兩種不同培養(yǎng)方法對(duì)破骨細(xì)胞ATPasea3基因表達(dá)和骨吸收活性的影響

1、DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減兩種不同培養(yǎng)方法對(duì)破骨細(xì)胞ATPasea3基因表達(dá)和骨吸收活性的影響(作者：?jiǎn)挝唬亨]編：)作者：杜文喜 肖魯偉 吳承亮 厲駒 童培建【摘要】目的探討不同方法培養(yǎng)下的大鼠破骨細(xì)胞(osteoclast , 0C)骨吸收功能的差異，以及骨吸收關(guān)鍵基因 ATPase a3的mRNA 表達(dá)水平的差異，為體外實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。方法機(jī)械分離和誘導(dǎo)培 養(yǎng)，即從新生24h的大鼠長干骨骨髓腔內(nèi)壁機(jī)械分離成熟0C和1,25(OH)2 D3誘導(dǎo)大鼠骨髓細(xì)胞形成破骨樣細(xì)胞(osteoclast likecell，OLC)，對(duì)獲得的0C進(jìn)行形態(tài)和骨吸收功能觀察，并測(cè)定 0C 骨吸收關(guān)鍵基

2、因ATPase a3的mRNA表達(dá)水平的差異。結(jié)果0C 和 OLC 均為抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resista nt acid phosphatase，TRAP)染色陽性的多核巨細(xì)胞，與細(xì)胞共培養(yǎng)骨片上 可形成骨吸收陷窩；誘導(dǎo)法培養(yǎng)出的 OLC數(shù)目多于機(jī)械分離法，但 誘導(dǎo)早期陷窩較之小而淺，誘導(dǎo)后期基本接近OC; OC骨吸收關(guān)鍵基因ATPase a3的mRNA，在機(jī)械分離8h與誘導(dǎo)培養(yǎng)6天的細(xì)胞 表達(dá)量無顯著差異，但都遠(yuǎn)少于培養(yǎng) 8天的表達(dá)量。結(jié)論誘導(dǎo)法 可以培育出大量的OLC，優(yōu)于機(jī)械分離法，但早期骨吸收功能較弱， OC骨吸收功能與其核數(shù)相關(guān)。后期的 OCL與機(jī)械分離0C接近，

3、 可以用于各類實(shí)驗(yàn)。【關(guān)鍵詞】 破骨細(xì)胞破骨樣細(xì)胞骨吸收ATPase a3破骨細(xì)胞（osteoclast，0C）是骨吸收的執(zhí)行細(xì)胞，0C骨吸收機(jī) 制研究對(duì)闡明骨組織生理病理機(jī)制和代謝性骨病的防治具有十分重 要的意義，然而0C為高代謝的分化終末細(xì)胞，組織含量極少又非常 脆弱，自Chambers首次建立0C體外培養(yǎng)的方法以來，各國學(xué)者 不斷完善，李氏等在國內(nèi)首次建立了骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)法，建立了破骨樣細(xì)胞（osteoclast like cell，OLC）培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn) OLC和0C是 同一種細(xì)胞12。OC的骨吸收功能以及形成的數(shù)目，是其活性的 集中體現(xiàn)，同時(shí)，ATPase a3基因是骨吸收功能執(zhí)行

4、的關(guān)鍵基因， 該基因的缺乏或突變，是骨吸收障礙發(fā)生骨硬化癥和胚胎致死的關(guān)鍵 原因3。本實(shí)驗(yàn)在經(jīng)典的機(jī)械分離法和骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)法的基礎(chǔ) 上加以改進(jìn)，對(duì)其形態(tài)、分化及功能進(jìn)行了動(dòng)態(tài)觀察，測(cè)定OC骨吸收關(guān)鍵基因ATPase a3的mRNA表達(dá)水平量，探討不同方法培養(yǎng)下 的OC骨吸收功能的差異。1材料1.1動(dòng)物新生24h內(nèi)SD大鼠乳鼠，4周齡SD雄性大鼠（SPF 級(jí)），由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供 SCXK （滬）20030003 。1.2主要試劑M199培養(yǎng)基、aMEM培養(yǎng)基、HEPES液（美 國Gibco公司），1,25（OH）2D3、萘酚ASBI磷酸鹽（美國Sigma公 司），甲苯胺藍(lán)（瑞

5、士 Fluka公司）、胎牛血清（杭州四季青公司）,Trizol、 引物合成（美國Invitrogen公司），M_|MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（美國promege 公司）。1.3蓋玻片及骨磨片的制備 將10 X10mm蓋玻片，經(jīng)硫酸-重 鉻酸鉀清洗液中過夜，蒸餾水超聲波清洗，自然晾干，高壓消毒后備 用。取新鮮成年牛股骨皮質(zhì)骨，鋸成厚骨片，經(jīng)角磨機(jī)和細(xì)金剛砂紙 磨至約15呵 厚，再剪成5X5mm大小，三蒸水中超聲波清洗后，自 然晾干，使用前紫外線雙面照射各 4h。2方法2.1大鼠0C機(jī)械分離法培養(yǎng) 參考文獻(xiàn)4方法操作，培養(yǎng) 1h后再用培養(yǎng)液沖洗，分別于4、8和10h取出蓋玻片進(jìn)行抗酒石酸 酸性磷酸酶（tart

6、rate resista nt acid phosphatase ，TRAP）染色，8h 時(shí) 抽提OC總RNA，并將與OC共培養(yǎng)24h的骨片甲苯胺藍(lán)染色。2.2大鼠骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)法 選用4周齡SD雄性大鼠，斷頸處死， 無菌條件下分離完整股骨、脛骨，暴露髓腔后用a MEM培養(yǎng)基（含 20%胎牛血清）沖洗骨髓腔數(shù)次至骨干發(fā)白為止。沖洗液 200目篩 網(wǎng)過濾后，收集液接種于25ml培養(yǎng)瓶，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)（飽和濕度、5% CO2、 37 C ） 1h后收集上層細(xì)胞液（含骨髓單核細(xì)胞），500 r/min，4 C離心 5 min，棄上清，用完全培養(yǎng)基（含20%胎牛血清、1 x10-8mol/L的 1,25（OH

7、）2D3、青霉素100U/ml、鏈霉素100血/ml的a MEM培養(yǎng)基） 稀釋細(xì)胞至1.5 X106個(gè)/孔，將細(xì)胞懸液加入預(yù)置蓋玻片或牛骨片的 進(jìn)口 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。常規(guī)培養(yǎng)，每 3 d換液1次，每次換總量的 一半。培養(yǎng)全過程中，動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)，分別于 3, 6, 8，11，14d取出蓋玻片進(jìn)行TRAP染色，抽提6d和8d的OLC 總RNA，并將8d、12d與OLC共培養(yǎng)骨片甲苯胺藍(lán)染色。2.3 OC的形態(tài)觀察 分別對(duì)不同方法培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行觀察， TRAP染色。將待定培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞爬片取出，按照文獻(xiàn)4方法 與步驟進(jìn)行染色，甘油明膠封片，光鏡觀察。其中誘導(dǎo)培養(yǎng)法中的 OLC含2個(gè)

8、胞核以上且呈TRAP染色陽性的細(xì)胞即為 OC。在200 倍光鏡下進(jìn)行OC計(jì)數(shù)，每個(gè)玻片上隨機(jī)選擇10個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽性 細(xì)胞均值并做統(tǒng)計(jì)。2.4骨吸收功能觀察 分別取與上述細(xì)胞共培養(yǎng)的骨片，經(jīng) 2.5%戊二醛溶液固定、0.25mol.L-1氫氧化銨中超聲波清洗，系列酒 精脫水，自然晾干，1%甲苯胺藍(lán)染色，觀察骨片上骨陷窩形態(tài)并拍 照，利用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算整張骨片上骨吸收陷窩面積之和， 結(jié)果以陷窩面積/片(mm2/片)表示。通過骨片上吸收陷窩的面積變 化情況，進(jìn)一步鑒定兩種OC體外培養(yǎng)體系差異。并將觀察后的骨片 用2.5%戊二醛和1%四氧化鋨各固定，酸性二鉀氧基丙烷梯度脫水， 丙酮清洗，CO

9、2臨界點(diǎn)干燥，鍍金，制備電子顯微鏡標(biāo)本。2.5 RT PCR半定量分析 Trizol法提取細(xì)胞總RNA，取1 總 RNA采用兩步法 RTPCR。ATPase a3基因5與內(nèi)參甘油醛 3 磷酸脫氫酶(glyceraldehyde3_|phosphate dehydrogenase, GAPDH) 引物(見表 1 )OPCR 反應(yīng)條件為：94C 30sec ,61 C (GAPDH 60 C) 30sec，72 C 1min。取擴(kuò)增產(chǎn)物各10山在1.7 %瓊脂糖凝膠電泳， 用Image pro plus 6.0軟件對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行密度值分析，分別計(jì)為 DATPase a3、DGAPDH，DATPas

10、e a3 / DGAPDH 表示 ATP a3 mRNA的相對(duì)含量。2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。各組數(shù) 據(jù)采用x s表示，計(jì)量資料比較用單因素方差分析（onewayANOVA ）。以P0.05為顯著性差異，P0.01為非常顯著性差異。3結(jié)果3.1 OC形態(tài)觀察 新生大鼠機(jī)械分離的細(xì)胞數(shù)量較多，均勻平 鋪。培養(yǎng)1h后，大部分未貼壁細(xì)胞被 M199沖走，此時(shí)可見到玻片 上多核0C。4h后細(xì)胞形態(tài)清晰，表面有微絨毛，呈偽足樣運(yùn)動(dòng)，細(xì) 胞外形不斷變化，部分細(xì)胞之間纖維樣突出連接（圖1），隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞充分伸展，體積變大，核仁清晰可見。但培養(yǎng) 24h 后，大部分0

11、C細(xì)胞壁增厚，核固縮，微絨毛消失。含1,25（OH）2D3 誘導(dǎo)劑的大鼠骨髓細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)板后，4h見細(xì)胞均勻分布于 培養(yǎng)板底部，呈短梭形貼壁生長。誘導(dǎo)培養(yǎng)6d時(shí)，可見體積較大、多核（310個(gè)）的OLC，呈圓形、多角型等多種形態(tài)，時(shí)有細(xì)胞 突起向外延展，胞質(zhì)密度較低，細(xì)胞核或集聚在細(xì)胞中央，或散在細(xì) 胞周邊，核內(nèi)可見12個(gè)核仁不等（圖2），周圍的單核細(xì)胞不斷融 合在較大的OCL中，細(xì)胞核逐漸增多，與機(jī)械分離培養(yǎng)4h的OC相似。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，OLC數(shù)量遞增，8d時(shí)達(dá)峰值，后期細(xì) 胞開始空泡變性，細(xì)胞裂解碎片增加，細(xì)胞核呈現(xiàn)固縮、碎裂，細(xì)胞 膜破裂，細(xì)胞死亡。3.2 TRAP染色TRAP

12、染色是鑒定 OC的特異性酶學(xué)染色方 法，TRAP染色陽性（TRAP+ ）為：細(xì)胞質(zhì)染成紅色或酒紅色，細(xì) 胞核不著色。機(jī)械分離的細(xì)胞培養(yǎng)4h后可見到典型的TRAP+的0C， 培養(yǎng)8h、10h與4h相比較TRAP+的0C數(shù)量沒有顯著差別（P0.05）（見表2），但到10h時(shí)0C細(xì)胞萎縮，空泡變性明顯（圖3）。誘導(dǎo) 培養(yǎng)第6d開始，可見多核TRAP+細(xì)胞，之后TRAP+的細(xì)胞逐漸增 多，出現(xiàn)較大型的多核細(xì)胞，并在第 8d數(shù)量達(dá)到高峰（圖4），與其 它時(shí)間組差異明顯（P0.01），11d時(shí)TRAP+細(xì)胞減少，細(xì)胞著色逐 漸變淡，顏色轉(zhuǎn)晦暗，第14天TRAP+細(xì)胞完全消失。（見表3）圖1機(jī)械分離培養(yǎng)4h

13、，表面有微絨毛（小箭頭），細(xì)胞之間纖維樣突出連接（大箭頭）。（倒置顯微鏡X200）（略）圖2誘導(dǎo)培養(yǎng)第6天，單核細(xì)胞之間，出現(xiàn)體積較大、多核OLC （箭頭）。（倒置顯微鏡X400）（略）圖3機(jī)械分離培養(yǎng)10h，TRAP染色陽性，0C空泡變性（小 箭頭）。（TRAP染色X200）（略）圖4誘導(dǎo)培養(yǎng)第8天,TRAP染色陽性的多核細(xì)胞（燕尾箭頭）， 單核細(xì)胞核增多，體積增大（三角箭頭），TRAP+的單核細(xì)胞（白色 箭頭）。（TRAP染色X20O）（略）表1各基因引物序列及片段大?。裕┍?機(jī)械分離法不同時(shí)間TRAP+細(xì)胞個(gè)數(shù)（略）不同培養(yǎng)天數(shù)之間比較 P0.05表3不同誘導(dǎo)天數(shù)TRAP+細(xì)胞個(gè)數(shù)（略

14、）不同培養(yǎng)天數(shù)之間比較，探P0.05,仲0.05, PO.OI3.3骨吸收功能觀察 骨片上吸收陷窩是 OC骨吸收 的直接結(jié)果，其陷窩數(shù)量、大小和深度直接反應(yīng)OC骨吸收的能力。機(jī)械法培養(yǎng)24 h的骨片甲苯胺藍(lán)染色后，在光鏡下可見吸收陷窩呈 藍(lán)紫色圓形、橢圓形、臘腸形等多種形態(tài)（圖5），邊界清楚，部分出 現(xiàn)穿鑿樣改變。而誘導(dǎo)培養(yǎng) 8d時(shí)，在骨片上發(fā)現(xiàn)少量呈藍(lán)紫色小陷 窩，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，陷窩的數(shù)量、深度均增加，12d時(shí)可見大量的吸收陷窩（圖6）。經(jīng)掃描電鏡觀察可清楚識(shí)別骨吸收陷窩，成熟 的OC骨吸收陷窩較OLC深，底面粗糙，可見有纖維樣基底（圖7）， 但是相同面積大小的骨片上，誘導(dǎo)12d的骨陷

15、窩數(shù)量明顯多于機(jī)械法。機(jī)械法培養(yǎng)24 h的骨吸收陷窩比誘導(dǎo)培養(yǎng)8d形成的骨陷窩面積 略多，但遠(yuǎn)少于誘導(dǎo)12d形成的骨吸收陷窩面積。同時(shí)機(jī)械法產(chǎn)生 的吸收陷窩的個(gè)數(shù)多于誘導(dǎo)8d，遠(yuǎn)少于誘導(dǎo)12d的數(shù)量。（見表4） 表4不同培養(yǎng)條件骨陷窩的個(gè)數(shù)（個(gè)）和陷窩面積（略）不同培養(yǎng)時(shí)間之間比較厶P0.05 PO.OI o3.4兩種方法 ATPase a3的表達(dá)變化 ATPase a3基因經(jīng) RTPCR擴(kuò)增，1.7%瓊脂糖凝膠電泳（圖8），發(fā)現(xiàn)機(jī)械分離8h目 的基因擴(kuò)增產(chǎn)物密度值少于誘導(dǎo)培養(yǎng) 8d，差異明顯（P0.01 ），但與 誘導(dǎo)培養(yǎng)6d無差異（P0.05 ），而且相對(duì)密度值同樣少于誘導(dǎo)培養(yǎng) 8d。（見

16、表5）圖5機(jī)械分離培養(yǎng)24h，與OC共培養(yǎng)的骨片，出現(xiàn)較周圍骨組織深染的骨陷窩，臘腸形骨質(zhì)吸收區(qū)（箭頭）。（甲苯胺藍(lán)染色X 150）（略）圖6誘導(dǎo)培養(yǎng)12d，與OLC共培養(yǎng)的骨片，出現(xiàn)大量骨 陷窩，斑片狀骨質(zhì)吸收區(qū)（箭頭）。（甲苯胺藍(lán)染色X 150）（略）圖7機(jī)械分離培養(yǎng)24h，與OC共培養(yǎng)的骨片，骨吸收陷 窩較深呈現(xiàn)呈不規(guī)則形，邊界清晰、底面粗糙不平 （箭頭）。（掃描電鏡 X150）（略）圖8 RTPCR產(chǎn)物，ATPase a3基因mRNA表達(dá)量，誘導(dǎo)法8d較其它時(shí)間段多。（略）表5不同時(shí)間段rTpcr產(chǎn)物密度值（略）不同組間比較，P0.05，AP0.05，P0.014討論OC是高度分化的多

17、核巨細(xì)胞，直接參與骨吸收，是骨組 織吸收的主要功能細(xì)胞。目前，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為OC來源于單核/巨噬細(xì)胞前體細(xì)胞67，到目前為止尚缺乏成熟的OC細(xì)胞株，因此機(jī) 械分離法是最直接最有效獲得成熟 OC的方法。根據(jù)OC體形巨大、 能迅速粘附于基質(zhì)的特點(diǎn)，本研究在原機(jī)械分離方法上改進(jìn)，培養(yǎng) 1h后再用培養(yǎng)液沖洗，以除去大量未貼壁的細(xì)胞，達(dá)到相對(duì)純化的 目的。24h動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，810h最典型，胞核清晰，細(xì)胞飽滿， 絲狀足密集，呈偽足樣運(yùn)動(dòng)、TRAP陽性等特點(diǎn)，12h細(xì)胞開始凋亡，24h典型細(xì)胞形態(tài)完全消失，機(jī)械分離法培養(yǎng)的0C含量少又非常脆 弱，成為其生化學(xué)和分子生物學(xué)研究的嚴(yán)重限制因素。由骨髓和其它組織誘

18、導(dǎo)培養(yǎng)形成的細(xì)胞與成熟的0C來源不同，稱為OLC :2。課題組用1,25(OH)2 D3成功地在體外誘導(dǎo) SD大鼠骨髓細(xì)胞分化形成 OLC，發(fā)現(xiàn)在lxiO-8mol.L-1 1,25(OH)2 D3的作用下，骨髓細(xì)胞可形成大量的TRAP+、在骨片上形成陷窩的 多核巨細(xì)胞，與文獻(xiàn)報(bào)道一致1 1,25(OH)2D3為VitD生物活性 最強(qiáng)的代謝產(chǎn)物，與成骨細(xì)胞(osteoblast, OB )的1,25(OH)2D3受 體結(jié)合，上調(diào)破骨細(xì)胞分化因子(receptor activator of NF KB Ligand, RANKL )，直接刺激多核OC的分化成熟，同時(shí)可促使 0B分泌粒細(xì) 胞集落刺

19、激因子(mCSF )，間接促進(jìn)OC形成8。骨髓中的破骨 前體細(xì)胞在誘導(dǎo)因子的作用下逐漸向 OC分化，實(shí)驗(yàn)顯示OCL骨吸 收數(shù)目、面積逐漸增多，活力逐漸增強(qiáng)。1,25(OH)2 D3誘導(dǎo)出的OLC 數(shù)量明顯多于機(jī)械分離的方法，且 OCL周圍的單核細(xì)胞逐漸不斷融 合，形成更大的OCL,細(xì)胞核逐漸增多，早期細(xì)胞核多于5個(gè)的OLC 數(shù)量總體上少于機(jī)械分離 OC的數(shù)量，但晚期多核OCL明顯增多， 且存活時(shí)間遠(yuǎn)長于機(jī)械分離的成熟OC。機(jī)械法骨吸收陷窩邊界清楚， 部分出現(xiàn)穿鑿樣改變，而誘導(dǎo)法從出現(xiàn)少量小陷窩到陷窩的數(shù)量、深度逐漸增加。雖然誘導(dǎo)培養(yǎng) OLC依賴骨髓細(xì)胞中的OB和OC前體 細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的，很難分離

20、到純的 OC，還有待于進(jìn)一步改善方法提高 其純度，但是誘導(dǎo)法培養(yǎng)法明顯優(yōu)于機(jī)械分離法。Atpase a3基因產(chǎn)物為分子量116 KDa的蛋白（a3），是OC 空泡型質(zhì)子泵（空泡型氫離子三磷酸腺苷轉(zhuǎn)運(yùn)酶Vacuolar H+translocatiing ， ATPase，簡(jiǎn)稱 V ATPase）跨膜部分之一， VjATPase活化后將H+分泌到細(xì)胞外而完成骨吸收功能。李亦平等9克隆了小鼠該基因，并制備出該基因缺失的小鼠，該小鼠的0C 數(shù)目正常，可附著在骨上，但不能形成吸收陷窩；破骨樣多核細(xì)胞不 能形成細(xì)胞外酸化腔，也不能使骨去礦物化；0C失去細(xì)胞外酸化功能，使小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的骨質(zhì)硬化。同時(shí) Nii

21、kura :3也表明ATPase a3對(duì)0C發(fā)揮骨吸收功能是必需的，該基因的突變是嬰兒惡性骨硬 化病發(fā)生及胚胎致死的關(guān)鍵原因10。利用0C噬骨形成吸收陷窩 特性，觀察陷窩的形態(tài)和測(cè)量陷窩的數(shù)量、 大小、深度，以及Atpase a3基因表達(dá)量是檢測(cè)0C骨吸收功能的可靠指標(biāo)。RPCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)機(jī)械分離培養(yǎng)后，相對(duì)數(shù)量少的成 熟的0C骨吸收關(guān)鍵基因ATPase a3表達(dá)量較誘導(dǎo)早期（6d） OLC 多,而少于8d的OLC，由此可知細(xì)胞核數(shù)與 0C骨吸收功能直接相 關(guān)，與Manolson 11 報(bào)道一致，其研究發(fā)現(xiàn) a3亞基的表達(dá)隨破 骨細(xì)胞核數(shù)（25,69和紹0）的增多而逐漸增加，a3 mRNA在

22、大破 骨細(xì)胞中比在小破骨細(xì)胞中高 2.5倍，而a3是VjATPase的關(guān)鍵性 亞基，由ATPase a3基因調(diào)控，是功能性破骨細(xì)胞的必需成分，可 見誘導(dǎo)培養(yǎng)的早期OLC可能并未達(dá)到完全分化且胞核數(shù)少，因而在 骨片上形成的吸收陷窩較小，后期多核OCL逐漸增多，陷窩的數(shù)量、 深度逐漸增加，基本接近成熟的 0C。由此可知：機(jī)械分離培養(yǎng)法， 可簡(jiǎn)單有效的獲得骨吸收功能較活躍的 0C，但存活時(shí)間短不利于進(jìn) 行長期生化和分子生物研究，且需要犧牲大量的動(dòng)物；而 1,25(OH)2D3誘導(dǎo)法可以獲得數(shù)量多且生存時(shí)間較長的 OCL，因此 更適合用于0C分化發(fā)育過程的研究以及關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)基因篩選應(yīng) 用。同時(shí)0C的

23、骨吸收功能與其核數(shù)直接相關(guān)， 機(jī)械分離下來的細(xì)胞 為胞核多的成熟0C，骨吸收功能強(qiáng)于胞核較少的早期 OLC，單核細(xì) 胞逐漸不斷融合，形成更多、更大的 OCL，誘導(dǎo)晚期的OCL數(shù)量和 功能上完全可以替代成熟 0C進(jìn)行各類實(shí)驗(yàn)。OC功能異常導(dǎo)致骨改建平衡失調(diào)，是多種代謝性骨病的 病理基礎(chǔ)，1,25(OH)2D3誘導(dǎo)法成功的建立OCL培養(yǎng)體系，替代機(jī) 械分離成熟0C方法，建立較為穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，為利用分子生物方 法高效特異的抑制0C的骨吸收功能奠定基礎(chǔ)，能有效的糾正絕對(duì)或 者相對(duì)旺盛的骨吸收功能狀態(tài)，達(dá)到恢復(fù)骨吸收、重建動(dòng)態(tài)平衡，就 可以有效防治如骨質(zhì)疏松癥、Paget病、激素性股骨頭壞死、風(fēng)濕 性

24、關(guān)節(jié)炎、腫瘤、牙周病等疾病，因此具有廣闊的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng) 用前景。【參考文獻(xiàn)】:1李鐵軍，于世鳳,王曉敏.1,25二羥基維生素D3對(duì)小 鼠骨髓細(xì)胞形成破骨細(xì)胞樣細(xì)胞及其骨吸收效應(yīng)的影響J.中國骨質(zhì)疏松雜,2000,6(3):12 15.:2孫元明.源于脾干細(xì)胞的破骨細(xì)胞誘導(dǎo)生成及培養(yǎng)J. 中國地方病學(xué)雜志,2003,22(2):101 103.3 Niikura K.Vacuolar ATPase as a drug discovery target J . Drug News Perspect , 2006, 19(3):139 _|144.:4王洪復(fù)骨細(xì)胞圖譜與骨細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)M .

25、上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2001 : 55.5 Hu Y, Nyman J, Muhonen P, et al. Inhibition of the osteoclast V ATPase by small interfering RNAs J . FEBS Lett , 2005,579(22):4937 42.6 Blair HC, Athanasou NA. Recent advances in osteoclast biology and pathological bone resorption J . Histol Histopathol , 2004,19(1):18999.7 Stenbeck G, Horton MA. Endocytic trafficking in actively