第十一部分高效毛細(xì)管電泳分析法教學(xué)課件

1、8:04:36第第第第第第十一十一十一十一十一十一章章章章章章高效毛細(xì)管電泳高效毛細(xì)管電泳高效毛細(xì)管電泳高效毛細(xì)管電泳高效毛細(xì)管電泳高效毛細(xì)管電泳分析法分析法分析法分析法分析法分析法一、一、phce基本原理基本原理basic principles of phce二、電滲現(xiàn)象與電滲流二、電滲現(xiàn)象與電滲流electroosmosis and electroosmotic flow三、影響電滲流的因素三、影響電滲流的因素factors influenced electroosmosis四、淌度四、淌度mobility五、五、phce中的參數(shù)與關(guān)系中的參數(shù)與關(guān)系式式parameters and rel

2、ation in hpce六、影響分離效率的因素六、影響分離效率的因素factors influenced separation efficiency第二節(jié)第二節(jié)第二節(jié)第二節(jié)第二節(jié)第二節(jié)高效毛細(xì)管電泳理論高效毛細(xì)管電泳理論高效毛細(xì)管電泳理論高效毛細(xì)管電泳理論高效毛細(xì)管電泳理論高效毛細(xì)管電泳理論基礎(chǔ)基礎(chǔ)基礎(chǔ)基礎(chǔ)基礎(chǔ)基礎(chǔ)high performance capillary electrophoresis,hpcebasic theory of hpce8:04:36 一、高效毛細(xì)管電泳一、高效毛細(xì)管電泳一、高效毛細(xì)管電泳一、高效毛細(xì)管電泳一、高效毛細(xì)管電泳一、高效毛細(xì)管電泳( ( ( ( ( (h

3、pce)hpce)hpce)hpce)hpce)hpce)基本原理基本原理基本原理基本原理基本原理基本原理 basic principles of phcebasic principles of phcebasic principles of phce 電泳是指帶電離子在電場(chǎng)中的定向移動(dòng)，不同離子具有電泳是指帶電離子在電場(chǎng)中的定向移動(dòng)，不同離子具有不同的遷移速度，不同的遷移速度，遷移速度與哪些因素有關(guān)？遷移速度與哪些因素有關(guān)？ 當(dāng)帶電離子以速度當(dāng)帶電離子以速度 在電場(chǎng)中移動(dòng)時(shí)，受到大小相等、在電場(chǎng)中移動(dòng)時(shí)，受到大小相等、方向相反的電場(chǎng)推動(dòng)力和平動(dòng)摩擦阻力的作用。方向相反的電場(chǎng)推動(dòng)力和平動(dòng)摩擦阻

4、力的作用。電場(chǎng)力：電場(chǎng)力：fe = qe 阻阻 力：力：f = f故：故： qe = fq離子所帶的有效電荷；e 電場(chǎng)強(qiáng)度；離子在電場(chǎng)中的遷移速度；f 平動(dòng)摩擦系數(shù) ( 對(duì)于球形離子： f =6； 離子的表觀(guān)液態(tài)動(dòng)力學(xué)半徑； 介質(zhì)的粘度； )8:04:37所以，遷移速度：所以，遷移速度：eqfqe 6 （球形離子） 物質(zhì)離子在電場(chǎng)中物質(zhì)離子在電場(chǎng)中差速遷移差速遷移是電泳分離的基礎(chǔ)。是電泳分離的基礎(chǔ)。淌度淌度 ：?jiǎn)挝浑妶?chǎng)強(qiáng)度下的平均電泳速度。：?jiǎn)挝浑妶?chǎng)強(qiáng)度下的平均電泳速度。 6qe 8:04:37二、電滲現(xiàn)象與電滲流二、電滲現(xiàn)象與電滲流二、電滲現(xiàn)象與電滲流二、電滲現(xiàn)象與電滲流二、電滲現(xiàn)象與電滲流

5、二、電滲現(xiàn)象與電滲流 electroosmosiselectroosmosiselectroosmosis and and and electroosmoticelectroosmoticelectroosmotic flow flow flow1.1.電滲流現(xiàn)象電滲流現(xiàn)象 當(dāng)固體與液體接觸時(shí)，固體表面由于某種原因帶一種電荷，則因靜電引力使其周?chē)后w帶有相反電荷，在液-固界面形成雙電層雙電層，二者之間存在電位差。 當(dāng)液體兩端施加電壓時(shí)，當(dāng)液體兩端施加電壓時(shí)，就會(huì)發(fā)生液體相對(duì)于固體表面就會(huì)發(fā)生液體相對(duì)于固體表面的移動(dòng)，這種液體相對(duì)于固體的移動(dòng)，這種液體相對(duì)于固體表面的移動(dòng)的現(xiàn)象叫表面的移動(dòng)的現(xiàn)象

6、叫電滲現(xiàn)象電滲現(xiàn)象。 電滲現(xiàn)象中整體移動(dòng)著的電滲現(xiàn)象中整體移動(dòng)著的液體叫液體叫電滲流電滲流（electroosmotic flow ，簡(jiǎn)稱(chēng)簡(jiǎn)稱(chēng)eof）。）。 8:04:372.2.2.2.2.2.hpcehpcehpce中的電滲現(xiàn)象與電滲流中的電滲現(xiàn)象與電滲流中的電滲現(xiàn)象與電滲流中的電滲現(xiàn)象與電滲流中的電滲現(xiàn)象與電滲流中的電滲現(xiàn)象與電滲流 石英毛細(xì)管柱，內(nèi)充液石英毛細(xì)管柱，內(nèi)充液ph3ph3時(shí)，表面電離成時(shí)，表面電離成- -siosio- -, ,管管內(nèi)壁帶負(fù)電荷，形成雙電層。內(nèi)壁帶負(fù)電荷，形成雙電層。 在高電場(chǎng)的作用下，帶正電荷的溶液表面及擴(kuò)散層向陰在高電場(chǎng)的作用下，帶正電荷的溶液表面及擴(kuò)散

7、層向陰極移動(dòng)，由于這些陽(yáng)離子實(shí)際上是溶劑化的，故將引起柱中極移動(dòng)，由于這些陽(yáng)離子實(shí)際上是溶劑化的，故將引起柱中的溶液整體向負(fù)極移動(dòng)，速度的溶液整體向負(fù)極移動(dòng)，速度電滲流電滲流。8:04:373.3.3.3.3.3.hpcehpcehpce中電滲流的大小與方向中電滲流的大小與方向中電滲流的大小與方向中電滲流的大小與方向中電滲流的大小與方向中電滲流的大小與方向 電滲流的大小用電滲流速度電滲流的大小用電滲流速度電滲流電滲流表示，取決于電滲淌表示，取決于電滲淌度度和電場(chǎng)強(qiáng)度和電場(chǎng)強(qiáng)度e e。即即 電滲流電滲流 = = e e電滲淌度取決于電泳介質(zhì)及雙電層的電滲淌度取決于電泳介質(zhì)及雙電層的zetazet

8、a電勢(shì)，即電勢(shì)，即 = = 0 00真空介電常數(shù)；介電常數(shù)；毛細(xì)管壁的zeta電勢(shì)。 電滲流電滲流 = = 0 0 e e實(shí)際電泳分析，可在實(shí)驗(yàn)測(cè)定相應(yīng)參數(shù)后，按下式計(jì)算實(shí)際電泳分析，可在實(shí)驗(yàn)測(cè)定相應(yīng)參數(shù)后，按下式計(jì)算 電滲流電滲流 = = l lefef/t/teoeolef 毛細(xì)管有效長(zhǎng)度； teo電滲流標(biāo)記物（中性物質(zhì)）的遷移時(shí)間。8:04:37hpcehpcehpce中電滲流的方向中電滲流的方向中電滲流的方向中電滲流的方向中電滲流的方向中電滲流的方向 電滲流的方向取決于毛細(xì)管內(nèi)表面電荷的性質(zhì)：電滲流的方向取決于毛細(xì)管內(nèi)表面電荷的性質(zhì)： 內(nèi)表面帶負(fù)電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極；內(nèi)表

9、面帶負(fù)電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極； 內(nèi)表面帶正負(fù)電荷，溶液帶負(fù)電荷，電滲流流向陽(yáng)極；內(nèi)表面帶正負(fù)電荷，溶液帶負(fù)電荷，電滲流流向陽(yáng)極； 石英毛細(xì)管；帶負(fù)電荷，電滲流流向陰極；石英毛細(xì)管；帶負(fù)電荷，電滲流流向陰極；改變電滲流方向的方法：改變電滲流方向的方法： （1 1）毛細(xì)管改性）毛細(xì)管改性 表面鍵合陽(yáng)離子基團(tuán)； （2 2）加電滲流反轉(zhuǎn)劑）加電滲流反轉(zhuǎn)劑 內(nèi)充液中加入大量的陽(yáng)離子表面活性劑，將使石英毛細(xì)管壁帶正電荷，溶液表面帶負(fù)電荷。電滲流流向陽(yáng)極。8:04:374. 4. 4. 4. 4. 4. hpcehpcehpce中電滲流的流形中電滲流的流形中電滲流的流形中電滲流的流形中電滲流的流

10、形中電滲流的流形 電荷均勻分布，整體移動(dòng)，電滲流的流動(dòng)為平流，塞式流動(dòng)（譜帶展寬很小）； 液相色譜中的溶液流動(dòng)為層流，拋物線(xiàn)流型，管壁處流速為零，管中心處的速度為平均速度的2倍（引起譜帶展寬較大）。8:04:375. 5. 5. 5. 5. 5. hpcehpcehpce中電滲流的作用中電滲流的作用中電滲流的作用中電滲流的作用中電滲流的作用中電滲流的作用 電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的5 57 7倍；倍； 各種電性離子在毛細(xì)管柱中的遷移速度為：各種電性離子在毛細(xì)管柱中的遷移速度為： + + = =電滲流電滲流 + + + +ef ef 陽(yáng)離子運(yùn)動(dòng)方向與

11、電滲流陽(yáng)離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致一致； - - = =電滲流電滲流 - - - -ef ef 陰離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流陰離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流相反相反； 0 0 = =電滲流電滲流 中性粒子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致；中性粒子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致；（1 1）可一次完成陽(yáng)離子、陰離子、中性粒子的分離；）可一次完成陽(yáng)離子、陰離子、中性粒子的分離；（2 2）改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性，）改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性，如同改變?nèi)缤淖僱clc中的流速；中的流速；（3 3）電滲流的微小變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性；）電滲流的微小變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性；在在hpcehpce中，控制電滲流非常

12、重要中，控制電滲流非常重要。8:04:37三、三、三、三、三、三、hpcehpcehpce中影響電滲流的因素中影響電滲流的因素中影響電滲流的因素中影響電滲流的因素中影響電滲流的因素中影響電滲流的因素 factors influenced factors influenced factors influenced electroosmosiselectroosmosiselectroosmosis1.1.電場(chǎng)強(qiáng)度的影響電場(chǎng)強(qiáng)度的影響 電滲流速度和電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，當(dāng)毛細(xì)管長(zhǎng)度一定時(shí)，電滲流速度正比于工作電壓。2.2.毛細(xì)管材料的影響毛細(xì)管材料的影響 不同材料毛細(xì)管的表面電荷特性不同，產(chǎn)生的電滲流大

13、小不同；8:04:373. 3. 3. 3. 3. 3. 電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響（1 1）溶液）溶液phph的影響的影響 對(duì)于石英毛細(xì)管，溶液ph增高時(shí)，表面電離多，電荷密度增加，管壁zeta電勢(shì)增大，電滲流增大，ph=7ph=7，達(dá)到最大達(dá)到最大； ph3，完全被氫離子中和，表面電中性，電滲流為零。分析時(shí)，采用緩沖溶液來(lái)保持ph穩(wěn)定。（2 2）陰離子的影響）陰離子的影響 在其他條件相同，濃度相同而陰離子不同時(shí)，毛細(xì)管中的電流有較大差別，產(chǎn)生的焦耳熱不同。 緩沖溶液離子強(qiáng)度，影響雙電層的厚度、溶液

14、黏度和工作電流，明顯影響電滲流大小。緩沖溶液離子強(qiáng)度增加，電滲流下降。8:04:378:04:374. 4. 4. 4. 4. 4. 溫度的影響溫度的影響溫度的影響溫度的影響溫度的影響溫度的影響 毛細(xì)管內(nèi)溫度的升高，使溶液的黏度下降，電滲流增大。毛細(xì)管內(nèi)溫度的升高，使溶液的黏度下降，電滲流增大。溫度變化來(lái)自于溫度變化來(lái)自于“焦耳熱焦耳熱”； 焦耳熱：焦耳熱：毛細(xì)管溶液中有電流通過(guò)時(shí)，產(chǎn)生的熱量；毛細(xì)管溶液中有電流通過(guò)時(shí)，產(chǎn)生的熱量； hpcehpce中的焦耳熱與背景電解質(zhì)的摩爾電導(dǎo)、濃度及電場(chǎng)中的焦耳熱與背景電解質(zhì)的摩爾電導(dǎo)、濃度及電場(chǎng)強(qiáng)度成正比。強(qiáng)度成正比。 溫度每變化溫度每變化1 1，將引

15、起背景電解質(zhì)溶液黏度變化，將引起背景電解質(zhì)溶液黏度變化2%2%3%3%；8:04:375. 5. 5. 5. 5. 5. 添加劑的影響添加劑的影響添加劑的影響添加劑的影響添加劑的影響添加劑的影響（1）加入濃度較大的中性鹽，如k2so4，溶液離子強(qiáng)度增大，使溶液的黏度增大，電滲流減小。（2）加入表面活性劑，可改變電滲流的大小和方向； 加入不同陽(yáng)離子表面活性劑來(lái)控制電滲流。 加入陰離子表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉（sds），可以使壁表面負(fù)電荷增加，zeta電勢(shì)增大，電滲流增大；（3）加入有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈，使電滲流增大。8:04:37四、淌度四、淌度四、淌度四、淌度四、淌度四、淌度 mobili

16、tymobilitymobilitymobilitymobilitymobility 淌度淌度：帶電離子在單位電場(chǎng)下的遷移速度；帶電離子在單位電場(chǎng)下的遷移速度； 淌度不同是電泳分離的基礎(chǔ)。淌度不同是電泳分離的基礎(chǔ)。1.1.絕對(duì)淌度絕對(duì)淌度( (absolute mobility)ab 無(wú)限稀釋溶液中帶電離子在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的平均遷移速度，簡(jiǎn)稱(chēng)淌度?？稍谑謨?cè)中查閱。2.2.有效淌度有效淌度(effective mobility)ef 實(shí)際溶液中的淌度(實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的)。 efef=a ai ii i ai 溶質(zhì)i 的解離度；i 溶質(zhì)i 在解離狀態(tài)下的絕對(duì)淌度3.3.表觀(guān)淌度表觀(guān)淌度 ap 離子在實(shí)

17、際分離過(guò)程中的遷移速度（表觀(guān)遷移速度）： apap= =ap ap e e8:04:37五、五、五、五、五、五、hpcehpcehpce中的參數(shù)與關(guān)系式中的參數(shù)與關(guān)系式中的參數(shù)與關(guān)系式中的參數(shù)與關(guān)系式中的參數(shù)與關(guān)系式中的參數(shù)與關(guān)系式 parameters and relation in hpceparameters and relation in hpceparameters and relation in hpce1.1.遷移時(shí)間（保留時(shí)間）遷移時(shí)間（保留時(shí)間） hpcehpce兼具有電化學(xué)的特性和色譜分析的特性。有關(guān)色譜兼具有電化學(xué)的特性和色譜分析的特性。有關(guān)色譜理論也適用。理論也適用。v

18、llelltapefapefapef v外加電壓；l毛細(xì)管總長(zhǎng)度；2.2.分離效率（塔板數(shù)）分離效率（塔板數(shù)） 在在hpcehpce中，僅存在縱向擴(kuò)散，中，僅存在縱向擴(kuò)散，2 2=2=2dtdt22/154. 5;22 ytndeldlvlnrefapefap 擴(kuò)散系數(shù)小的溶質(zhì)比擴(kuò)散系數(shù)大的分離效率高，分離生擴(kuò)散系數(shù)小的溶質(zhì)比擴(kuò)散系數(shù)大的分離效率高，分離生物大分子的依據(jù)。物大分子的依據(jù)。8:04:383.3.3.3.3.3.分離度分離度分離度分離度分離度分離度 dlvlrefap 平均平均 177. 0 影響分離度的主要因素；工作電壓影響分離度的主要因素；工作電壓v v；毛細(xì)管有效長(zhǎng)度毛細(xì)管有

19、效長(zhǎng)度與總長(zhǎng)度比；有效淌度差。分離度可按譜圖直接由下式計(jì)算：與總長(zhǎng)度比；有效淌度差。分離度可按譜圖直接由下式計(jì)算：221apap 平均平均1212)(2wwttr8:04:38六、影響分離效率的因素六、影響分離效率的因素六、影響分離效率的因素六、影響分離效率的因素六、影響分離效率的因素六、影響分離效率的因素區(qū)帶展寬區(qū)帶展寬區(qū)帶展寬區(qū)帶展寬區(qū)帶展寬區(qū)帶展寬 factors influenced the efficiencyfactors influenced the efficiencyfactors influenced the efficiencyband broadeningband br

20、oadeningband broadening 1.1.縱向擴(kuò)散的影響縱向擴(kuò)散的影響 在在hpcehpce中，縱向擴(kuò)散引起的峰展寬：中，縱向擴(kuò)散引起的峰展寬：2 2=2=2dtdt 由擴(kuò)散系數(shù)和遷移時(shí)間決定。大分子的擴(kuò)散系數(shù)小，可由擴(kuò)散系數(shù)和遷移時(shí)間決定。大分子的擴(kuò)散系數(shù)小，可獲得更高的分離效率，大分子生物試樣分離的依據(jù)。獲得更高的分離效率，大分子生物試樣分離的依據(jù)。2.2.進(jìn)樣的影響進(jìn)樣的影響 當(dāng)進(jìn)樣塞長(zhǎng)度太大時(shí)，引起的峰展寬大于縱向擴(kuò)散。分當(dāng)進(jìn)樣塞長(zhǎng)度太大時(shí)，引起的峰展寬大于縱向擴(kuò)散。分離效率明顯下降；理想情況下，進(jìn)樣塞長(zhǎng)度離效率明顯下降；理想情況下，進(jìn)樣塞長(zhǎng)度： winj= (24d t

21、 )1/2實(shí)際操作時(shí)進(jìn)樣塞長(zhǎng)度小于或等于毛細(xì)管總長(zhǎng)度的實(shí)際操作時(shí)進(jìn)樣塞長(zhǎng)度小于或等于毛細(xì)管總長(zhǎng)度的1%1%2%2%。8:04:383.3.3.3.3.3.焦耳熱與溫度梯度的影響焦耳熱與溫度梯度的影響焦耳熱與溫度梯度的影響焦耳熱與溫度梯度的影響焦耳熱與溫度梯度的影響焦耳熱與溫度梯度的影響 電泳過(guò)程產(chǎn)生的焦耳熱可由下式計(jì)算：電泳過(guò)程產(chǎn)生的焦耳熱可由下式計(jì)算：22eclrivqbm m電解質(zhì)溶液的摩爾電導(dǎo)；i工作電流：cm電解質(zhì)濃度； 散熱過(guò)程中，在毛細(xì)管內(nèi)形成溫度梯度（中心溫度高），散熱過(guò)程中，在毛細(xì)管內(nèi)形成溫度梯度（中心溫度高），破壞了塞流，導(dǎo)致區(qū)帶展寬。破壞了塞流，導(dǎo)致區(qū)帶展寬。 改善方法：改善方法： （1 1）減小毛細(xì)管內(nèi)徑；）減小毛細(xì)管內(nèi)徑； （2 2）控制散熱；）控制散熱；8:04:384.4.4.4.4.4.溶質(zhì)與管壁間的相互作用溶質(zhì)與管壁間的相互作用溶質(zhì)與管壁間的相互作用溶質(zhì)與管壁間的相互作用溶質(zhì)與管壁間的相互作用溶質(zhì)與管壁間的相互作用 存在吸附與疏水作用，造成譜帶展寬；存在吸附與疏水作用，造成譜帶展寬； 蛋白質(zhì)、多肽帶電荷數(shù)多，有較多的疏水基，吸附問(wèn)題特別嚴(yán)重，是目前分離分析該類(lèi)物質(zhì)的