cDNA第一鏈合成試劑盒

1、cDNA第一鏈合成試劑盒操作方法1、逆轉錄反應(1) 在無菌薄壁管中加入以下成份：Total RNA0.5-1.0 (dN)9 or oligo(dT) 18100pmol(2) 混勻后，70C變性5min,將薄壁管迅速置于冰上冷卻，然后依次加入以下成份：5X M-MLV Buffer4JdNTPs( 10mM each1dRNasi n10U100mM DTT2JM-MLV Reverse Tran scriptase100UDEPC-treated waterup to 20 d(3) 混勻后短暫離心，使用 oligo(dT)偲引物時在42C，使用隨機引物(dN)9 時在37C下溫育1小時

2、。(4) 94 C 5min終止反應后，冰上冷卻。(5) 合成的cDNA第一鏈可直接用于PCR擴增或進行其它下游操作。2、PCRT 增(1)在PCR薄壁管中加入以下試劑Sy nthesized cDNA10X PCR BufferUpper primerLower primerdNTPs (10mM eachTaq DNA PolymeraseddHO(2)混勻后短暫離心，然后進行94C預變性2.5min。進入下列2-5 d2d10pmol10pmol0.5 d1.5Uup to 20 dPCR擴增。3040個循環(huán)(此擴增條件僅供參考)：94 C30s, 60 C 45s , 72 C 1mi

3、n 3min。最后 72 C 延伸 7min。注意事項1、確保RNA完整性及純度。RNA質量是決定合成cDNA第一鏈成功的關鍵因素， 其純度及完整性可由OD60/OD28。比值和進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。較純的 RNA 樣品OD60/OC280比值通常為1.8-2.0，若該比值偏低，應進一步純化。真核生物RNA羊品電泳圖譜28s和18s的比值約為2:1，否則，表明有RNAt解。2、 避免RNA酶污染。進行cDNA合成所用的器皿、試劑和溶液必須完全無菌。操 作過程始終戴手套以杜絕各種 RNA酶的污染。3、合成cDNA第一鏈的引物選擇。選擇 oligo(dT) 12-18作為反轉錄弓I物，可保證cD

4、NA具有完整的3-端，通?？傻玫浇咏L的 cDNA第一鏈；若選擇隨機 寡核苷酸(dN)6或(dN)9作為引物，弓I物在整個mRNA勺多個位點退火，產生短 的部分長度的cDNA第一鏈。這種方法經(jīng)常用于獲得5末端序列及從帶有二 級結構區(qū)域或帶有逆轉錄酶不能復制的終止位點的RNA模板獲得cDNA常見問題及參考意見1、cDNA產量很低，為什么？可能的原因：(1)RNA模板質量低；(2)對mRN濃度估計過高；(3)反應體系中存 在反轉錄酶抑制劑或反轉錄酶量不足；(4)反應體積過大，一般不應超過 50 d。2、合成不了長鏈的cDNA為什么？(1) RNA降解。對使用的器具、試劑用DEPC干熱或濕熱滅菌處理，以杜絕RNase 污染。同時，在逆轉錄反應中加入 RNase抑制劑。(2) 反應條件不合適。通過預實驗確定最合適的反應條件，包括酶量、鹽濃度、反應溫度(3756C)、DTT濃度(0.510mM。(3) RNA 結構問題。提高逆轉錄反應溫度，或