楮實提取物體外抗氧化活性的研究

1、DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減楮實提取物體外抗氧化活性的研究（作者：單位：郵編：）作者：吳蘭芳張振東景永帥楊娟【摘要】目的探討楮實提取物的體外抗氧化活性。方法先用80% 乙醇，然后用蒸餾水對楮實進(jìn)行提取。其中醇提取物依次用石油醚、 氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，水提部分經(jīng)醇沉、干燥后得到楮實粗 多糖。運(yùn)用羥基（OH）自由基體系、二苯代苦味基肼（DPPH ）自 由基體系和對Fe3+的還原能力實驗，比較楮實各提取物的抗氧化活 性。結(jié)果 楮實提取物對OH自由基和DPPH 自由基均有較好的清除 作用，其中總醇提取物對 OH自由基的清除能力最強(qiáng)，其IC50值為 0.28 mg/ml;乙酸乙酯提取物對

2、 DPPH 自由基的清除效果最好，其 IC50值達(dá)到0.08 mg/ml ;各提取物對Fe3+均有較強(qiáng)的還原能力，乙 酸乙酯提取物還原效果最為明顯。結(jié)論楮實提取物具有一定的抗氧化活性，在抗衰老方面有廣泛的應(yīng)用前景?！娟P(guān)鍵詞】 楮實；抗氧化活性；清除自由基；還原力【Abstract Objective To study the antioxidant activities ofextracts from Broussonetiapapyrifera in vitro. Methods B.papyrifera was treated with 80% etha nol and the n the

3、 residue was extracted with water. The etha nolextract were extractedrespectively by petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, n _buta nol. At the same time, crude polysaccharide was obta ined by etha nol precipitati on from water extract. The an tioxida nt activities of the above extracts in vitr

4、o were compared by the hydroxyl free radical ( OH), DPPH free radical (DPPH )and deoxidization Fe3+ reacti on system. Results The extracts from B. papyrifera had good scavenging effect on the hydroxyl free radical and DPPH free radical. Etha nol extract had the best scave nging effect on hydroxyl fr

5、ee radical system, which corresponding IC50 value was 0.28 mg/ml. Ethyl acetate extacts had the best scavenging effect on DPPH free radical, which corresponding IC50 value reached to 0.08 mg/ml. All of the extracts had strong deoxidization ability of Fe3+. Among of them, ethyl acetate extracts had s

6、ignificant deoxidizati on ability. Con clusi ons Brouss on etia papyrifera has stronger antioxidant activities and will be widely applicated on anti Jaging.【Key words Broussonetia papyrifera; Antioxidant activity;Radical scave nging; Deoxidizati on楮實子具有活血理氣、補(bǔ)腎清肝、明目、利尿的功效，多用于 腰膝酸軟、虛勞骨蒸、頭暈?zāi)垦?、目生翳膜、水腫脹滿

7、等癥1，2。一些含楮實子的經(jīng)典方藥經(jīng)多年臨床驗證具有確切的抗衰老、促智作用3。機(jī)體內(nèi)氧化自由基增加是導(dǎo)致衰老的主要原因，清除自由基可起到延年益壽的作用4。近年來研究發(fā)現(xiàn)楮實子油及楮實子黃酮 成分有顯著的抗氧化和清除及抑制氧自由基作用5；楮實子紅色素能顯著清除超氧陰離子及羥基（OH）自由基，抑制H2O2誘導(dǎo)小鼠紅 細(xì)胞溶血和肝勻漿自氧化，對肝線粒體也有保護(hù)作用6。但目前還 未見到對楮實聚花果進(jìn)行抗氧化活性評價的報道。本實驗運(yùn)用水楊酸法、二苯代苦味基肼自由基（DPPH ）法、Fe3+還原能力的方法對楮實 不同極性溶劑提取物體外抗氧化能力進(jìn)行評價，為楮實更廣泛地應(yīng)用 于醫(yī)藥和開發(fā)新型保健品提供理論依

8、據(jù)。1材料與方法1.1材料與試劑藥材于2009年7月采自貴州省貴陽市藥用植物園，經(jīng)貴陽中 醫(yī)學(xué)院孫慶文老師鑒定為構(gòu)樹Broussonetia papyrifera（L.）Vent. 的成熟果實。DPPH （百靈威公司）；抗壞血酸（Vc）、無水乙醇、H2O2、 水楊酸、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀、三氯化鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、 三氟乙酸均為國產(chǎn)分析純試劑，乙醇為食用級。1.2儀器與設(shè)備HP8453型紫外可見分光光度計（惠普公司）；JA2003精密電子 天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）；DK 911電熱恒溫水浴鍋（天津 市泰斯特儀器有限公司）。1.3提取與制備楮實干燥粉碎，80%乙醇回流提取5次，每次

9、回流2 h，乙醇 提取液減壓濃縮至無醇味，得楮實總醇提物。取適量醇提物用水混懸 后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，各萃取液及萃取后 的水層部分減壓濃縮至固體，真空干燥后得石油醚提取物、氯仿提取 物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物及水層部分，作為待測樣品置于 干燥器中保存。將乙醇浸提后的藥材殘渣在室溫下?lián)]去乙醇，加入蒸餾水，沸水浴提取5次，每次2h。合并水提液減壓濃縮至一定體積，加入乙醇沉 淀多糖，乙醇最終濃度80%，沉淀真空干燥后即為楮實水提粗多糖， 作為待測樣品置干燥器中保存?zhèn)溆谩?.4抗氧化活性測定1.4.1清除OH自由基7采用Fenton反應(yīng)，利用H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生OH自

10、由基， 在該體系中加入水楊酸捕捉 OH自由基并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在 510 nm處有最大吸收。取各萃取物 50 mg，用無水乙醇溶解并定容 至25 ml ;取粗多糖50 mg用蒸餾水溶解，定容至25 ml，配制得2 mg/ml的各樣品質(zhì)量濃度，再以該質(zhì)量濃度配制成所需濃度。依次加 入樣品 4 ml ,9 mmol/L FeSO4 0.5 ml ，9 mmol/L 水楊酸 0.5 ml，8.8 mmol/L H2O2 0.5 ml。該體系于37 C水浴中加熱30 min，于510 nm 處測定樣品吸光度（Ai）。用4 ml蒸餾水代替體系中的樣品，測定得 空白吸光度（A0）。向體系中加入蒸餾水

11、0.5 ml代替8.8 mmol/L H2O2，測定樣品本底吸光度（Aj）。每個質(zhì)量濃度樣品做3個平行，取其平均值，以Vc作陽性對照，按下式計算清除率：K(%)=AO-(Ai-Aj)/AO X100。142清除DPPH 自由基8DPPH 自由基是一種穩(wěn)定的自由基，在有機(jī)溶劑中呈紫色，在517 nm波長有較大吸收，當(dāng)加入抗氧化劑一部分自由基被清除，使 得在該波長下吸收減弱，可借此來評價物質(zhì)的抗氧化活性。取各萃取 物50 mg，用無水乙醇溶解并定容至25 ml ;取粗多糖50 mg，用蒸 餾水溶解并定容至25 ml，配制得2 mg/ml的各樣品質(zhì)量濃度，再以 該質(zhì)量濃度配制成所需濃度；以無水乙醇配

12、制0.16 mmol/L DPPH 溶 液，避光保存。取3 ml待測樣品溶液加入3 ml DPPH 溶液于25 C 水浴中加熱15 min，在517 nm測得試樣吸光度(Ai)。取3 ml蒸餾 水代替樣品測得空白吸光度(A0)。向3 ml樣品中加入3 ml蒸餾水 測得樣品本底吸光度(Aj)，每個質(zhì)量濃度樣品做3個平行，取平均 值。以Vc作陽性對照，按下式計算清除率：K(%)=A0-(Ai-Aj)/A0 X100。143 Fe3+還原能力測定9取2.5 ml不同質(zhì)量濃度的樣品乙醇溶液，加入 0.2 mol/L磷酸 緩沖液2.5 ml及1%鐵氰化鉀2.5 ml，50 C水浴反應(yīng)20 min后急速

13、冷卻，加入10%三氟乙酸溶液2.5 ml混勻，4 000 r/min離心10 min， 取上清液5 ml，加入4 ml蒸餾水及0.1% FeCI3 1 ml，10 min后于 700 nm處測定吸光值。以Vc作為陽性對照。2結(jié)果2.1對OH自由基的清除作用由圖1可以看出，大部分提取物對 OH自由基都表現(xiàn)出一定程 度的清除能力，并在實驗濃度范圍內(nèi)呈明顯的量效關(guān)系，但各部分提取物的清除能力都弱于 Vc。清除能力大小依次為總醇提取物氯仿 提取物正丁醇提取物粗多糖水層乙酸乙酯提取物?？紤]到樣品本底吸收的影響，本實驗樣品最高濃度為1 mg/ml，未測定更高濃度樣品的清除作用。石油醚提取部分效果不明顯，故

14、未對其進(jìn)行比較 分析。楮實提取物對 0H自由基清除活性的半清除率濃度(IC50 , mg/ml) 值順序為：Vc(0.06) V總醇提取物(0.28) V氯仿提取物(0.31) V正丁醇 提取物(0.41) V粗多糖(0.74) V水層部分(1.01) V乙酸乙酯提取物(12.44 )。半清除率濃度與清除能力大小成負(fù)相關(guān)， 即半清除率濃度 越小則清除能力越強(qiáng)，除乙酸乙酯提取物外，醇提物的各提取部分的 半清除率濃度隨著提取溶劑極性增大而增大。2.2對DPPH 自由基的清除作用DPPH 自由基屬于比較穩(wěn)定的有機(jī)物自由基，廣泛應(yīng)用于測定 純抗氧化劑或植物提取物的體外抗氧化活性。以抗氧化劑Vc作為參照

15、，本研究利用該法對比了提取物的 DPPH 自由基清除效果。從圖2 可看出，各個部分對 DPPH 自由基都表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力，并在 實驗濃度范圍內(nèi)呈明顯量效關(guān)系，但各部分的清除能力都低于Vc，乙酸乙酯對DPPH 自由基的清除能力最好。由于樣品本身吸收的影響較大而未對更高質(zhì)量濃度進(jìn)行實驗。清除能力大小依次為Vc 乙 酸乙酯提取物氯仿提取物水層部分正丁醇提取物石油醚提 取物總醇提取物粗多糖。對DPPH 自由基清除作用的半清除率濃度(IC50, mg/ml)大小 依次為Vc(0.01) V乙酸乙酯提取物(0.08) V氯仿提取物(0.09) V水層 部分(0.20) V正丁醇提取物(0.32) V石

16、油醚提取物(0.34) V總醇提取 物(0.54) V粗多糖(0.77)。乙酸乙酯提取物的效果較好，但與 Vc仍存 在較大差距。2.3對Fe3+還原能力的測定還原能力的測定，可檢驗化合物是否為良好的電子供應(yīng)體，它 所提供的電子可以使Fe3+還原為Fe2+，從而使體系溶液顏色改變， 即反映出體系中氧化還原狀態(tài)的改變。吸光值越大，還原力越強(qiáng)，抗 氧化效果愈佳。由圖3可看出，各提取物的還原能力與其質(zhì)量濃度都 成正的量效關(guān)系，在濃度為0.6 mg/ml時，各部分的還原能力大小依 次為Vc 乙酸乙酯提取物水層部分氯仿提取物總醇提取物 粗多糖正丁醇提取物石油醚提取物。3討論楮實多指?？浦参飿?gòu)樹Brouss

17、onetia papyrifera(L.)Vent.丨的球 形聚花果，肉質(zhì)，熟時為橙紅色，味酸甜，可食用。而通常所說的中 藥楮實子應(yīng)為楮實聚花果內(nèi)的小瘦果10。構(gòu)樹的樹葉、果實、根、 乳汁均有很高的藥用價值，近幾年部分省份開始對構(gòu)樹進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化開 發(fā)11，如湖北省發(fā)展800萬畝，貴州省種植100萬畝構(gòu)樹林，廣 西種植200畝。若按每畝構(gòu)樹年產(chǎn)鮮果800 kg 12丨計算，僅貴州省年產(chǎn)楮實可達(dá)80萬噸，資源非常豐富，具有很好的開發(fā)利用前景。 隨著增齡，機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的抗氧化能力下降，自由基代謝產(chǎn)物增加。 自由基在細(xì)胞內(nèi)可發(fā)生多位點損傷，這些損傷的積累會促使機(jī)體老化 和引發(fā)諸如老年癡呆、帕金森病、癌

18、癥、高脂血癥、糖尿病等相關(guān)疾 病13，14。因而降低自由基代謝產(chǎn)物的生成，是延緩衰老的重要 途徑。本實驗通過3種評價方法對楮實的體外抗氧化活性進(jìn)行考察， 結(jié)果表明楮實具有清除自由基、增加Fe3+還原的能力，具有很好的體外抗氧化活性。這與楮實具有抗或延緩老年性癡呆的作用是一致的15。楮實在預(yù)防機(jī)體衰老和抗衰老的應(yīng)用方面應(yīng)得到充分的重視?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Lee D，Bhatk PL,Fong HH,et al.Aromatase inhibitors froBroussonetia papyrifera JJ Nat Prod，2001 ； 64:1286 93.2熊山，葉祖光.楮實子化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展J中國中醫(yī)藥信息雜志,2009 ； 16(5):102 3.3黃寶康，秦路平，鄭漢臣，等楮實子的臨床應(yīng)用研究J. 時珍國醫(yī)國藥，2002 ； 13(7) : 434 5.4張洪泉抗衰老藥理學(xué)新論M北京：人民衛(wèi)生出版社，2004:6 7.5袁 曉，袁