研究。從分子水平對其進行研究有李萍、蔡朝暉5用pcr分析技術應用5srrna基因間區(qū)序列變異對道地性金銀花和灰氈毛忍冬進行了研究初探， 結果表明lonicera屬植物5srrna基因間區(qū)約210 bp，其中g十c含量較高，達70左右，不同居群金銀花或山銀花

8、堿基序列有差別，存在遺傳差異；汪治等6對灰氈毛忍冬的染色體和核型進行了分析；李俊彬，王曉明7開展過灰氈毛忍冬dna不同提取方法的比較實驗；周日寶、王珊等8-9對灰氈毛的種質資源進行了issr分析；陳大霞等10以15個不同來源地的野生灰氈毛忍冬及2個花蕾型栽培品種為實驗材料，通過srap分析，揭示出灰氈毛忍冬存在著豐富的遺傳多樣性。但在灰氈毛忍冬dna序列測定及序列分析方面國內外還沒有相關報道。為使灰氈毛忍冬更好的得到開發(fā)和利用，以花蕾為實驗材料，比較了花蕾總rna提取的不同方法。1 材料與儀器1.1 實驗材料 本次試驗采用的樣品為2012年采摘于湖南省隆回縣金銀花栽培基地，由湖南中醫(yī)藥大學周日

9、寶教授鑒定為忍冬科忍冬屬植物灰氈毛忍冬。 1.2 實驗試劑 液氮; -巰基乙醇; 無水乙醇; 3mol/l的kac; 氯仿; 水飽和酚; 異丙醇; depc處理水; 75%乙醇; licl; 苯酚; sste溶液（100ml需nacl 5.844g; 5%sds 10ml; 1m tris-hcl（ph=8.0）1ml; 0.25m edta（ph=8.0） 400l); 2%sds提取液（100ml需sds 2g; pvp 2g; 1m tris-hcl（ph=8.0）10ml; 0.25m edta （ph=8.0）10ml ); ctab提取液（10ml需ctab 0.2g; nacl

10、2.3376g; 0.25m edta（ph=8.0）2ml; 1m tris-hcl（ph=8.0）2ml); 5tbe（1000ml需tris堿54g; 硼酸2.75g; 0.25m edta（ph=8.0）4ml; 超純水定容至1000ml） 1.3 實驗器材 2.0ml離心管; tip頭; 移液槍; 冷凍離心機; 研缽; 鑷子; 螺口小白瓶; 立式壓力蒸汽滅菌器; 量筒; 燒杯; 橡膠手套; 天平; 核算蛋白測定儀; 電泳儀; 微波爐; 超聲波清洗器; 口罩. 2 總rna提取方法及電泳2.1 sds法 本方法是參照王暑輝11的sds法進行提取。步驟如下： 稱取花蕾樣品0.15g，在液

11、氮中迅速研磨成粉末狀，迅速轉移至2.0ml離心管中；向上述離心管中加入600l sds提取液和40l -巰基乙醇，混合均勻，加入150ul無水乙醇和150l 3mol/l的kac，混合均勻；4，1.2萬r/min下離心15min，取上清液；加入250l 水飽和酚和250l 氯仿，混合均勻，冰上放置10min；4，1.2萬r/min下離心15min，取上清液；加入等體積的氯仿，混合均勻，冰上放置10min，4，1.2萬r/min下離心15min，取上清液；加入等體積的異丙醇，混合均勻，冰上放置10min，4，1.2萬r/min下離心15min；棄上清，加入75%乙醇1ml，溫和洗滌沉淀，4，1.

12、2萬r/min下離心15min，棄上清；干燥后，用50l depc處理水溶解rna，電泳，測od值。2.2 ctab法 在2.0ml離心管中加入600l 2ctab提取液和15l -巰基乙醇，65水浴15min；取樣品0.2g左右，在液氮中研磨成粉末，迅速轉移至上述離心管中；室溫下1.2萬r/min離心10min，吸取上清液于離心管中，每管中加入等體積氯仿，混合均勻，室溫下1.2萬r/min離心10min；吸取上清液于新離心管中，加入1/4體積的8mol/l的licl，混勻，4沉淀過夜；4，1.2萬r/min離心15min，收集沉淀，用500l sste溶解沉淀，洗去dna及其他雜質；加入等體

13、積的酚/氯仿（1:1），漩渦混勻，1.2萬r/min，4離心10min，再加入等體積的酚/氯仿（1:1），漩渦混勻，同樣條件下離心，洗去上清，加入1/10體積的3mol/l的nacl和2倍體積的無水乙醇，混勻，-70沉淀30min；4，1.2萬r/min離心20min，棄上清，用200l 70%乙醇洗滌沉淀，晾干，溶于50ldepc處理水中。2.3 sds改進法 （本方法采用了sds法與試劑盒的結合，以sds法為主，利用了試劑盒rk 145的去蛋白液、漂洗液、rnase-free dd h2o及吸附柱。）取樣品0.15g，將樣品在液氮中迅速研磨成粉末，迅速轉移至1.5ml離心管中，迅速加入10

14、00l sds提取液和40l -巰基乙醇，混勻后，再加入150l無水乙醇和150l 3mol/l的kac，混勻，在4，1.2萬r/min離心15min，取上清液；加入250l水飽和酚和250l 氯仿，混勻，冰上放置10min，4，1.2萬r/min離心15min，取上清；裝在新的離心管中，加入等體積的氯仿，裝入吸附柱cr3中，4，1.2萬r/min離心30s，棄掉收集管中的廢液，向吸附柱cr3中加入500l去蛋白液rd，4，1.2萬r/min離心30s，棄廢液，再向吸附柱cr3中加入600ul漂洗液rw，室溫靜置2min，4，1.2萬r/min離心30s，棄廢液；向吸附柱cr3中加入500l

15、，4，1.2萬r/min離心30s，棄廢液，將吸附柱放入2ml收集管中，4，1.2萬r/min離心2min，去殘余液體，離心后將吸附柱cr3在室溫下靜置片刻，充分晾干；在放入新的離心管中，加入50l rnase-free dd h2o，室溫放置2min，4，1.2萬r/min離心2min，-80保存。2.4 瓊脂糖凝膠電泳2.4.1 瓊脂糖凝膠（25ml；0.8%）的制備取0.24g瓊脂糖粉加入裝有25ml 0.5tbe緩沖液的100ml錐形瓶，在微波爐中加熱至沸騰，立即取出錐形瓶，邊振搖變冷卻至50-60，再放入微波爐中加熱，重復以上操作，直至瓊脂糖完全溶解，加入12.5l 10g/ml的e

16、b，使其終濃度為0.5g/ml，充分混勻，鋪板，冷卻。2.4.2 rna進行電泳取上樣緩沖液1l和提取的rna 5l ，在塑料手套上用移液混勻，在將上樣液垂直加入到點樣孔，記錄加入順序；調整電壓至100v，時間為30min，使rna由負極向正極電泳；結束后，取出樣板，在紫外透射檢測儀上觀察結果。 2.4.3 rna的od值測定將產物用depc處理水稀釋50倍，在核算蛋白測定儀上檢測rna的od值，結果見表1。 3 試驗結果與分析3.1 結果表1：rna核酸蛋白測定值od260/280od260/230c（g/ml）sds法0.721.16617.8ctab法1.64待添加的隱藏文字內容22.2

17、5682.9sds改進法1.501.58307.6 圖1：三種不同方法提取總rna的電泳圖，其中條帶為ctab法提取結果，條帶為sds法提取結果，條帶為sds改進法提取結果。3.2 分析： rna提取以od260/230大于2.0，od260/280為1.8-2.0為佳，od260/2302.0,為異硫氰酸胍或-巰基乙醇殘留；od260/2801.8，為蛋白質及酚污染；od260/2802.0，說明rna有降解，完整性被破壞。 通過分析以上實驗結果，sds改進法提取效果為最好，進行電泳檢測，rna 18s與28s較為清晰，但od260/2801.8,說明蛋白質或酚等出去不夠完全；ctab法提取

18、的rna進行核酸蛋白測定，od260/230偏大，sds法提取結果中，od260/230偏小。綜上所述，三種方法的提取結果均未達到要求的標準，不能滿足灰氈毛忍冬的后續(xù)實驗。4 討論大量研究表明，從不同植物品種、組織器官中提取高質量rna難度迥異，這主要與植物細胞中含的一些成分有關，如酚類化合物、多糖、次級代謝產物以及降解rna的rnase等12-15。在完整的細胞內，這些物質與核酸是分離的，一旦細胞碎裂，即與rna相互作用，影響高質量rna的提取16-18。所以在rna提取的整個過程中，除了保證環(huán)境的干凈，操作過程中不要引入雜質及細菌外，最重要的是要除凈細胞里的多糖、蛋白質及dna等雜質，以及

19、不要殘留提取過程中所加入的試劑。對于多糖，因為其許多理化性質與rna相似，因此沉淀rna時往往產生多糖的凝膠狀沉淀，這種沉淀難溶于水，或溶解后產生粘稠狀的溶液而難以取樣，且多糖的存在還會抑制許多酶的活性19 -20，目前，除出多糖的方法主要有高鹽法21、低濃度乙醇沉淀法22和醋酸鉀沉淀法23，而本次實驗采用1/4體積3mol/l的kac與1/4體積的無水乙醇，取得的效果還是比較好的。對于蛋白質，細胞內大部分rna均與蛋白質結合在一起，并且多以核蛋白的形式存在。因此，分離制備rna時，首先遇到的是必須使rna與蛋白解離，并除去蛋白質。由于rna的種類來源和存在形式不同，所用的制備方法各異，一般常

20、用的方法有，鹽酸胍法，去污劑法和苯酚法。在此次試驗中，sds法的提取效果較為理想，但是仍不能消除蛋白質的污染，所以對于上述方法有必要進行進一步實驗。而核酸的分離，可用水飽和酚。在酸性環(huán)境中，dna溶于酚相，rna溶于水相，可用于分離dna與rna。5 參考文獻1 藥典編者委員會，2010版中華人民共和國藥典m.中國醫(yī)藥科技出版社，28-29.2 汪治，黃云.湘蕾金銀花的栽培試驗j.湖南中醫(yī)藥導報，2004,10（11）：46-47. 3 zhang x, li l,yang x. nutrient change in lonicera macranthoides during cutting

21、propagation processj. zhongguo zhong yao za zhi,2010,35(11):1378-1381. 4 稅丕先，張世波.灰氈毛忍冬規(guī)范化種植研究j.時珍國醫(yī)國藥，2008,19（3）：626-627.5 李萍，蔡朝暉. 5srrna基因間區(qū)序列變異用于金銀花藥材道地性研究初探j.中草藥，2001，32（9）：834-837.6 汪治，梅樹模，鄭麗，等. 灰氈毛忍冬的染色體及核型分析j.時珍國醫(yī)國藥，2008，19（8）：18701871.7 李俊彬，王曉明. 灰氈毛忍冬dna不同提取方法的比較實驗j.湖南林業(yè)科技，2008，35（2）：1516. 8

22、周日寶，王珊，潘清平，等.灰氈毛忍冬issr擴增的反應體系和擴增程序研究j.中國藥房，2009，20（33）：2626-2628. 9 王珊，周日寶，潘清平，等.灰氈毛忍冬種質資源遺傳多樣性的issr分析j.藥物生物技術,2009,16(2):149-152. 10 陳大霞，李隆云. 灰氈毛忍冬自然群體遺傳多樣性的srap研究j.中草藥，2011,42（1）：143-147.11 王暑輝，徐倩. 富含多糖多酚的側柏葉片總rna提取方法j.北京林業(yè)大學生命科學與技術學院，2012,34（1）：76-80,8912 waish .t.a ， morgan.a.e，hey.t.d jbiochem，

23、 1991，266 ：2342223427.13 金宇，王曉杰，韓青梅，等. 條銹菌誘導下的小麥葉片總rna提取方法的比較及l(fā)d-pcr擴增j. 麥類作物學報，2007,27（3）：471-474.14 金麗娜，姜述君，戴凌燕，等水稻抑制差減雜交技術中葉片總rna提取方法的探討j 黑龍江八一農墾大學學報，2009，21(1)：4-7.15 謝傳勝，宋國琦，王興軍，等擬南芥和煙草幼嫩種子rna 不同提取方法的比較j.2009，25(23)：78-81.16 蘇丹，耿廣東，張素勤，等辣椒不同組織總rna 提取方法的比較j. 江蘇農業(yè)科學，2010(2)：21-22 .17 姚世響，谷麗麗，張霞，等灰綠藜rna