實(shí)驗(yàn)三 海洋動(dòng)物目的基因的發(fā)育

1、一、目的要求一、目的要求 掌握掌握RNA原位雜交的原理原位雜交的原理; 熟悉胚胎整體原位雜交操作技術(shù)；熟悉胚胎整體原位雜交操作技術(shù)； 加深對(duì)發(fā)育過程中基因表達(dá)時(shí)空特性的理解加深對(duì)發(fā)育過程中基因表達(dá)時(shí)空特性的理解 實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)三 海洋動(dòng)物目的基因的發(fā)育表達(dá)圖式海洋動(dòng)物目的基因的發(fā)育表達(dá)圖式 二、原位雜交技術(shù)原理二、原位雜交技術(shù)原理 定義：定義：是一種應(yīng)用標(biāo)記探針與胚胎或組織細(xì)胞中的待測(cè)是一種應(yīng)用標(biāo)記探針與胚胎或組織細(xì)胞中的待測(cè) 核酸雜交（堿基配對(duì)），再應(yīng)用標(biāo)記物相關(guān)的檢測(cè)系核酸雜交（堿基配對(duì)），再應(yīng)用標(biāo)記物相關(guān)的檢測(cè)系 統(tǒng)，在核酸原有的位置將其顯示出來的一種檢測(cè)技術(shù)統(tǒng)，在核酸原有的位置將其顯示出來

2、的一種檢測(cè)技術(shù) 整體原位雜交（Whole-mount in situ hybridization）：）： 將目的基因的探針與胚胎整體進(jìn)行雜交的方法 帶有標(biāo)記物的已知序帶有標(biāo)記物的已知序 列的核酸片段列的核酸片段 地高辛（地高辛（DIG）標(biāo)記的）標(biāo)記的UTP ALP標(biāo)記的標(biāo)記的Anti-DIG抗體抗體 ALP 堿性磷酸酶顯色堿性磷酸酶顯色 DIG Anti-DIG抗體抗體 ALP ALP底物底物 RNA原位雜交原理：主要是利用堿基互補(bǔ)原理，將體外合成 的帶有標(biāo)記的單鏈反義RNA（RNA探針）與組織或細(xì)胞中待 測(cè)的mRNA發(fā)生雜交，從而將探針定位在靶基因的表達(dá)區(qū)域內(nèi)。 再通過顯色反應(yīng)，顯示其表達(dá)部

3、位。顯色反應(yīng)，顯示其表達(dá)部位。 標(biāo)記物的種類分為2種，即 非放射性的標(biāo)記物（地高辛 (DIG)和生物素(BIO)）或帶 有放射性的同位素(32P)。 探針間接標(biāo)記法探針間接標(biāo)記法 DIG標(biāo)記標(biāo)記 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：櫛孔扇貝胚胎和幼蟲實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：櫛孔扇貝胚胎和幼蟲 目的基因：目的基因：vasa基因基因 生殖細(xì)胞的標(biāo)記分子生殖細(xì)胞的標(biāo)記分子 三、實(shí)驗(yàn)材料三、實(shí)驗(yàn)材料 四、胚胎原位雜交的實(shí)驗(yàn)流程四、胚胎原位雜交的實(shí)驗(yàn)流程 RNA探針合成（以探針合成（以cDNAcDNA為模板，為模板， 通過體外轉(zhuǎn)錄獲得）通過體外轉(zhuǎn)錄獲得） 思考：如何確保探針特異性？思考：如何確保探針特異性？ 反義反義RNA探針探針 正義正義R

4、NA探針探針 Hind線性化質(zhì) 粒 1 gEcoR線性化質(zhì) 粒 1 g 10轉(zhuǎn)錄緩沖液2 l10轉(zhuǎn)錄緩沖液2 l 10NTP2 l10NTP2 l RNase抑制劑1 lRNase抑制劑1 l T7 RNA聚合酶2 lSP6 RNA聚合酶2 l DEPC處理水至20 lDEPC處理水至20 l 胚胎固定：胚胎固定：4多聚甲醛多聚甲醛(PBS配制配制)， 保存于保存于100%甲醇中（甲醇中（-20） 體外轉(zhuǎn)錄體外轉(zhuǎn)錄 帶有T7/SP6噬菌體 轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的載體 雜交流程（第一天）雜交流程（第一天） 胚胚 胎胎 預(yù)預(yù) 處處 理理 預(yù)雜交預(yù)雜交 雜交雜交 1. 復(fù)水：甲醇復(fù)水：甲醇/PBT (75/2

5、5.50/50.25/75) 各各5min 1ml PBT 2次次 各各5min 3.4%多聚甲醛后固定多聚甲醛后固定20min 1ml PBT，5次次 各各5min 無探針的雜交液，水浴鍋內(nèi)無探針的雜交液，水浴鍋內(nèi)60孵育孵育6h 含含變性探針變性探針的雜交液的雜交液100l，水浴鍋內(nèi)，水浴鍋內(nèi)60 過夜過夜 PBT/雜交液雜交液（1：1），），10 min (12-16 h)(12-16 h) 500 500 l TEA 2TEA 2次，次， 5 min/5 min/次次 1ml PBT 21ml PBT 2次，次，5 5 min/min/次次 2020 以上過程，為以上過程，為防止防止R

6、NA酶污染酶污染，操作時(shí)需戴手套和口罩。，操作時(shí)需戴手套和口罩。 試劑和容器處理：試劑和容器處理：DEPC（焦碳酸二乙酯）或（焦碳酸二乙酯）或180 復(fù)水、消化、后固定復(fù)水、消化、后固定雜交、預(yù)雜交雜交、預(yù)雜交 抗抗 體體 孵孵 育育 和和 顯顯 色色 洗脫洗脫 觀察觀察 雜交流程（第二天）雜交流程（第二天） 3.顯色：顯色：AP buffer洗洗 2次次,各各5min 0.5ml顯色液避光顯顯色液避光顯色色(室溫室溫 30 min 2 h)；4過夜過夜)，得得 到合適雜交信號(hào)后到合適雜交信號(hào)后PBT洗洗2次次 中止反應(yīng)中止反應(yīng) 2. 孵育：孵育：0.5ml含稀釋含稀釋2000 倍倍 抗體的封

7、閉液抗體的封閉液2h 洗脫緩沖液洗洗脫緩沖液洗2次次 再洗再洗6次次 1.封閉封閉: 0.5ml 封閉液封閉液1h 胚胎置于胚胎置于80 % 甘油中，顯微鏡下觀察甘油中，顯微鏡下觀察 60預(yù)熱洗脫液預(yù)熱洗脫液 1-3 各洗各洗1次，各次，各20min 60預(yù)熱洗脫液預(yù)熱洗脫液 4洗洗1次，次， 洗洗30min 胚胎預(yù)處理胚胎預(yù)處理 預(yù)雜交和雜交預(yù)雜交和雜交 洗脫和抗體孵育洗脫和抗體孵育 顯色和觀察顯色和觀察 實(shí)驗(yàn)主要階段實(shí)驗(yàn)主要階段 思考：各關(guān)鍵步驟的目的和原理，思考：各關(guān)鍵步驟的目的和原理， 如何確定最佳條件如何確定最佳條件 原位雜交流程 - 1 1）取存于100%甲醇的樣品置于梯度甲醇/P

8、BT（3/1; 1/1; 1/3）中依次復(fù)水， 1 ml/次, 10 min/次，使樣品完全沉于管底； 2）復(fù)水后用1 ml PBT洗2次；每次10 min； 3）500 l蛋白酶K（2 g/ml），37 水浴30 min（胚胎）或40 min（幼蟲）； 4）500 l TEA（0.1 M）處理2次，每次10 min； 5）1 ml PBT洗2次，每次10 min； 6）1 ml 4%聚甲醛后固定20 min； 7）1 ml PBT洗5次，每次10 min； 8）PBT/預(yù)雜交液（1：1）室溫10 min； 9）500 l預(yù)雜交液中于60水浴鍋中預(yù)雜交6 h（至少3 h）； 10） 200 l

9、 雜交液（含探針，工作濃度1 g/ ml ）， 60雜交過夜（一般不 少于16 h），注意使所有胚胎和幼蟲懸浮 原位雜交流程 - 2 11）60 洗脫（各1 ml）： Hybridization buffer/2SSC（1/1）洗20 min， Hybridization buffer/2SSC（1/3）洗20 min， 2SSC 2次，10 min/次， 1SSC 10 min， 0.2SSC+0.1%Tween-20 2次，30 min/次（可調(diào)）； 12）1 ml MaNaT室溫洗2次，每次10 min； 13）500 l Blocking Buffer室溫封閉1 h以上； 14）500

10、 l抗體孵育液（抗地高辛抗體加入Blocking Buffer 中，1：2000）中室溫孵育2 h（或4 過夜，16 h以內(nèi)）； 15）1 ml MaNaT室溫洗2次，每次10 min； 16）1 ml MaNaT室溫洗6次，每次15 min； 17）500 l AP buffer室溫洗2次，每次10 min； 原位雜交流程 - 3 18）20 l NBT/BCIP于1 ml AP buffer中避光顯色（室溫30 min1 h，4降低顯色速度）； 19）1 ml PBT洗2次終止顯色反應(yīng)，每次10 min； 20）1 ml 4%聚甲醛固定1 h； 21）1 ml PBT洗2次，每次10 min； 22）取適量胚胎放在80%甘油中于顯微鏡下觀察拍照。 23）剩余胚胎于1 ml梯度乙醇（50%、75%、95%和100%） 脫水各10 min，500 l二甲苯透明2次、各5 min，中性樹 脂封片，顯微鏡下觀察拍照。 作 業(yè) 電子版上交電子版上交vasavasa mRNA mRNA在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)育過程中的表達(dá)圖式；在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)育過程中的表達(dá)圖式； 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提出目的基因在實(shí)