兩種不同培養(yǎng)方法對破骨細胞ATPasea3基因表達和骨吸收活性的影響

1、DOC格式論文，方便您的復制修改刪減兩種不同培養(yǎng)方法對破骨細胞ATPasea3基因表達和骨吸收活性的影響(作者：單位：郵編：)作者：杜文喜 肖魯偉 吳承亮 厲駒 童培建【摘要】目的探討不同方法培養(yǎng)下的大鼠破骨細胞(osteoclast , 0C)骨吸收功能的差異，以及骨吸收關鍵基因 ATPase a3的mRNA 表達水平的差異，為體外實驗奠定基礎。方法機械分離和誘導培 養(yǎng)，即從新生24h的大鼠長干骨骨髓腔內(nèi)壁機械分離成熟0C和1,25(OH)2 D3誘導大鼠骨髓細胞形成破骨樣細胞(osteoclast likecell，OLC)，對獲得的0C進行形態(tài)和骨吸收功能觀察，并測定 0C 骨吸收關鍵基

2、因ATPase a3的mRNA表達水平的差異。結果0C 和 OLC 均為抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resista nt acid phosphatase，TRAP)染色陽性的多核巨細胞，與細胞共培養(yǎng)骨片上 可形成骨吸收陷窩；誘導法培養(yǎng)出的 OLC數(shù)目多于機械分離法，但 誘導早期陷窩較之小而淺，誘導后期基本接近OC; OC骨吸收關鍵基因ATPase a3的mRNA，在機械分離8h與誘導培養(yǎng)6天的細胞 表達量無顯著差異，但都遠少于培養(yǎng) 8天的表達量。結論誘導法 可以培育出大量的OLC，優(yōu)于機械分離法，但早期骨吸收功能較弱， OC骨吸收功能與其核數(shù)相關。后期的 OCL與機械分離0C接近，

3、 可以用于各類實驗?！娟P鍵詞】 破骨細胞破骨樣細胞骨吸收ATPase a3破骨細胞（osteoclast，0C）是骨吸收的執(zhí)行細胞，0C骨吸收機 制研究對闡明骨組織生理病理機制和代謝性骨病的防治具有十分重 要的意義，然而0C為高代謝的分化終末細胞，組織含量極少又非常 脆弱，自Chambers首次建立0C體外培養(yǎng)的方法以來，各國學者 不斷完善，李氏等在國內(nèi)首次建立了骨髓細胞誘導培養(yǎng)法，建立了破骨樣細胞（osteoclast like cell，OLC）培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn) OLC和0C是 同一種細胞12。OC的骨吸收功能以及形成的數(shù)目，是其活性的 集中體現(xiàn)，同時，ATPase a3基因是骨吸收功能執(zhí)行

4、的關鍵基因， 該基因的缺乏或突變，是骨吸收障礙發(fā)生骨硬化癥和胚胎致死的關鍵 原因3。本實驗在經(jīng)典的機械分離法和骨髓細胞誘導培養(yǎng)法的基礎 上加以改進，對其形態(tài)、分化及功能進行了動態(tài)觀察，測定OC骨吸收關鍵基因ATPase a3的mRNA表達水平量，探討不同方法培養(yǎng)下 的OC骨吸收功能的差異。1材料1.1動物新生24h內(nèi)SD大鼠乳鼠，4周齡SD雄性大鼠（SPF 級），由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供 SCXK （滬）20030003 。1.2主要試劑M199培養(yǎng)基、aMEM培養(yǎng)基、HEPES液（美 國Gibco公司），1,25（OH）2D3、萘酚ASBI磷酸鹽（美國Sigma公 司），甲苯胺藍（瑞

5、士 Fluka公司）、胎牛血清（杭州四季青公司）,Trizol、 引物合成（美國Invitrogen公司），M_|MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（美國promege 公司）。1.3蓋玻片及骨磨片的制備 將10 X10mm蓋玻片，經(jīng)硫酸-重 鉻酸鉀清洗液中過夜，蒸餾水超聲波清洗，自然晾干，高壓消毒后備 用。取新鮮成年牛股骨皮質(zhì)骨，鋸成厚骨片，經(jīng)角磨機和細金剛砂紙 磨至約15呵 厚，再剪成5X5mm大小，三蒸水中超聲波清洗后，自 然晾干，使用前紫外線雙面照射各 4h。2方法2.1大鼠0C機械分離法培養(yǎng) 參考文獻4方法操作，培養(yǎng) 1h后再用培養(yǎng)液沖洗，分別于4、8和10h取出蓋玻片進行抗酒石酸 酸性磷酸酶（tart

6、rate resista nt acid phosphatase ，TRAP）染色，8h 時 抽提OC總RNA，并將與OC共培養(yǎng)24h的骨片甲苯胺藍染色。2.2大鼠骨髓細胞誘導法 選用4周齡SD雄性大鼠，斷頸處死， 無菌條件下分離完整股骨、脛骨，暴露髓腔后用a MEM培養(yǎng)基（含 20%胎牛血清）沖洗骨髓腔數(shù)次至骨干發(fā)白為止。沖洗液 200目篩 網(wǎng)過濾后，收集液接種于25ml培養(yǎng)瓶，標準培養(yǎng)（飽和濕度、5% CO2、 37 C ） 1h后收集上層細胞液（含骨髓單核細胞），500 r/min，4 C離心 5 min，棄上清，用完全培養(yǎng)基（含20%胎牛血清、1 x10-8mol/L的 1,25（OH

7、）2D3、青霉素100U/ml、鏈霉素100血/ml的a MEM培養(yǎng)基） 稀釋細胞至1.5 X106個/孔，將細胞懸液加入預置蓋玻片或牛骨片的 進口 24孔細胞培養(yǎng)板。常規(guī)培養(yǎng)，每 3 d換液1次，每次換總量的 一半。培養(yǎng)全過程中，動態(tài)觀察細胞的形態(tài)和生長狀態(tài)，分別于 3, 6, 8，11，14d取出蓋玻片進行TRAP染色，抽提6d和8d的OLC 總RNA，并將8d、12d與OLC共培養(yǎng)骨片甲苯胺藍染色。2.3 OC的形態(tài)觀察 分別對不同方法培養(yǎng)的細胞進行觀察， TRAP染色。將待定培養(yǎng)時間的細胞爬片取出，按照文獻4方法 與步驟進行染色，甘油明膠封片，光鏡觀察。其中誘導培養(yǎng)法中的 OLC含2個

8、胞核以上且呈TRAP染色陽性的細胞即為 OC。在200 倍光鏡下進行OC計數(shù)，每個玻片上隨機選擇10個視野，計數(shù)陽性 細胞均值并做統(tǒng)計。2.4骨吸收功能觀察 分別取與上述細胞共培養(yǎng)的骨片，經(jīng) 2.5%戊二醛溶液固定、0.25mol.L-1氫氧化銨中超聲波清洗，系列酒 精脫水，自然晾干，1%甲苯胺藍染色，觀察骨片上骨陷窩形態(tài)并拍 照，利用計算機圖像分析系統(tǒng)計算整張骨片上骨吸收陷窩面積之和， 結果以陷窩面積/片(mm2/片)表示。通過骨片上吸收陷窩的面積變 化情況，進一步鑒定兩種OC體外培養(yǎng)體系差異。并將觀察后的骨片 用2.5%戊二醛和1%四氧化鋨各固定，酸性二鉀氧基丙烷梯度脫水， 丙酮清洗，CO

9、2臨界點干燥，鍍金，制備電子顯微鏡標本。2.5 RT PCR半定量分析 Trizol法提取細胞總RNA，取1 總 RNA采用兩步法 RTPCR。ATPase a3基因5與內(nèi)參甘油醛 3 磷酸脫氫酶(glyceraldehyde3_|phosphate dehydrogenase, GAPDH) 引物(見表 1 )OPCR 反應條件為：94C 30sec ,61 C (GAPDH 60 C) 30sec，72 C 1min。取擴增產(chǎn)物各10山在1.7 %瓊脂糖凝膠電泳， 用Image pro plus 6.0軟件對擴增產(chǎn)物進行密度值分析，分別計為 DATPase a3、DGAPDH，DATPas

10、e a3 / DGAPDH 表示 ATP a3 mRNA的相對含量。2.6統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計。各組數(shù) 據(jù)采用x s表示，計量資料比較用單因素方差分析（onewayANOVA ）。以P0.05為顯著性差異，P0.01為非常顯著性差異。3結果3.1 OC形態(tài)觀察 新生大鼠機械分離的細胞數(shù)量較多，均勻平 鋪。培養(yǎng)1h后，大部分未貼壁細胞被 M199沖走，此時可見到玻片 上多核0C。4h后細胞形態(tài)清晰，表面有微絨毛，呈偽足樣運動，細 胞外形不斷變化，部分細胞之間纖維樣突出連接（圖1），隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞充分伸展，體積變大，核仁清晰可見。但培養(yǎng) 24h 后，大部分0

11、C細胞壁增厚，核固縮，微絨毛消失。含1,25（OH）2D3 誘導劑的大鼠骨髓細胞懸液接種于培養(yǎng)板后，4h見細胞均勻分布于 培養(yǎng)板底部，呈短梭形貼壁生長。誘導培養(yǎng)6d時，可見體積較大、多核（310個）的OLC，呈圓形、多角型等多種形態(tài)，時有細胞 突起向外延展，胞質(zhì)密度較低，細胞核或集聚在細胞中央，或散在細 胞周邊，核內(nèi)可見12個核仁不等（圖2），周圍的單核細胞不斷融 合在較大的OCL中，細胞核逐漸增多，與機械分離培養(yǎng)4h的OC相似。隨著培養(yǎng)時間的延長，OLC數(shù)量遞增，8d時達峰值，后期細 胞開始空泡變性，細胞裂解碎片增加，細胞核呈現(xiàn)固縮、碎裂，細胞 膜破裂，細胞死亡。3.2 TRAP染色TRAP

12、染色是鑒定 OC的特異性酶學染色方 法，TRAP染色陽性（TRAP+ ）為：細胞質(zhì)染成紅色或酒紅色，細 胞核不著色。機械分離的細胞培養(yǎng)4h后可見到典型的TRAP+的0C， 培養(yǎng)8h、10h與4h相比較TRAP+的0C數(shù)量沒有顯著差別（P0.05）（見表2），但到10h時0C細胞萎縮，空泡變性明顯（圖3）。誘導 培養(yǎng)第6d開始，可見多核TRAP+細胞，之后TRAP+的細胞逐漸增 多，出現(xiàn)較大型的多核細胞，并在第 8d數(shù)量達到高峰（圖4），與其 它時間組差異明顯（P0.01），11d時TRAP+細胞減少，細胞著色逐 漸變淡，顏色轉(zhuǎn)晦暗，第14天TRAP+細胞完全消失。（見表3）圖1機械分離培養(yǎng)4h

13、，表面有微絨毛（小箭頭），細胞之間纖維樣突出連接（大箭頭）。（倒置顯微鏡X200）（略）圖2誘導培養(yǎng)第6天，單核細胞之間，出現(xiàn)體積較大、多核OLC （箭頭）。（倒置顯微鏡X400）（略）圖3機械分離培養(yǎng)10h，TRAP染色陽性，0C空泡變性（小 箭頭）。（TRAP染色X200）（略）圖4誘導培養(yǎng)第8天,TRAP染色陽性的多核細胞（燕尾箭頭）， 單核細胞核增多，體積增大（三角箭頭），TRAP+的單核細胞（白色 箭頭）。（TRAP染色X20O）（略）表1各基因引物序列及片段大?。裕┍?機械分離法不同時間TRAP+細胞個數(shù)（略）不同培養(yǎng)天數(shù)之間比較 P0.05表3不同誘導天數(shù)TRAP+細胞個數(shù)（略

14、）不同培養(yǎng)天數(shù)之間比較，探P0.05,仲0.05, PO.OI3.3骨吸收功能觀察 骨片上吸收陷窩是 OC骨吸收 的直接結果，其陷窩數(shù)量、大小和深度直接反應OC骨吸收的能力。機械法培養(yǎng)24 h的骨片甲苯胺藍染色后，在光鏡下可見吸收陷窩呈 藍紫色圓形、橢圓形、臘腸形等多種形態(tài)（圖5），邊界清楚，部分出 現(xiàn)穿鑿樣改變。而誘導培養(yǎng) 8d時，在骨片上發(fā)現(xiàn)少量呈藍紫色小陷 窩，隨著誘導時間的延長，陷窩的數(shù)量、深度均增加，12d時可見大量的吸收陷窩（圖6）。經(jīng)掃描電鏡觀察可清楚識別骨吸收陷窩，成熟 的OC骨吸收陷窩較OLC深，底面粗糙，可見有纖維樣基底（圖7）， 但是相同面積大小的骨片上，誘導12d的骨陷

15、窩數(shù)量明顯多于機械法。機械法培養(yǎng)24 h的骨吸收陷窩比誘導培養(yǎng)8d形成的骨陷窩面積 略多，但遠少于誘導12d形成的骨吸收陷窩面積。同時機械法產(chǎn)生 的吸收陷窩的個數(shù)多于誘導8d，遠少于誘導12d的數(shù)量。（見表4） 表4不同培養(yǎng)條件骨陷窩的個數(shù)（個）和陷窩面積（略）不同培養(yǎng)時間之間比較厶P0.05 PO.OI o3.4兩種方法 ATPase a3的表達變化 ATPase a3基因經(jīng) RTPCR擴增，1.7%瓊脂糖凝膠電泳（圖8），發(fā)現(xiàn)機械分離8h目 的基因擴增產(chǎn)物密度值少于誘導培養(yǎng) 8d，差異明顯（P0.01 ），但與 誘導培養(yǎng)6d無差異（P0.05 ），而且相對密度值同樣少于誘導培養(yǎng) 8d。（見

16、表5）圖5機械分離培養(yǎng)24h，與OC共培養(yǎng)的骨片，出現(xiàn)較周圍骨組織深染的骨陷窩，臘腸形骨質(zhì)吸收區(qū)（箭頭）。（甲苯胺藍染色X 150）（略）圖6誘導培養(yǎng)12d，與OLC共培養(yǎng)的骨片，出現(xiàn)大量骨 陷窩，斑片狀骨質(zhì)吸收區(qū)（箭頭）。（甲苯胺藍染色X 150）（略）圖7機械分離培養(yǎng)24h，與OC共培養(yǎng)的骨片，骨吸收陷 窩較深呈現(xiàn)呈不規(guī)則形，邊界清晰、底面粗糙不平 （箭頭）。（掃描電鏡 X150）（略）圖8 RTPCR產(chǎn)物，ATPase a3基因mRNA表達量，誘導法8d較其它時間段多。（略）表5不同時間段rTpcr產(chǎn)物密度值（略）不同組間比較，P0.05，AP0.05，P0.014討論OC是高度分化的多

17、核巨細胞，直接參與骨吸收，是骨組 織吸收的主要功能細胞。目前，多數(shù)學者認為OC來源于單核/巨噬細胞前體細胞67，到目前為止尚缺乏成熟的OC細胞株，因此機 械分離法是最直接最有效獲得成熟 OC的方法。根據(jù)OC體形巨大、 能迅速粘附于基質(zhì)的特點，本研究在原機械分離方法上改進，培養(yǎng) 1h后再用培養(yǎng)液沖洗，以除去大量未貼壁的細胞，達到相對純化的 目的。24h動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，810h最典型，胞核清晰，細胞飽滿， 絲狀足密集，呈偽足樣運動、TRAP陽性等特點，12h細胞開始凋亡，24h典型細胞形態(tài)完全消失，機械分離法培養(yǎng)的0C含量少又非常脆 弱，成為其生化學和分子生物學研究的嚴重限制因素。由骨髓和其它組織誘

18、導培養(yǎng)形成的細胞與成熟的0C來源不同，稱為OLC :2。課題組用1,25(OH)2 D3成功地在體外誘導 SD大鼠骨髓細胞分化形成 OLC，發(fā)現(xiàn)在lxiO-8mol.L-1 1,25(OH)2 D3的作用下，骨髓細胞可形成大量的TRAP+、在骨片上形成陷窩的 多核巨細胞，與文獻報道一致1 1,25(OH)2D3為VitD生物活性 最強的代謝產(chǎn)物，與成骨細胞(osteoblast, OB )的1,25(OH)2D3受 體結合，上調(diào)破骨細胞分化因子(receptor activator of NF KB Ligand, RANKL )，直接刺激多核OC的分化成熟，同時可促使 0B分泌粒細 胞集落刺

19、激因子(mCSF )，間接促進OC形成8。骨髓中的破骨 前體細胞在誘導因子的作用下逐漸向 OC分化，實驗顯示OCL骨吸 收數(shù)目、面積逐漸增多，活力逐漸增強。1,25(OH)2 D3誘導出的OLC 數(shù)量明顯多于機械分離的方法，且 OCL周圍的單核細胞逐漸不斷融 合，形成更大的OCL,細胞核逐漸增多，早期細胞核多于5個的OLC 數(shù)量總體上少于機械分離 OC的數(shù)量，但晚期多核OCL明顯增多， 且存活時間遠長于機械分離的成熟OC。機械法骨吸收陷窩邊界清楚， 部分出現(xiàn)穿鑿樣改變，而誘導法從出現(xiàn)少量小陷窩到陷窩的數(shù)量、深度逐漸增加。雖然誘導培養(yǎng) OLC依賴骨髓細胞中的OB和OC前體 細胞來實現(xiàn)的，很難分離

20、到純的 OC，還有待于進一步改善方法提高 其純度，但是誘導法培養(yǎng)法明顯優(yōu)于機械分離法。Atpase a3基因產(chǎn)物為分子量116 KDa的蛋白（a3），是OC 空泡型質(zhì)子泵（空泡型氫離子三磷酸腺苷轉(zhuǎn)運酶Vacuolar H+translocatiing ， ATPase，簡稱 V ATPase）跨膜部分之一， VjATPase活化后將H+分泌到細胞外而完成骨吸收功能。李亦平等9克隆了小鼠該基因，并制備出該基因缺失的小鼠，該小鼠的0C 數(shù)目正常，可附著在骨上，但不能形成吸收陷窩；破骨樣多核細胞不 能形成細胞外酸化腔，也不能使骨去礦物化；0C失去細胞外酸化功能，使小鼠出現(xiàn)嚴重的骨質(zhì)硬化。同時 Nii

21、kura :3也表明ATPase a3對0C發(fā)揮骨吸收功能是必需的，該基因的突變是嬰兒惡性骨硬 化病發(fā)生及胚胎致死的關鍵原因10。利用0C噬骨形成吸收陷窩 特性，觀察陷窩的形態(tài)和測量陷窩的數(shù)量、 大小、深度，以及Atpase a3基因表達量是檢測0C骨吸收功能的可靠指標。RPCR實驗證實，經(jīng)機械分離培養(yǎng)后，相對數(shù)量少的成 熟的0C骨吸收關鍵基因ATPase a3表達量較誘導早期（6d） OLC 多,而少于8d的OLC，由此可知細胞核數(shù)與 0C骨吸收功能直接相 關，與Manolson 11 報道一致，其研究發(fā)現(xiàn) a3亞基的表達隨破 骨細胞核數(shù)（25,69和紹0）的增多而逐漸增加，a3 mRNA在

22、大破 骨細胞中比在小破骨細胞中高 2.5倍，而a3是VjATPase的關鍵性 亞基，由ATPase a3基因調(diào)控，是功能性破骨細胞的必需成分，可 見誘導培養(yǎng)的早期OLC可能并未達到完全分化且胞核數(shù)少，因而在 骨片上形成的吸收陷窩較小，后期多核OCL逐漸增多，陷窩的數(shù)量、 深度逐漸增加，基本接近成熟的 0C。由此可知：機械分離培養(yǎng)法， 可簡單有效的獲得骨吸收功能較活躍的 0C，但存活時間短不利于進 行長期生化和分子生物研究，且需要犧牲大量的動物；而 1,25(OH)2D3誘導法可以獲得數(shù)量多且生存時間較長的 OCL，因此 更適合用于0C分化發(fā)育過程的研究以及關鍵基因的轉(zhuǎn)基因篩選應 用。同時0C的

23、骨吸收功能與其核數(shù)直接相關， 機械分離下來的細胞 為胞核多的成熟0C，骨吸收功能強于胞核較少的早期 OLC，單核細 胞逐漸不斷融合，形成更多、更大的 OCL，誘導晚期的OCL數(shù)量和 功能上完全可以替代成熟 0C進行各類實驗。OC功能異常導致骨改建平衡失調(diào)，是多種代謝性骨病的 病理基礎，1,25(OH)2D3誘導法成功的建立OCL培養(yǎng)體系，替代機 械分離成熟0C方法，建立較為穩(wěn)定的實驗平臺，為利用分子生物方 法高效特異的抑制0C的骨吸收功能奠定基礎，能有效的糾正絕對或 者相對旺盛的骨吸收功能狀態(tài)，達到恢復骨吸收、重建動態(tài)平衡，就 可以有效防治如骨質(zhì)疏松癥、Paget病、激素性股骨頭壞死、風濕 性

24、關節(jié)炎、腫瘤、牙周病等疾病，因此具有廣闊的基礎研究和臨床應 用前景?！緟⒖嘉墨I】:1李鐵軍，于世鳳,王曉敏.1,25二羥基維生素D3對小 鼠骨髓細胞形成破骨細胞樣細胞及其骨吸收效應的影響J.中國骨質(zhì)疏松雜,2000,6(3):12 15.:2孫元明.源于脾干細胞的破骨細胞誘導生成及培養(yǎng)J. 中國地方病學雜志,2003,22(2):101 103.3 Niikura K.Vacuolar ATPase as a drug discovery target J . Drug News Perspect , 2006, 19(3):139 _|144.:4王洪復骨細胞圖譜與骨細胞體外培養(yǎng)技術M .

25、上海:上海科學技術出版社,2001 : 55.5 Hu Y, Nyman J, Muhonen P, et al. Inhibition of the osteoclast V ATPase by small interfering RNAs J . FEBS Lett , 2005,579(22):4937 42.6 Blair HC, Athanasou NA. Recent advances in osteoclast biology and pathological bone resorption J . Histol Histopathol , 2004,19(1):18999.7 Stenbeck G, Horton MA. Endocytic trafficking in actively