細(xì)胞培養(yǎng)的操作步驟

1、細(xì)胞培養(yǎng)的操作步驟細(xì)胞培養(yǎng)的操作步驟一、原代培養(yǎng)及其操作步驟原代分離細(xì)胞培養(yǎng)是指從供體內(nèi)取出組織后， 經(jīng)機(jī)械以及消化分離成單個(gè)細(xì)胞或單一型細(xì)胞 群，使之在體外模擬人體生理環(huán)境，在無(wú)菌、適 當(dāng)溫度和一定的營(yíng)養(yǎng)條件下，生存、生長(zhǎng)和繁殖。 原代培養(yǎng)細(xì)胞常有不同的細(xì)胞成分，生長(zhǎng)緩慢， 但是更能代表所來(lái)源的組織細(xì)胞類型和表達(dá)組 織的特異性特征。利用原代細(xì)胞培養(yǎng)做各種實(shí) 驗(yàn)，如藥物測(cè)試、細(xì)胞分化及病毒學(xué)方面的試驗(yàn) 效果很好。其操作步驟如下。1. 剪切組織 先將所取得的組織，用D-Hanks 或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手術(shù)鑷 去除黏附的結(jié)締組織等非培養(yǎng)所需組織。再次清 洗后，用手術(shù)刀將組織切成

2、若干小塊，移入青霉 素小瓶或小燒杯中，加入適量緩沖液，用彎頭眼 科剪，反復(fù)剪切組織，直到組織成糊狀，約1mm3 大小。靜置片刻后，用吸管吸去上層液體，加入 適當(dāng)?shù)木彌_液再清洗一次。2. 消化分離 消化分離的目的是將細(xì)小的組 織塊消化分離成細(xì)胞團(tuán)或分散的單個(gè)細(xì)胞，以利 于進(jìn)一步的培養(yǎng)，常用的消化酶有胰蛋白酶和膠原酶。3. 培養(yǎng)細(xì)胞懸液用計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。用 培養(yǎng)液將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為(25)x 105 cells / ml，或?qū)嶒?yàn)所需密度，分裝于培養(yǎng)瓶中，使細(xì)胞 懸液的量以覆蓋后略高于培養(yǎng)瓶底部為宜。置CO培養(yǎng)箱內(nèi)，5%CO2 37C靜置培養(yǎng)。一般3 5d,原代培養(yǎng)細(xì)胞可以黏附于瓶壁， 并伸展開(kāi)始

3、生長(zhǎng)，可補(bǔ)加原培養(yǎng)液量1/2的新培養(yǎng)液，繼續(xù) 培養(yǎng)23d后換液，一般714d可以長(zhǎng)滿瓶壁， 進(jìn)行傳代。4. 注意事項(xiàng)(1) 無(wú)菌操作：細(xì)菌或霉菌污染是培養(yǎng)失敗 的常見(jiàn)原因，必須加強(qiáng)各個(gè)環(huán)節(jié)的無(wú)菌操作觀 念，以預(yù)防為主，一旦污染，一般很難消除。(2) 培養(yǎng)液：所用的培養(yǎng)液必須滿足細(xì)胞生 存和生長(zhǎng)的必要條件。由于細(xì)胞來(lái)源的動(dòng)物種類、異,液。組織類型不同，對(duì)培養(yǎng)液的要求有一定的差 必要時(shí)可用預(yù)實(shí)驗(yàn)的方法選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)(3) 小牛血清：小牛血清對(duì)于維持培養(yǎng)細(xì)胞 的生存和促進(jìn)細(xì)胞增殖起著關(guān)鍵性作用?？蛇x擇 多種不同批號(hào)的小牛血清進(jìn)行小樣分析。一旦確 定某一廠家的某一批號(hào)小牛血清后，就保持應(yīng)用 至實(shí)驗(yàn)完成

4、。(4) 膠原酶溶液：必須新鮮配制，貯存時(shí)間 過(guò)長(zhǎng)(即使是-20C低溫保存)，也將影響消化效 力，導(dǎo)致消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞損傷增加。(5) L-谷氨酰胺：幾乎所有細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺 都有較高的要求，細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和 蛋白質(zhì)，在缺少谷氨酰胺時(shí)，細(xì)胞會(huì)因生長(zhǎng)不良 而死亡。谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，加有谷氨 酰胺的培養(yǎng)液在4C冰箱貯存兩周以上時(shí)，就應(yīng) 重新加入原來(lái)量的谷氨酰胺。(6) 靜置培養(yǎng)：原代細(xì)胞在消化分離后，置 于CO培養(yǎng)箱的頭2448h (必要時(shí)72h)內(nèi)，應(yīng) 處于絕對(duì)靜置狀態(tài)，切忌不時(shí)地取出培養(yǎng)瓶觀察 生長(zhǎng)狀況，這將使原代分離細(xì)胞難以貼壁， 更談 不上伸展和增殖，初學(xué)者尤應(yīng)注意。不必

5、擔(dān)心培 養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)成分會(huì)消耗光，在細(xì)胞增殖之前對(duì) 營(yíng)養(yǎng)的要求并不大。原代培養(yǎng)初期僅加一薄層培 養(yǎng)液的目的也在于有利于細(xì)胞貼壁伸展。(7) 消化時(shí)間：一般消化至肉眼尚可見(jiàn)微小 組織顆粒即可，因?yàn)榇藭r(shí)組織顆粒已經(jīng)松散，略 經(jīng)吹打即成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，過(guò)久的消化往往 導(dǎo)致細(xì)胞損傷加重，細(xì)胞培養(yǎng)成活率降低。(8) 其他生長(zhǎng)因子：經(jīng)過(guò)以上處理，一般原 代分離細(xì)胞培養(yǎng)均可以成功。對(duì)于少數(shù)特殊類型 細(xì)胞也可以考慮加一些特殊的生長(zhǎng)因子，如胰島 素能促使細(xì)胞攝取葡萄糖和氨基酸。 另外，內(nèi)毒 素、EGF FGF等均有促有絲分裂作用，但費(fèi)用 較高。二、傳代培養(yǎng)及其操作步驟原代細(xì)胞培養(yǎng)成功以后，需要進(jìn)行分離培養(yǎng)，

6、否則細(xì)胞會(huì)因生存空間不足或密度過(guò)大，營(yíng)養(yǎng)障 礙，影響細(xì)胞生長(zhǎng)。細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)分離稀釋 后傳到新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的過(guò)程稱之為傳代培 養(yǎng)。傳代細(xì)胞允許培養(yǎng)的細(xì)胞擴(kuò)增(形成細(xì)胞株)，可以進(jìn)行細(xì)胞克隆，易于保存，但可能喪 失一些特殊的細(xì)胞和分化特征。傳代細(xì)胞形成細(xì) 胞株的最大利處在于提供了大量持久的實(shí)驗(yàn)材 料，便于實(shí)驗(yàn)。1. 操作步驟(1) 吸掉或倒掉培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液。(2) 向瓶?jī)?nèi)加入胰蛋白酶液和 EDTA昆合液少 量。以能覆蓋培養(yǎng)瓶底為宜。(3) 置37C孵箱或室溫(25C溫度)下進(jìn)行 消化，25min后把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進(jìn) 行觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后，應(yīng) 立即中止消化。(4)

7、吸出消化液，向瓶?jī)?nèi)加入Hanks液少量, 輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶，把殘留消化液沖掉，然后再加 培養(yǎng)液。如果僅使用胰蛋白酶消化，在吸除胰蛋 白液后，可直接加入少量含血清的培養(yǎng)液， 終止 消化。(5) 使用彎頭吸管，吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，按順 序反復(fù)輕輕吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離形成 細(xì)胞懸液。吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔，以防用力過(guò)猛損 傷細(xì)胞。(6) 用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，分別接種于新的培養(yǎng) 瓶中，置CO培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。？?？(7) 細(xì)胞培養(yǎng)換液時(shí)間應(yīng)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的狀 態(tài)和實(shí)驗(yàn)要求來(lái)確定。一般23d后應(yīng)換一次生 長(zhǎng)液。待細(xì)胞鋪滿器皿底面，即可使用；也可繼續(xù)傳代擴(kuò)大培養(yǎng)或換成維持液2. 注意事項(xiàng)(1) 掌握好細(xì)胞消化的時(shí)間

8、，消化時(shí)間過(guò)短 時(shí)，細(xì)胞不宜從瓶壁脫落，過(guò)長(zhǎng)的消化會(huì)導(dǎo)致細(xì) 胞脫落、損傷。(2) 掌握好消化濃度，當(dāng)消化液濃度過(guò)高時(shí), 消化時(shí)間應(yīng)縮短，過(guò)低時(shí)細(xì)胞消化時(shí)間相對(duì)延 長(zhǎng)。三、體內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)及其操作步驟1. 瘤細(xì)胞懸液接種(1) 無(wú)菌選取生長(zhǎng)良好(有光澤，淡紅色)瘤 組織或?qū)?shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)瘤細(xì)胞。(2) 在PBS中將瘤組織剪碎后用勻漿器研磨， 經(jīng)80100目篩網(wǎng)過(guò)濾成細(xì)胞懸液。(3) 培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)用PBS洗兩遍。(4) 計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度至107108/ ml。(5) 常規(guī)消毒后，于接種部位(通常為背部或 腋窩腹股溝皮下)用醫(yī)用注射器皮下潛行一段后 注入細(xì)胞懸液(0.1ml /部位， 106細(xì)胞)。初次

9、接種成功率低，細(xì)胞數(shù)盡可能多一些。(6)次日注意觀察動(dòng)物一般情況。初次接種 一般有一段較長(zhǎng)的潛伏期，以后隨著傳代潛伏期 逐漸縮短，最后固定為一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的時(shí)間。2. 腹水瘤的建立與腹水瘤的接種將實(shí)體瘤細(xì)胞直接種于小鼠腹腔、腹壁或其他部位，引起 腹水，腹水中含有瘤細(xì)胞，將這種腹水反復(fù)傳代， 即可成為腹水瘤。初次傳代時(shí)，腹水常呈血性(含 大量紅細(xì)胞)，反復(fù)傳代后腹水逐漸變成乳白色。 腹水瘤的接種過(guò)程如下。(1) 將凍存或培養(yǎng)的腹水瘤細(xì)胞離心和洗滌， 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。(2) 消毒動(dòng)物，左下腹穿刺接種106腹水瘤細(xì) 胞。(3) 接種腹水瘤細(xì)胞后約712d，待小鼠腹部 明顯膨大。用碘酒棉球消毒小鼠腹部，用

10、 9號(hào)針 頭抽取腹水，也可行腹部解剖后，用滴管吸取。 每只小鼠可抽35ml。(4) 抽取的腹水經(jīng)3000rpm離心15min，收集 上清，分裝凍存?zhèn)溆?。四、培養(yǎng)細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇細(xì)胞低溫凍存是培養(yǎng)室常規(guī)工作和通用技術(shù)。 細(xì)胞凍存在-196C液氮中，儲(chǔ)存時(shí)間幾乎是無(wú)限 的。細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的原則是慢凍快融。1 凍存細(xì)胞(1) 選對(duì)數(shù)增生期細(xì)胞(證明無(wú)支原體污染), 在凍存前1d換液。(2) 按常規(guī)方法把培養(yǎng)細(xì)胞制備成懸液，計(jì) 數(shù)，使細(xì)胞密度達(dá)5X 107/ml左右密度，離心， 去上清。(3) 加入配制好的凍存液(培養(yǎng)液6.8ml，小 牛血清2ml，DMSOml，5.6%NaHCO0.1ml )，按

11、與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中， 然后 用吸管輕輕吹打令細(xì)胞重懸。凍存細(xì)胞時(shí)培養(yǎng)液 中加入保護(hù)劑10%二甲基亞砜(DMSO或甘油，可 使冰點(diǎn)降低，使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外。(4) 分裝于無(wú)菌凍存管中，每管加1.5m懸液。(5) 旋好凍存管并仔細(xì)檢查，一定要蓋緊， 做好標(biāo)記。(6) 凍存：在特殊的儀器或簡(jiǎn)易的液氮容器 中，按-1C/min的速度，在3040min時(shí)間內(nèi)， 下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮 中。要適當(dāng)掌握下降冷凍速度，過(guò)快能影響細(xì)胞 內(nèi)水分透出，太慢則促進(jìn)冰晶形成。操作時(shí)應(yīng)戴防護(hù)眼鏡和手套，以免液氮凍傷。2.復(fù)蘇細(xì)胞(1) 從罐中取出凍存管。(2) 迅速放入36C37C水浴，不時(shí)搖動(dòng)， 使其急速融化，3060s內(nèi)完成。(3) 凍存管用70%酒精擦拭消毒后，打開(kāi)蓋 子