裸鼠前列腺原位腫瘤模型的建立

1、裸鼠前列腺原位腫瘤模型的建立 作者：羅勇，張林琳，賀大林，李翔，寧亮，侯惠蓮 【關(guān)鍵詞】 ,前列腺癌 establishment of prostate cancer model by orthotopic injection of human prostate cancer cell line du145 【abstract】 aim: to establish a prostate cancer orthotopic injection model in nude mice and to discuss its value of application. methods: lower ab

2、dominal incision was made in 10 male nude mice. after the bladder and prostate were exposed, du145（6106）was injected in ventral prostate lobes under the prostatic capsule by a tb syringe with a 29gauge needle at 50 l per mouse. the abdominal wall and skin were then closed with 70 surgical suture and

3、 the vital signs of the nude mice were observed. when the mice were dying, they were sacrificed. after the mouse was killed, the tissues of prostate, bladder, lymphatic node, lung and liver were taken out, fixed in 40 g/l formaldehyde, embedded in paraffin, stained by he and then observed microscopi

4、cally. the bone metastasis was observed by xray. results: the incidence of primary tumor after intraprostatic injection was 60%（6 of 10）. about 14 d later, there were small palpable nodes in prostate and about 19 d later, cachexia occurred in nude mice. after dissection, it was shown that the diamet

5、er of primary tumors varied from 0.8 cm to 1.5 cm and the envelope of the liver became crimpy. acute hepatitis could be observed under microscopy, which represented a large scale of hepatocyte death, liver sinus dilatation and hyperemia, hepatic lobule infiltrated by lymphocyte and macrophage and in

6、conspicuous hyperplasia. conclusion: the orthotopic injection model is an optimal animal model to study the occurrence and development of prostate cancer. it mimics the natural situation of human prostate cancer and will help to understand the mechanisms of androgenindependence and osseous metastasi

7、s and tumorhost determinants of prostate specific antigen (psa) expression. 【keywords】 prostate neoplasms; orthotopic injection; metastasis; nude mice 【摘要】 目的： 建立一種裸鼠前列腺癌原位模型. 方法： 在10只裸鼠下腹部切口，顯露膀胱和前列腺，用1 ml tb針筒、29g針頭在其前列腺左右腹側(cè)葉包膜下接種人前列腺癌du145細(xì)胞50 l，共計(jì)6106個(gè)，以建立原位腫瘤模型，觀察裸小鼠生命體征變化. 于瀕死狀態(tài)下處死，并取原位腫瘤、膀胱、盆

8、腔淋巴結(jié)、肺臟和肝臟標(biāo)本，用40 g/l甲醛固定、石蠟包埋和he染色后顯微鏡下觀察，x線照射顯示骨骼轉(zhuǎn)移情況. 結(jié)果：10只裸鼠中有6只模型建立成功. 接種后14 d左右，可觸及前列腺部位有黃豆大小的包塊，質(zhì)硬. 19 d后出現(xiàn)惡液質(zhì)，解剖后發(fā)現(xiàn)前列腺部位有包塊生長(zhǎng)，直徑約在0.81.5 cm，其中2例侵及膀胱. 肝臟泛黃、被膜皺縮，鏡下呈急性重型肝炎的病理改變. 結(jié)論： 小鼠前列腺原位移植瘤模型建立成功. 【關(guān)鍵詞】 前列腺癌；原位注射；轉(zhuǎn)移；裸鼠 0引言 前列腺癌初診時(shí)大約30%50%的患者已發(fā)生轉(zhuǎn)移1，而目前針對(duì)前列腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制及有效的治療措施研究較少，一個(gè)重要原因是缺乏合適的動(dòng)

9、物模型. 為了建立一種更接近于人類腫瘤體內(nèi)自然生長(zhǎng)過程的前列腺癌動(dòng)物模型，我們通過原位注射人前列腺癌細(xì)胞du145技術(shù)建立起balb/c裸鼠的前列腺癌原位種植瘤模型如下. 1材料和方法 1.1材料 雄性balb/c裸鼠10只，6 wk齡，體質(zhì)量20 g左右，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供. 均在spf條件下層流架內(nèi)飼料飲水自由攝入. du145細(xì)胞系由美國(guó)chung lw惠贈(zèng). 用含100 ml/l胎牛血清（杭州四季青公司）的rpmi 1640培養(yǎng)液（美國(guó)gibco公司）在37，50 ml/l co2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)，以1.25 g/l胰酶和0.2 g/l edta的混合液消化傳代. 1.2方法

10、裸鼠用10 g/l戊巴比妥鈉（75 mg/kg）麻醉，仰臥位，膠帶固定四肢，下腹部正中橫切口1 cm，暴露膀胱和精囊腺，用棉簽輕壓膀胱頂壁、腹側(cè)壁，并向下游離至膀胱頸，推開肌肉及生殖腺進(jìn)一步暴露前列腺，可見其大小約1.0 mm1.5 mm2.0 mm，分左右2葉，呈粉紅色，有明顯的腺體組織特征. 用1 ml tb針筒、29g針頭輕輕挑起一側(cè)前列腺包膜，緩慢進(jìn)針，直至頂起對(duì)側(cè)包膜，明確針尖進(jìn)入包膜后，再緩慢推注du145細(xì)胞懸液50 l（6106個(gè)），以包膜向上鼓起，脫離腺體表面為滿意標(biāo)準(zhǔn). 恢復(fù)臟器的解剖位置，用70可吸收線分別間斷縫合腹壁肌肉層和皮膚層，待鼠蘇醒后回籠. 以裸鼠出現(xiàn)惡液質(zhì)、處

11、于瀕死狀態(tài)作為觀察終點(diǎn)，頸椎脫臼法處死. 尸解并觀察荷瘤部位腫瘤的生長(zhǎng)情況. 裸鼠處死后，立即在100 ma，40 kv，5.23 ms條件下行x線檢查. 裸鼠與球管距離為1.0 m；然后取前列腺、膀胱、盆腔淋巴結(jié)、肝臟和肺臟標(biāo)本，40 g/l甲醛固定、石蠟薄層切片4 m，he染色后光鏡下觀察有無轉(zhuǎn)移灶. 2結(jié)果 2.1腫瘤模型的建立裸鼠注射后14 d可于下腹前列腺部觸及結(jié)節(jié)，黃豆大小、表面光滑、質(zhì)硬、活動(dòng)度差. 19 d出現(xiàn)惡液質(zhì)，解剖后發(fā)現(xiàn)6只裸鼠前列腺部位有包塊形成，直徑0.81.5 cm. 病理證實(shí)原位移植瘤模型建立成功. 2.2侵襲和轉(zhuǎn)移前列腺部位包塊呈結(jié)節(jié)狀、質(zhì)硬，與周圍精囊腺、輸

12、精管、膀胱及腸管黏連. 肝臟有明顯的肉眼病變，體積縮小、顏色泛黃、表面被膜皺縮、遍布黃色斑點(diǎn)狀病變. 2只裸鼠前列腺原位腫瘤侵及膀胱（fig 1），病理檢查未見肝、肺、盆腔淋巴結(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移灶；x線也未發(fā)現(xiàn)骨骼病變. 2.3he染色結(jié)果前列腺組織內(nèi)有成群密集的未分化上皮細(xì)胞，細(xì)胞排列紊亂，有豐富的、泡沫樣的嗜酸細(xì)胞象，異形性明顯，核大深染，核內(nèi)有多形的、數(shù)目不均的染色質(zhì)（fig 2），有巨核細(xì)胞，間質(zhì)成分少，瘤體中間無壞死，僅見極少腺樣結(jié)構(gòu)；肝臟呈急性重型肝炎表現(xiàn)，鏡下可見：肝細(xì)胞彌漫性的大片壞死，以小葉中央最為明顯，肝竇擴(kuò)張充血，小葉內(nèi)有淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，小葉增生不明顯. 3

13、討論 人前列腺癌動(dòng)物模型是研究前列腺癌發(fā)病機(jī)制、腫瘤與宿主關(guān)系、癌腫侵襲與轉(zhuǎn)移過程和治療措施有效性不可缺少的理想實(shí)驗(yàn)工具，因此，建立理想的前列腺癌動(dòng)物模型應(yīng)能最大程度地模擬人類前列腺癌的發(fā)生過程并具備以下特點(diǎn)2:人源性腫瘤,可分泌前列腺特異性抗原(psa)；腫瘤特性與人類前列腺癌相似；對(duì)激素的治療反應(yīng)與人前列腺癌相似. 裸鼠因其免疫缺陷特性成為建立人類腫瘤動(dòng)物模型的最佳載體. 以往制作前列腺癌裸鼠模型時(shí)多選擇皮下作為荷瘤部位，接種方便、易于觀察，但是根據(jù)paget3的“種子與土壤”（seed and soil）學(xué)說，腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于一個(gè)合適的微環(huán)境，因此原位種植較皮下接種具有更高的致瘤率

14、和轉(zhuǎn)移機(jī)率，且皮下移植瘤模型并不能很好地模擬前列腺癌在人體內(nèi)的自然生長(zhǎng)過程以及許多生物學(xué)行為，而原位種植不僅使腫瘤細(xì)胞獲得了更接近人體內(nèi)的生長(zhǎng)微環(huán)境，而且其中豐富的內(nèi)源性生長(zhǎng)因子，能夠提高移植成功率，并形成與臨床相似的轉(zhuǎn)移模式. sato等4對(duì)比前列腺癌lncap細(xì)胞懸液分別作scid鼠皮下和原位種植后的情況，結(jié)果皮下組中100%成瘤，無一發(fā)生淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；原位組中89%成瘤，但全部發(fā)生腹膜后和縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，40%發(fā)現(xiàn)有鏡下肺轉(zhuǎn)移. rembrink等5和wang等6用前列腺癌pc3，pc31251l，tsupr1和lncap細(xì)胞作裸鼠的原位種植模型，致瘤率高,淋巴結(jié)、肺部轉(zhuǎn)移率極高.

15、由于裸鼠前列腺非常?。s50 mg），因此進(jìn)行腫瘤細(xì)胞注射需要特別精細(xì)的操作. 而且，注入腫瘤細(xì)胞后10180 min，即使沒有直接刺入血管，也容易產(chǎn)生自發(fā)的淋巴道和血道轉(zhuǎn)移而造成人為的播散. 我們進(jìn)行了多次預(yù)試驗(yàn)，最終達(dá)到了包膜向上鼓起，脫離腺體表面的要求5，最終成瘤率為60，與國(guó)內(nèi)王鵬飛等7的結(jié)果相似. 我們還觀察到，所有小鼠術(shù)后均發(fā)生急性重癥肝炎，其性質(zhì)可能是一種自身免疫性急性重癥肝炎（aih）. 目前aih的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但有研究表明藥物、環(huán)境和病毒感染可能是aih的促發(fā)因素. 由于小鼠過早出現(xiàn)肝衰竭，因此本組模型中未能觀察到肺轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和骨轉(zhuǎn)移. 另外，種植組織學(xué)完整的瘤塊

16、比腫瘤細(xì)胞懸液的成瘤率和轉(zhuǎn)移率更高8，但對(duì)顯微器械和操作精細(xì)程度的要求更高. 因此，原位注射腫瘤細(xì)胞逐漸成為當(dāng)前的主流技術(shù). 此外，成熟的建模技術(shù)有助于“培育”出生物學(xué)特性更接近臨床實(shí)際的新細(xì)胞株. 例如，絕大多數(shù)前列腺癌細(xì)胞株不能分泌psa，不利于腫瘤模型的監(jiān)測(cè)，lncap雖能分泌psa，卻屬于一種雄激素依賴型細(xì)胞株，限制了它在雄激素非依賴型前列腺癌中的研究應(yīng)用. thalmann 等9，10利用lncap建立不同的免疫缺陷動(dòng)物模型，培育了一系列亞細(xì)胞系，既保留了psa的分泌特性，又對(duì)雄激素非依賴，惡性度更高. 利用這些亞細(xì)胞系在裸鼠身上分別皮下和前列腺原位接種，均建立了較lncap細(xì)胞更具

17、致瘤能力和骨轉(zhuǎn)移潛能的動(dòng)物模型. harper等11 利用ten12在不同條件下造模后，也成功地培育了兩種新的細(xì)胞亞系ten12f和ten12c，為在分子水平解釋人前列腺癌從雄激素依賴型向非依賴型轉(zhuǎn)變的機(jī)制創(chuàng)造了條件. 【參考文獻(xiàn)】 1 stamey ta, mc neal je. adenocarcinoma of the prostate a. in: walsh pc, reik ab, stamey ta, et al. campbells urology m. 6th ed. philadelphia: wb. saunders company, 1992: 1185. 2 bast

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