博士專題基因功能研究技術(shù)之基因敲除及基因編輯技術(shù)（課堂PPT）

1、1博士專題：基因功能研究技術(shù)之博士專題：基因功能研究技術(shù)之 基因敲除、基因編輯技術(shù)基因敲除、基因編輯技術(shù)劉惠榮劉惠榮內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2II、基因敲除：可以使基因的功能完全缺失、基因敲除：可以使基因的功能完全缺失 基因敲除，又稱基因打靶，是一種遺傳工程技術(shù)，是在轉(zhuǎn)染細(xì)基因敲除，又稱基因打靶，是一種遺傳工程技術(shù)，是在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中發(fā)生外源打靶基因與核基因組目標(biāo)基因之間的胞中發(fā)生外源打靶基因與核基因組目標(biāo)基因之間的DNA同源重同源重組組，能夠使外源基因定點(diǎn)地整合到核基因組的特定位置上，從，能夠使外源基因定點(diǎn)地整合到核基因組的特定位置上，從而達(dá)到改變細(xì)胞遺傳特性的目的。

2、而達(dá)到改變細(xì)胞遺傳特性的目的。 傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)依賴于細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生的同源染色體的隨依賴于細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生的同源染色體的隨機(jī)交換，但在體細(xì)胞內(nèi)，基因同源重組的效率特別低（低于機(jī)交換，但在體細(xì)胞內(nèi)，基因同源重組的效率特別低（低于10-6），增加了實(shí)際操作的工作量，限制了該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用。），增加了實(shí)際操作的工作量，限制了該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用。1987年，年，Thompsson首次建立了完整的首次建立了完整的ES細(xì)胞基因敲除的小鼠細(xì)胞基因敲除的小鼠模型，此后基因敲除技術(shù)得到進(jìn)一步的發(fā)展和完善，目前該技模型，此后基因敲除技術(shù)得到進(jìn)一步的發(fā)展和完善，目前該技術(shù)已經(jīng)成為研究基因功能最直接、最有

3、效的方法之一。術(shù)已經(jīng)成為研究基因功能最直接、最有效的方法之一。 3 基因敲除技術(shù)分為基因敲除技術(shù)分為完全基因敲除完全基因敲除、條件型基因敲除、誘導(dǎo)條件型基因敲除、誘導(dǎo)型基因敲除型基因敲除。 完全基因敲除完全基因敲除是指通過同源重組法是指通過同源重組法完全消除完全消除細(xì)胞或動(dòng)物個(gè)細(xì)胞或動(dòng)物個(gè)體中的靶基因活性。體中的靶基因活性。 條件型基因敲除條件型基因敲除是指通過定位重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)是指通過定位重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)特定時(shí)間和空特定時(shí)間和空間的基因敲除間的基因敲除。 誘導(dǎo)型基因敲除誘導(dǎo)型基因敲除是通過對誘導(dǎo)劑給予時(shí)間的控制，在動(dòng)物是通過對誘導(dǎo)劑給予時(shí)間的控制，在動(dòng)物的一定發(fā)育階段和一定組織細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)對特定基因

4、進(jìn)行敲的一定發(fā)育階段和一定組織細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)對特定基因進(jìn)行敲除的技術(shù)。除的技術(shù)。4 基因載體的構(gòu)建：把目的基因和與細(xì)胞內(nèi)靶基因特異片段同基因載體的構(gòu)建：把目的基因和與細(xì)胞內(nèi)靶基因特異片段同源的源的DNA 分子都重組到帶有標(biāo)記基因分子都重組到帶有標(biāo)記基因(如如neo 基因，基因，TK 基因基因等等)的載體上，成為重組載體?；蚯贸菫榱耸鼓骋换蚴У妮d體上，成為重組載體?；蚯贸菫榱耸鼓骋换蚴テ渖砉δ?，所以一般設(shè)計(jì)為去其生理功能，所以一般設(shè)計(jì)為替換型載體替換型載體。（一）完全基因敲除（一）完全基因敲除5基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制：基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制：

5、有些重要的靶基因被敲除后有些重要的靶基因被敲除后會(huì)引起胚胎早期死亡會(huì)引起胚胎早期死亡，使得，使得無法分析該基因在胚胎發(fā)育晚期和成年期的功能；某些基無法分析該基因在胚胎發(fā)育晚期和成年期的功能；某些基因在不同的細(xì)胞類型中執(zhí)行不同的功能，完全敲除會(huì)導(dǎo)致因在不同的細(xì)胞類型中執(zhí)行不同的功能，完全敲除會(huì)導(dǎo)致突變小鼠出現(xiàn)復(fù)雜的表型，突變小鼠出現(xiàn)復(fù)雜的表型，使研究者很難判斷異常的表型使研究者很難判斷異常的表型是由一種細(xì)胞引起的，還是由幾種細(xì)胞共同引起的。是由一種細(xì)胞引起的，還是由幾種細(xì)胞共同引起的。 6（二）條件型基因敲除（二）條件型基因敲除 條件型基因敲除法條件型基因敲除法可定義為將某個(gè)基因的敲除限可定義為

6、將某個(gè)基因的敲除限制于小鼠某些制于小鼠某些特定類型的細(xì)胞特定類型的細(xì)胞或或發(fā)育的某一特定發(fā)育的某一特定階段階段的一種特殊的基因敲除方法。的一種特殊的基因敲除方法。 該系統(tǒng)在該系統(tǒng)在80年代被引入后，已成功被應(yīng)用于酵母年代被引入后，已成功被應(yīng)用于酵母菌、植物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞及小鼠身上。菌、植物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞及小鼠身上。 現(xiàn)階段條件型基因敲除以噬菌體的現(xiàn)階段條件型基因敲除以噬菌體的Cre/Loxp系統(tǒng)系統(tǒng)和釀酒酵母的和釀酒酵母的FLP/FRT系統(tǒng)系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。應(yīng)用最為廣泛。7Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)重組酶系統(tǒng) Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)在新型基因打靶中獲得廣泛重組酶系統(tǒng)在新型基因打靶中獲得廣泛

7、應(yīng)用，是條件型基因打靶、誘導(dǎo)型基因打靶、時(shí)應(yīng)用，是條件型基因打靶、誘導(dǎo)型基因打靶、時(shí)空特異性基因打靶策略的技術(shù)核心?？仗禺愋曰虼虬胁呗缘募夹g(shù)核心。 8Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)重組酶系統(tǒng) Cre重組酶重組酶：于：于1981年從年從P1噬菌體噬菌體中發(fā)現(xiàn)，屬于中發(fā)現(xiàn)，屬于 Int酶超酶超基因家族?；蚣易?。Cre重組酶基因重組酶基因編碼區(qū)編碼區(qū)序列全長序列全長1029bp（EMBL數(shù)據(jù)庫登錄號數(shù)據(jù)庫登錄號X03453），編碼），編碼38kDa蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)。Cre 重組酶是一種由重組酶是一種由 343 個(gè)個(gè)氨基酸氨基酸組成的單體蛋白。它不組成的單體蛋白。它不僅具有僅具有催化活性催化活性，而且與

8、限制酶相似，而且與限制酶相似，能識別特異的能識別特異的 DNA 序列，即序列，即 loxP 位點(diǎn)，使位點(diǎn)，使 loxP位點(diǎn)間的位點(diǎn)間的基因基因序列被序列被刪除或重組。刪除或重組。Cre重組酶有重組酶有70%的重組效率，不借助任何的重組效率，不借助任何輔助因子，可作用于多種結(jié)構(gòu)的輔助因子，可作用于多種結(jié)構(gòu)的 DNA 底物，如線形、環(huán)底物，如線形、環(huán)狀甚至狀甚至超螺旋超螺旋 DNA。9Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)重組酶系統(tǒng) LoxP（locus ofX-overP1）序列）序列：來源于：來源于P1噬菌體，是噬菌體，是有有兩個(gè)兩個(gè)13bp反向重復(fù)序列反向重復(fù)序列和和中間間隔的中間間隔的8bp序列序列共

9、同組成，共同組成，8bp的間隔序列同時(shí)也確定了的間隔序列同時(shí)也確定了LoxP的方向。的方向。Cre在催化在催化DNA鏈交換過程中與鏈交換過程中與DNA共價(jià)結(jié)合，共價(jià)結(jié)合，13bp的反向重復(fù)序的反向重復(fù)序列是列是Cre酶的結(jié)合域。其序列如下酶的結(jié)合域。其序列如下 ：5 - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3 3 - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5 10 Cre-LoxP系統(tǒng)的特性系統(tǒng)的特性 11條件性基因敲除法可定義為將某個(gè)基因的修飾限制于小鼠某些特定類型的細(xì)胞或發(fā)育的某一特定階段的一

10、種特殊的基因敲除方法。它實(shí)際上是在常規(guī)的基因敲除的基礎(chǔ)上，利用重組酶Cre介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組技術(shù)，在對小鼠基因修飾的時(shí)空范圍上設(shè)置一個(gè)可調(diào)控的“按鈕”，從而使對小鼠基因組的修飾的范圍和時(shí)間處于一種可控狀態(tài)。121314 Cre/loxP系統(tǒng)作用原理示意圖系統(tǒng)作用原理示意圖15FLPFRT 系統(tǒng)系統(tǒng)該系統(tǒng)與該系統(tǒng)與CreloxP系統(tǒng)相同，也是由一個(gè)系統(tǒng)相同，也是由一個(gè)重組酶重組酶 和和一段特殊的一段特殊的DNA序列序列組成。從進(jìn)化的角度上考慮，組成。從進(jìn)化的角度上考慮，F(xiàn)lpFRT系統(tǒng)是系統(tǒng)是CreloxP系統(tǒng)在真核細(xì)胞內(nèi)的同源系統(tǒng)。其中，系統(tǒng)在真核細(xì)胞內(nèi)的同源系統(tǒng)。其中，重組酶重組酶Flp是

11、酵母細(xì)胞內(nèi)的一是酵母細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)由個(gè)由423個(gè)個(gè)氨基酸氨基酸組成的單體蛋白。組成的單體蛋白。與與Cre相似，相似，F(xiàn)lp發(fā)揮作用也不需發(fā)揮作用也不需要任何輔助因子，同時(shí)在不同的條件下具有良好的穩(wěn)定性。要任何輔助因子，同時(shí)在不同的條件下具有良好的穩(wěn)定性。該系統(tǒng)的該系統(tǒng)的另一個(gè)成分另一個(gè)成分Flp識別位點(diǎn)識別位點(diǎn)(Flp recognition target，F(xiàn)RT)與與loxP位點(diǎn)位點(diǎn)非常相似，同樣由兩個(gè)長度為非常相似，同樣由兩個(gè)長度為13bp的反向重復(fù)序列和一個(gè)長度為的反向重復(fù)序列和一個(gè)長度為8 bp的核心序列構(gòu)成。的核心序列構(gòu)成。在該系統(tǒng)發(fā)揮作用時(shí)，在該系統(tǒng)發(fā)揮作用時(shí)，F(xiàn)RT位點(diǎn)的方向決定了

12、目位點(diǎn)的方向決定了目的片段的缺失還是倒轉(zhuǎn)。這兩個(gè)系統(tǒng)比較明顯的區(qū)別是它們發(fā)揮作用的片段的缺失還是倒轉(zhuǎn)。這兩個(gè)系統(tǒng)比較明顯的區(qū)別是它們發(fā)揮作用的最佳溫度不同，的最佳溫度不同，Cre重組酶發(fā)揮作用的最佳溫度為重組酶發(fā)揮作用的最佳溫度為37，而，而Flp重重組酶為組酶為30。因此，。因此，CreloxP系統(tǒng)最適宜在動(dòng)物體內(nèi)使用。系統(tǒng)最適宜在動(dòng)物體內(nèi)使用。loxP和和FRT位點(diǎn)的序列如圖所示位點(diǎn)的序列如圖所示 16這一技術(shù)亦存在一些缺點(diǎn)：這一技術(shù)亦存在一些缺點(diǎn)： 費(fèi)用太高費(fèi)用太高 周期較長周期較長1. 許多基因在剔除后并未產(chǎn)生明顯的表型改變，可能是這許多基因在剔除后并未產(chǎn)生明顯的表型改變，可能是這些基

13、因的功能為其他基因代償所致些基因的功能為其他基因代償所致條件型基因打靶的優(yōu)勢：條件型基因打靶的優(yōu)勢： 克服了重要基因被敲除所導(dǎo)致的早期致死克服了重要基因被敲除所導(dǎo)致的早期致死 并能客觀、系統(tǒng)地研究基因在組織器官發(fā)生、發(fā)育以及并能客觀、系統(tǒng)地研究基因在組織器官發(fā)生、發(fā)育以及疾病發(fā)生、治療過程中的作用和機(jī)制疾病發(fā)生、治療過程中的作用和機(jī)制17（三）誘導(dǎo)型基因敲除（三）誘導(dǎo)型基因敲除 誘導(dǎo)型基因敲除法也是利用誘導(dǎo)型基因敲除法也是利用Cre/Loxp系統(tǒng)系統(tǒng)為基礎(chǔ)，利用控制為基礎(chǔ)，利用控制Cre表達(dá)的啟動(dòng)子的活性表達(dá)的啟動(dòng)子的活性或所表達(dá)的或所表達(dá)的Cre酶活性酶活性具有可誘導(dǎo)的特點(diǎn)具有可誘導(dǎo)的特點(diǎn)，

14、通過對誘導(dǎo)劑給予時(shí)間的控制從而在動(dòng)物通過對誘導(dǎo)劑給予時(shí)間的控制從而在動(dòng)物的一定發(fā)育階段和組織細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)對特定的一定發(fā)育階段和組織細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)對特定基因的敲除?；虻那贸?8 由由Cre/Loxp系統(tǒng)系統(tǒng)和和誘導(dǎo)系統(tǒng)誘導(dǎo)系統(tǒng)兩個(gè)部分組成。兩個(gè)部分組成。Loxp轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是用常規(guī)基因打靶技術(shù)構(gòu)建成的，基因是用常規(guī)基因打靶技術(shù)構(gòu)建成的，基因組中待修飾區(qū)域組中待修飾區(qū)域兩端各攜帶兩端各攜帶1個(gè)個(gè)Loxp位點(diǎn)位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。誘導(dǎo)系統(tǒng)是指所攜帶的動(dòng)物。誘導(dǎo)系統(tǒng)是指所攜帶的Cre基因的表達(dá)基因的表達(dá)或所或所表達(dá)的表達(dá)的Cre的酶活性的酶活性具有可誘導(dǎo)性的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。具有可誘導(dǎo)性的轉(zhuǎn)基因動(dòng)

15、物。人們可以通過對誘導(dǎo)劑給予時(shí)間的預(yù)先設(shè)計(jì)來對動(dòng)人們可以通過對誘導(dǎo)劑給予時(shí)間的預(yù)先設(shè)計(jì)來對動(dòng)物基因敲除的時(shí)空特異性進(jìn)行人為控制，以避免出物基因敲除的時(shí)空特異性進(jìn)行人為控制，以避免出現(xiàn)死胎或動(dòng)物出生后不久即死亡的現(xiàn)象?，F(xiàn)死胎或動(dòng)物出生后不久即死亡的現(xiàn)象。 常見的幾種誘導(dǎo)型基因敲除類型有：四環(huán)素誘導(dǎo)型；常見的幾種誘導(dǎo)型基因敲除類型有：四環(huán)素誘導(dǎo)型；干擾素誘導(dǎo)型；激素誘導(dǎo)型；腺病毒介導(dǎo)型。干擾素誘導(dǎo)型；激素誘導(dǎo)型；腺病毒介導(dǎo)型。19III、基因編輯技術(shù) ZFN系統(tǒng)系統(tǒng) TALEN系統(tǒng)系統(tǒng) CRISPR/Cas 系統(tǒng)20（一）（一）ZFN技術(shù)系統(tǒng)技術(shù)系統(tǒng)21ZFN 技術(shù)原理技術(shù)原理鋅指核酸酶（Zinc

16、-finger nucleases, ZFN）是人工改造的限制性核酸內(nèi)切酶，利用不同的鋅指結(jié)構(gòu)識別特異DNA序列，利用核酸酶切斷靶DNA。鋅指結(jié)構(gòu)中每一個(gè)螺旋可以特異識別3-4個(gè)堿基；人工設(shè)計(jì)識別特異DNA序列的螺旋采用如上的通用序列，通過改變其中7個(gè)X來實(shí)現(xiàn)識別不同的三聯(lián)體堿基，TGEK是多個(gè)螺旋間的連接序列；構(gòu)建成對人工鋅指結(jié)構(gòu)域和FokI融合蛋白（ZFN）可以在指定區(qū)域切斷DNA雙鏈。22 單個(gè)單個(gè)ZFN的的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合結(jié)構(gòu)域一般包含一般包含3-6個(gè)個(gè)Cys2-His2鋅鋅指結(jié)構(gòu)域，每個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域能特異識別指結(jié)構(gòu)域，每個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域能特異識別1個(gè)三聯(lián)體堿基，個(gè)三聯(lián)體堿基，與鋅指蛋白

17、相連接的非特異性核酸內(nèi)切酶來自與鋅指蛋白相連接的非特異性核酸內(nèi)切酶來自FokI的的C端端96個(gè)氨基酸殘基組成的個(gè)氨基酸殘基組成的DNA剪切域剪切域，每個(gè)，每個(gè)FokI單體與一單體與一個(gè)鋅指蛋白組相連構(gòu)成一個(gè)個(gè)鋅指蛋白組相連構(gòu)成一個(gè)ZFN，識別特定的位點(diǎn)識別特定的位點(diǎn)，但但2個(gè)識別位點(diǎn)相距個(gè)識別位點(diǎn)相距6-8bp距離時(shí)，距離時(shí)，2個(gè)單體個(gè)單體ZFN相互作用產(chǎn)生相互作用產(chǎn)生酶切功能。在此特異位點(diǎn)產(chǎn)生酶切功能。在此特異位點(diǎn)產(chǎn)生1個(gè)個(gè)DNA雙鏈切口，雙鏈切口，然后利然后利用固有的同源重組或非同源末端連接修復(fù)機(jī)制進(jìn)行切口修用固有的同源重組或非同源末端連接修復(fù)機(jī)制進(jìn)行切口修復(fù)復(fù)。從而達(dá)到對精確位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)

18、修飾的目的。從而達(dá)到對精確位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)修飾的目的。23ZFN 技術(shù)鋅指核酸酶介導(dǎo)的定向染色體刪除研究人員可以利用ZFN技術(shù)進(jìn)行各種基因編輯，比如基因敲除。已建立有ZFN庫，識別多種DNA序列，但還不能達(dá)到識別任意靶DNA的目的，其應(yīng)用受到一定的限制。24 ZFN技術(shù)已成功應(yīng)用于黑長尾猴、大鼠、小鼠、技術(shù)已成功應(yīng)用于黑長尾猴、大鼠、小鼠、中國倉鼠、斑馬魚、果蠅、海膽、家蠶、擬南芥、中國倉鼠、斑馬魚、果蠅、海膽、家蠶、擬南芥、煙草、玉米、豬、牛、人類煙草、玉米、豬、牛、人類iPS細(xì)胞等，此外，細(xì)胞等，此外，該技術(shù)已經(jīng)有用于治療該技術(shù)已經(jīng)有用于治療HIV的的ZFN藥物進(jìn)入二期藥物進(jìn)入二期臨床實(shí)驗(yàn)。臨

19、床實(shí)驗(yàn)。 但是，該技術(shù)制備復(fù)雜，成本昂貴，而且其技術(shù)但是，該技術(shù)制備復(fù)雜，成本昂貴，而且其技術(shù)專利被少數(shù)幾家商業(yè)公司控制。專利被少數(shù)幾家商業(yè)公司控制。25（二）（二）26嶄新的技術(shù)嶄新的技術(shù) - TALEN經(jīng)典的挑戰(zhàn)經(jīng)典的挑戰(zhàn) 染色體染色體DNA序列的人工編輯修改序列的人工編輯修改 （點(diǎn)）突變：（點(diǎn)）突變：Silent；Missense； Nonsense；Frame shift （基因敲除，（基因敲除，Knockout） 片段刪除片段刪除 片段插入片段插入目的與用途：生物模型；表達(dá)工具；基因治療目的與用途：生物模型；表達(dá)工具；基因治療嶄新的技術(shù)解決經(jīng)典的挑戰(zhàn)27靶向基因技術(shù) 經(jīng)典方法 ：自殺

20、質(zhì)粒，同源重組 幾率低(1 HR event per 106 cells），難！ 飽含希望與失望的技術(shù)：ZFN，被Sigma公司壟斷 新的里程碑：TALEN28TALEN技術(shù)技術(shù)基于基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases，類轉(zhuǎn)錄因子效應(yīng)物核酸酶，類轉(zhuǎn)錄因子效應(yīng)物核酸酶)的靶向基因敲除技術(shù)是一的靶向基因敲除技術(shù)是一種嶄新的分子生物學(xué)工具，現(xiàn)已應(yīng)用于細(xì)胞、酵母、斑馬魚與大種嶄新的分子生物學(xué)工具，現(xiàn)已應(yīng)用于細(xì)胞、酵母、斑馬魚與大鼠等各類研究對象。鼠等各類研究對象。技術(shù)原理：技術(shù)原理：表達(dá)一個(gè)表達(dá)一個(gè)重組核酸酶重組核

21、酸酶，在靶點(diǎn)，在靶點(diǎn)識別結(jié)構(gòu)域識別結(jié)構(gòu)域的作用下，核酸酶識別的作用下，核酸酶識別靶點(diǎn)核酸序列，并發(fā)揮靶點(diǎn)核酸序列，并發(fā)揮內(nèi)切酶活性內(nèi)切酶活性，從而打斷目標(biāo)基因，完成基，從而打斷目標(biāo)基因，完成基因敲除的過程。因敲除的過程。29 1989年年 植物病原體黃單胞菌屬植物病原體黃單胞菌屬 （Xanthomonas spp.） avrBs3 基因被克隆。基因被克隆。 2007年年 發(fā)現(xiàn)其序列特異性核酸結(jié)合特性，發(fā)現(xiàn)其序列特異性核酸結(jié)合特性， avrBs3 TA 2009年年 Xanthomonas TA氨基酸序列與核酸靶序列氨基酸序列與核酸靶序列的對應(yīng)關(guān)系被破譯的對應(yīng)關(guān)系被破譯 由由34個(gè)個(gè)aa組成一個(gè)

22、單元模塊，重復(fù)組成一個(gè)單元模塊，重復(fù)17 -18次次 34個(gè)個(gè)aa中的第中的第12和和13個(gè)氨基酸（個(gè)氨基酸（Repeat Variant Di-residue, RVD) 對應(yīng)識別一個(gè)目標(biāo)堿基對應(yīng)識別一個(gè)目標(biāo)堿基 TALEN 發(fā)展過程發(fā)展過程30人工構(gòu)建TALE模塊識別指定核酸序列102堿基模塊單元 14 18個(gè)重復(fù)真核表達(dá) 14 18個(gè)重復(fù)特異識別指定的14 -18 個(gè)核酸序列并與之結(jié)合34氨基酸單元31TALEN 發(fā)展過程32TALEN (TALE+FOK I) 表達(dá)質(zhì)粒對 TALEN 基因敲除X 2TALEN 表達(dá)質(zhì)粒對轉(zhuǎn)染、表達(dá)切割靶位點(diǎn)切割誘發(fā)DNA損傷修復(fù)機(jī)制（nonhomolo

23、gous end-joining，NHEJ）。由于在此修過程中總是有一定的錯(cuò)誤率存在。在修復(fù)中發(fā)生移碼突變錯(cuò)誤的個(gè)體即形成目標(biāo)基因敲除突變體33TALEN介導(dǎo)的同源重組同源重組發(fā)生率升高幾個(gè)數(shù)量級Donor plasmidHRDonor plasmidLeft armRight armDonor plasmidLeft armRight arm點(diǎn)突變片段刪除基因敲入342011年8月， Nature Biotechnology 上同時(shí)發(fā)表了用TALEN 技術(shù)進(jìn)行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇綜述。 一篇人類干細(xì)胞 Genetic engineering of human pluripoten

24、t cells using TALE nucleases 一篇大鼠Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs 兩篇斑馬魚 Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs 一篇綜述Move over ZFNTALEN的最前沿35TALEN靶向（基因敲除）技術(shù)基本流程選擇、確定靶點(diǎn)2. TALE識別模

25、塊串聯(lián)構(gòu)建3. TALEN真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建4. TALEN真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入（卵）細(xì)胞，表達(dá)TALEN重組蛋白5. 檢測突變效率，篩選（移碼）突變體X 2X 2X 236靶點(diǎn)的靶點(diǎn)的DNADNA序列特征：序列特征：相隔17-18bp的兩段14-18bp序列作為靶點(diǎn)參考文獻(xiàn)：Cermak et al., Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting, Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 1

26、2, e82. 在線靶點(diǎn)選擇設(shè)計(jì)軟件：/node/add/talef-/node/add/talef-off/off/選擇確定TALE靶點(diǎn)37 TAL的核酸識別單元為34aa模塊中的雙連氨基酸（RVD） RVD與A、G、C、T有恒定的對應(yīng)關(guān)系，即NI識別A，NG識別T，HD識別C，NN識別G，非常簡單明確 欲使TALEN特異識別某一核酸序列（靶點(diǎn)），只須按照靶點(diǎn)序列將相應(yīng)TAL單元（14 -18個(gè)）串聯(lián)克隆即可。TALE識別模塊串聯(lián)構(gòu)建38具專利保護(hù)的克隆構(gòu)建系統(tǒng)具專利保護(hù)的克隆

27、構(gòu)建系統(tǒng)39具專利保護(hù)的克隆構(gòu)建系統(tǒng)具專利保護(hù)的克隆構(gòu)建系統(tǒng)步驟一：靶點(diǎn)識別單元串聯(lián)40步驟二：TALEN表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建具專利保護(hù)的克隆構(gòu)建系統(tǒng)具專利保護(hù)的克隆構(gòu)建系統(tǒng)41將靶點(diǎn)識別模塊克隆入真核表達(dá)載體，得到將靶點(diǎn)識別模塊克隆入真核表達(dá)載體，得到Talen質(zhì)粒對質(zhì)粒對靶點(diǎn)識別模塊串接成功后需克隆入真核表達(dá)載體中。此真核表達(dá)載體含有TAL的其它必需結(jié)構(gòu)域并在C端融合有FokI序列。目前，TALEN系統(tǒng)利用FokI的內(nèi)切酶活性打斷目標(biāo)基因。因FokI需形成2聚體方能發(fā)揮活性，在實(shí)際操作中需在目標(biāo)基因中選擇兩處相鄰（間隔17堿基）的靶序列（14 - 18個(gè)堿基）分別進(jìn)行TAL識別模塊構(gòu)建。X 2真核

28、表達(dá)TALEN質(zhì)粒對42步驟三步驟三. 將將TALEN質(zhì)粒對共轉(zhuǎn)入細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)靶基因敲除質(zhì)粒對共轉(zhuǎn)入細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)靶基因敲除TALEN質(zhì)粒對共轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，其表達(dá)的融合蛋白即可分別找到其DNA靶位點(diǎn)并與靶位點(diǎn)特異結(jié)合。此時(shí)，兩個(gè)TALEN融合蛋白中的FokI功能域形成二聚體，發(fā)揮非特異性內(nèi)切酶活性，于兩個(gè)靶位點(diǎn)之間打斷目標(biāo)基因。FOKI 內(nèi)切酶打斷靶點(diǎn)區(qū)43內(nèi)切酶的切割誘發(fā)DNA損傷修復(fù)機(jī)制（nonhomologous end-joining，NHEJ）。由于在此修過程中總是有一定的錯(cuò)誤率存在。在修復(fù)中發(fā)生移碼突變錯(cuò)誤的個(gè)體即形成目標(biāo)基因敲除突變體。突變體形成44PCR 酶切法酶切法 利用靶點(diǎn)設(shè)計(jì)時(shí)挑

29、選的，位于相鄰靶位點(diǎn)之間的特異性內(nèi)切酶位點(diǎn)，進(jìn)行PCR產(chǎn)物酶切鑒定。 當(dāng)左右靶點(diǎn)之間沒有合適的酶切位點(diǎn)時(shí)可使用CEL-I核酸酶檢測。 經(jīng)驗(yàn)規(guī)律：= 2%可用，=10%很好TALEN切割效率檢測45TALEN切割效率檢測啟動(dòng)子 ABCDEF stop-Target site - DEFHIJK啟動(dòng)子 ABCDEFHIJK共轉(zhuǎn)染共轉(zhuǎn)染熒光素酶檢測質(zhì)粒熒光素酶檢測質(zhì)粒+TALEN質(zhì)粒 1+TALEN質(zhì)粒 2熒光素酶檢測法熒光素酶檢測法發(fā)光倍數(shù)與切割效率之間的定量關(guān)系尚缺乏充分研究。有文獻(xiàn)表明，發(fā)光倍數(shù)達(dá)1.5至2倍即可有效獲得突變體。46突變體篩選 有限稀釋法獲得單細(xì)胞克隆 PCR-酶切法鑒定 PC

30、R測序確認(rèn)47基本工具質(zhì)粒14 18bp靶點(diǎn)序列怎樣做TALEN 1單元模塊質(zhì)粒：A，G，C, T共4種 2單元模塊質(zhì)粒：4X4=16種 TALEN表達(dá)載體：基于PCS2質(zhì)粒2種48怎樣做TALEN康為TALEN定制質(zhì)粒產(chǎn)品1單元模塊質(zhì)粒A, G, C, T 4種選擇2單元模塊質(zhì)粒共16種選擇pCS2 TALEN真核表達(dá)載體TALEN空載體2種/套1+2單元模塊質(zhì)粒套裝4+16+2共22種質(zhì)粒/套多單元模塊質(zhì)粒20以下任意單元數(shù)目pCS2 TALEN真核表達(dá)質(zhì)粒將指定TALEN模塊插入pCS2 TALEN真核表達(dá)載體49怎樣做TALEN康為TALEN技術(shù)服務(wù)TALEN質(zhì)粒構(gòu)建提供兩個(gè)測序證明的

31、14-18堿基TALEN識別域真核表達(dá)克隆(pCS2)。且以293T細(xì)胞系轉(zhuǎn)染，PCR酶切鑒定，灰度掃描定量證實(shí)突變效率高于10%TALEN靶向敲除細(xì)胞系構(gòu)建提供經(jīng)克隆測序證明的目標(biāo)基因移碼突變細(xì)胞系(雜合子）TALEN靶向敲除斑馬魚構(gòu)建提供目標(biāo)基因基因移碼突變F1斑馬魚（雜合子）50TALEN技術(shù)成功率影響因素 重組TALEN模塊與靶位點(diǎn)的 親合力靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)原則來自20個(gè)天然TLAE的統(tǒng)計(jì)規(guī)律 細(xì)胞系固有特性K562容易，293中等，MC-10困難 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率不同，293高， HeLa低 所期待的目標(biāo)Heterozygous？Homozygous？Exact point

32、 mutation？Selection marker insertion？51TALE技術(shù)應(yīng)用范圍 細(xì)菌：尚無報(bào)道，已另有多種高效靶向技術(shù)。 真菌：有報(bào)道，TALE原理可行。 植物：TALE原理發(fā)現(xiàn)于植物，需特定轉(zhuǎn)基因技術(shù)。 動(dòng)物細(xì)胞：TALE原理可行，各細(xì)胞系效率不一。 斑馬魚：有TALEN基因敲除報(bào)道，尚無點(diǎn)突變與敲入報(bào)道。 小鼠、大鼠原理肯定可行，但尚無報(bào)道（技術(shù)太新，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物構(gòu)建實(shí)驗(yàn)周期較長）。TALEN應(yīng)用擴(kuò)展的技術(shù)關(guān)鍵：應(yīng)用擴(kuò)展的技術(shù)關(guān)鍵： 切實(shí)可靠的表達(dá)系統(tǒng)。 高效的轉(zhuǎn)基因及克隆篩選技術(shù)。52TALEN的植物應(yīng)用Ting Li et. al. High-efficiency T

33、ALEN-based gene editing produces disease resistant rice， volume 30 number 5 may 2012 Nature Biotechnology 水稻病原菌 Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)導(dǎo)致細(xì)菌性白葉枯病。 細(xì)菌天然 TALE AvrXa7 or PthXo3 與水稻Os11N3基因 啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)控（hijack）此基因上調(diào)表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)糖份向細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)，便于病原菌利用。 以TALEN對細(xì)菌TALE靶點(diǎn)區(qū)做突變，使細(xì)菌TALE無法與水稻Os11N3基因 啟動(dòng)子結(jié)合。 突變水稻獲得抵御

34、細(xì)菌感染的能力53TALEN與主要類同技術(shù)比較siRNA 優(yōu)于TALEN 可瞬時(shí)轉(zhuǎn)染快速觀察效果 Knockdown效果確實(shí)，可用于必須基因 遜于TALEN 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效果短暫 不是徹底knockout 慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)發(fā)生染色體隨機(jī)整合ZFN 優(yōu)于TALEN 經(jīng)驗(yàn)積累多，技術(shù)較成熟 遜于TALEN 技術(shù)復(fù)雜，難度高，被Sigma公司壟斷 靶點(diǎn)序列要求高，難找 Off-targeting現(xiàn)象嚴(yán)重 經(jīng)常有顯著細(xì)胞毒性54基因組精密工程今年來自梅奧醫(yī)學(xué)中心的研究人員第一次利用人工酶切割一段基因序列中的部分DNA，并用合成DNA取代它們，對斑馬魚基因組部分序列進(jìn)行了定制修改。這種技術(shù)稱為轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物

35、核酸酶（transcription activator-like effector nucleases ，TALENs）方法，相比ZFNs和 morpholinos，TALENs具有幾個(gè)優(yōu)勢：它們更便宜、更有效，尤其是以一種開發(fā)活性形式應(yīng)用時(shí)。ZFNs只能靶向特異序列，而TALENs有潛力對任何的DNA序列起作用。Morpholinos的效應(yīng)是短暫的，而TALENs可造成永久性的改變。隨后科學(xué)家們在蟾蜍等其它動(dòng)物中展開了這方面的研究，證明這種技術(shù)與已證實(shí)的基因靶向技術(shù)一樣有效。國內(nèi)清華大學(xué)的施一公和顏寧等人也于今年在Science雜志上報(bào)道了TALE特異識別DNA的分子機(jī)理，這提供了TALE蛋

36、白的改造基礎(chǔ)，極大地拓寬了TALE蛋白在生物技術(shù)應(yīng)用上的前景。55 2012年，年，TALEN被被科學(xué)科學(xué)雜質(zhì)評為十大雜質(zhì)評為十大科學(xué)突破之一?？茖W(xué)突破之一。56新技術(shù)介紹新技術(shù)介紹（三）（三）CRISPR-CasCRISPR-Cas系系統(tǒng)基因修飾技術(shù)統(tǒng)基因修飾技術(shù)Clustered regularly Clustered regularly interspaced short interspaced short palindromic palindromic repeats(CRISPR)/CRIrepeats(CRISPR)/CRISPR-associated SPR-associated

37、 (Cas)9(Cas)957Biotechnology: Rewriting a genomeNature 495, 5051 (07 March 2013) doi:10.1038/495050a581 CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)：系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)：u1987年，日本大阪大學(xué)（年，日本大阪大學(xué)（Osaka University）在對）在對E.coli K12編碼的堿性磷酸酶（編碼的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因進(jìn)行研究時(shí)，）基因進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)在這個(gè)基因編碼區(qū)域的附近存在一小段不同尋常的發(fā)現(xiàn)在這個(gè)基因編碼區(qū)域的附近存在一小段不同尋常的DNA片段，片段，這些片段是由

38、簡單的重復(fù)序列組成的這些片段是由簡單的重復(fù)序列組成的，而且在片段的，而且在片段的兩端還存在一段不太長的特有的序列。兩端還存在一段不太長的特有的序列。2002年，科學(xué)家將其年，科學(xué)家將其正式命名為正式命名為Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)。u隨著基因組測序，發(fā)現(xiàn)隨著基因組測序，發(fā)現(xiàn)90%的古細(xì)菌、的古細(xì)菌、40%的細(xì)菌基因組的細(xì)菌基因組中含有中含有CRISPR位點(diǎn)。有的甚至含有位點(diǎn)。有的甚至含有2-3個(gè)位點(diǎn)。個(gè)位點(diǎn)。u2013以后，研究者們在包括以后，研究者們在包括science和和nature b

39、iotechnology等著名雜志上發(fā)表多篇文章介紹等著名雜志上發(fā)表多篇文章介紹CRISPR-Cas系統(tǒng)，并且已成功在人類、小鼠、斑馬魚等物種上實(shí)現(xiàn)精確系統(tǒng)，并且已成功在人類、小鼠、斑馬魚等物種上實(shí)現(xiàn)精確的基因修飾。的基因修飾。59CRISPR-Cas主要由兩部分組成：主要由兩部分組成：識別識別切割切割2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的組成：系統(tǒng)的組成： CRISPR-Cas CRISPR-Cas是很多細(xì)菌和大部分古生菌的是很多細(xì)菌和大部分古生菌的天然免疫系天然免疫系統(tǒng)統(tǒng)，通過對入侵的病毒和核酸進(jìn)行，通過對入侵的病毒和核酸進(jìn)行特異性特異性的識別，利用的識別，利用CasCas蛋蛋白進(jìn)行切割，從而達(dá)到

40、對自身的免疫。白進(jìn)行切割，從而達(dá)到對自身的免疫。602.1 CRISPR位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)CRISPRCRISPR：（clustered regularly interspaced short palindromic clustered regularly interspaced short palindromic repeatsrepeats） CRISPR CRISPR 是一個(gè)特殊的是一個(gè)特殊的DNADNA重復(fù)序列家族重復(fù)序列家族, , 廣泛分廣泛分布于細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中。布于細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中。CRISPR CRISPR 位點(diǎn)由一個(gè)位點(diǎn)由一個(gè)前導(dǎo)區(qū)前導(dǎo)區(qū)（leaderleader）

41、、多個(gè)高度保守的）、多個(gè)高度保守的重復(fù)序列重復(fù)序列（repeatrepeat）和多個(gè)）和多個(gè)間間隔區(qū)（隔區(qū)（spacerspacer）組成，重復(fù)序列的長度通常組成，重復(fù)序列的長度通常 2148 bp, 2148 bp, 間間隔序列隔序列2672 bp (spacer) 2672 bp (spacer) 。重復(fù)序列具有。重復(fù)序列具有二重對稱性二重對稱性，部，部分間區(qū)序列與某些已知的分間區(qū)序列與某些已知的質(zhì)粒、噬菌體序列相匹配質(zhì)粒、噬菌體序列相匹配。CRISPRCRISPR就是通過這些間隔序列（就是通過這些間隔序列（spacespace）與靶基因進(jìn)行識別。）與靶基因進(jìn)行識別。61622.2 Cas

42、家族家族CasCas（CRISPR associatedCRISPR associated）：）： 存在于存在于CRISPRCRISPR位點(diǎn)附近，是一種位點(diǎn)附近，是一種雙鏈雙鏈DNADNA核酸酶核酸酶，能，能在在guide RNAguide RNA引導(dǎo)下對靶位點(diǎn)進(jìn)行切割。它與引導(dǎo)下對靶位點(diǎn)進(jìn)行切割。它與folkfolk酶功能類似，酶功能類似，但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。63 根據(jù)根據(jù)Cas 基因核心元件序列的不同基因核心元件序列的不同, CRISPR/Cas 免疫系統(tǒng)被分為免疫系統(tǒng)被分為3 種類型：種類型：型、型、型和型和型。型。 型和型和型型C

43、RISPR/Cas 免疫系統(tǒng)需要多個(gè)免疫系統(tǒng)需要多個(gè)Cas 蛋白形成復(fù)合體切割蛋白形成復(fù)合體切割DNA 雙鏈雙鏈, 而而型型CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)只需要一個(gè)免疫系統(tǒng)只需要一個(gè)Cas9 蛋白來切蛋白來切割割DNA 雙鏈雙鏈,目前目前型系統(tǒng)是被改造的最為成功型系統(tǒng)是被改造的最為成功的人工核酸酶。的人工核酸酶。64CRISPR/Cas 的基因座結(jié)構(gòu)相的基因座結(jié)構(gòu)相對簡單。以產(chǎn)膿鏈球菌對簡單。以產(chǎn)膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes SF370)的典型的典型Type CRISPR/Cas 為例，其基因座為例，其基因座結(jié)構(gòu)可分別三部分，結(jié)構(gòu)可分別三部分，5 端為端為tracrRN

44、A 基因基因，中間為一系列，中間為一系列Cas蛋白編碼基因蛋白編碼基因， 包括包括Cas9、Cas1、Cas2 和和Csn2，3 端為端為CRISPR 基因座基因座，由啟動(dòng)子區(qū)域，由啟動(dòng)子區(qū)域和眾多的間隔序列和眾多的間隔序列(spacers)和和重復(fù)序列重復(fù)序列(direct repeats)順序順序排列組成。排列組成。3. Type CRISPR/Cas 系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理65 crRNAs： CRISPR 位點(diǎn)的第一個(gè)重復(fù)序列上游有位點(diǎn)的第一個(gè)重復(fù)序列上游有CRISPR 前導(dǎo)序列前導(dǎo)序列(Leader sequence),該前導(dǎo)序列可以作為啟動(dòng)子該前導(dǎo)序列可以作為啟動(dòng)

45、子, 啟動(dòng)啟動(dòng)CRISPR 序列的序列的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄。 多個(gè)研究表明多個(gè)研究表明CRISPR 基因座首先被轉(zhuǎn)錄成前體基因座首先被轉(zhuǎn)錄成前體CRISPR RNA(pre-crRNA)，然后在，然后在Cas 蛋白蛋白或是核酸內(nèi)切酶的作或是核酸內(nèi)切酶的作用下被剪切成一些小的用下被剪切成一些小的RNA 單元，這些小單元，這些小RNA 即為即為成熟成熟crRNA，由一個(gè)間隔序列和部分重復(fù)序列組成，被命名為，由一個(gè)間隔序列和部分重復(fù)序列組成，被命名為CRISPRRNAs(crRNAs), 這些這些crRNA和和Cas 蛋白共同參蛋白共同參與與 CRISPR 免疫防御過程免疫防御過程 。66tracrRNA：他

46、們發(fā)現(xiàn)他們發(fā)現(xiàn)tracrRNA (trans-activating crRNA)對靶點(diǎn)的識別和切割是對靶點(diǎn)的識別和切割是必需的，必需的，tracrRNA 的的5 端與成熟的端與成熟的crRNA 3 端有部分序列端有部分序列(約約13 bp)能夠配對進(jìn)而形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，對維持能夠配對進(jìn)而形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，對維持crRNA 與靶點(diǎn)的配對可能十分與靶點(diǎn)的配對可能十分重要。其指導(dǎo)重要。其指導(dǎo)RNase和和Cas9 完成前體完成前體crRNA 的成熟，隨后的成熟，隨后tracrRNA 還能與成熟的還能與成熟的crRNA 的重復(fù)序列配對形成的重復(fù)序列配對形成RNA 二聚體，二聚體，進(jìn)而和進(jìn)而和Cas9 蛋白結(jié)合

47、成核糖核蛋白復(fù)合體，發(fā)揮識別和降解入侵的蛋白結(jié)合成核糖核蛋白復(fù)合體，發(fā)揮識別和降解入侵的外源外源DNA 功能。功能。根據(jù)根據(jù)tracrRNA 與與crRNA 的結(jié)構(gòu)特性，他們將的結(jié)構(gòu)特性，他們將tracrRNA 和和crRNA 表表達(dá)為一條嵌合的向?qū)н_(dá)為一條嵌合的向?qū)NA(guide RNA， gRNA)， 并在體外證明并在體外證明gRNA 可以發(fā)揮可以發(fā)揮tracrRNA 和和crRNA 的功能，在目的基因處切割的功能，在目的基因處切割,形形成成DSBs, 該過程是該過程是CRISPR/Cas 對基因組進(jìn)行編輯的基礎(chǔ)。對基因組進(jìn)行編輯的基礎(chǔ)。 6768 Cas9： 體外實(shí)驗(yàn)證明體外實(shí)驗(yàn)證明

48、Cas9 基因是參與基因是參與CRISPR 免疫系統(tǒng)的唯一免疫系統(tǒng)的唯一必需基因必需基因, Cas9 是由是由1 409 個(gè)氨基酸組成的多結(jié)構(gòu)域蛋白個(gè)氨基酸組成的多結(jié)構(gòu)域蛋白, 含有含有2 個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域：氨基端的個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域：氨基端的RuvC-like 結(jié)構(gòu)域及位結(jié)構(gòu)域及位于蛋白中間位置的于蛋白中間位置的HNH 核酸酶結(jié)構(gòu)域核酸酶結(jié)構(gòu)域, HNH 核酸酶結(jié)構(gòu)核酸酶結(jié)構(gòu)域可以切割與域可以切割與crRNA 互補(bǔ)配對的模板鏈互補(bǔ)配對的模板鏈, 切割位點(diǎn)位于原切割位點(diǎn)位于原型間隔序列毗鄰基序型間隔序列毗鄰基序(Protospacer adjacent motif, PAM)上游上游3nt 處處,R

49、uvC-like 結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域可以對另一條鏈進(jìn)行切割可以對另一條鏈進(jìn)行切割, 切割位點(diǎn)位于切割位點(diǎn)位于PAM 上游上游38nt 處。在處。在crRNA 與與tracrRNA 形成的雙鏈形成的雙鏈RNA 的指導(dǎo)下的指導(dǎo)下, Cas9 蛋白對靶位點(diǎn)進(jìn)行切割。蛋白對靶位點(diǎn)進(jìn)行切割。 此外，他們還證明，將此外，他們還證明，將RuvC 或是或是HNH 活性突變后活性突變后Cas9 只有單鏈切割活性，類似于切口酶。只有單鏈切割活性，類似于切口酶。69到目前為止到目前為止, 雖然雖然CRISPR/Cas 系統(tǒng)的詳細(xì)作用機(jī)制尚未完全闡明系統(tǒng)的詳細(xì)作用機(jī)制尚未完全闡明, 但已基但已基本明確了該作用機(jī)制的整個(gè)過程

50、本明確了該作用機(jī)制的整個(gè)過程, 該過程大體分為該過程大體分為3 個(gè)階段個(gè)階段：1. 在噬菌體入侵的起始階段在噬菌體入侵的起始階段, Cas 蛋白復(fù)合物靶向并裂解噬菌體基因組中的蛋白復(fù)合物靶向并裂解噬菌體基因組中的原型間隔序列原型間隔序列(protospacer), protospacer接下來接下來整合整合到宿主基因組的到宿主基因組的CRISPR 位點(diǎn)的位點(diǎn)的5端端;2. 然后這些短的摻入的然后這些短的摻入的protospacer 被轉(zhuǎn)錄成被轉(zhuǎn)錄成crRNA;3. 最后階段是在最后階段是在Cas 蛋白蛋白復(fù)合物的參與下復(fù)合物的參與下, 靶向和干擾侵入的噬菌體靶向和干擾侵入的噬菌體DNA 序列。

51、序列。當(dāng)同種噬菌體再次入侵時(shí)當(dāng)同種噬菌體再次入侵時(shí), CRISPR的的repeats 序列截取和保留的入侵噬菌序列截取和保留的入侵噬菌體的某些體的某些DNA 片段形成片段形成spacers, spacers 會(huì)轉(zhuǎn)錄形成一些小的會(huì)轉(zhuǎn)錄形成一些小的crRNA, 這這些些crRNA 會(huì)與會(huì)與trans-activatingcrRNA(tracrRNA)形成一種雙鏈二級結(jié)構(gòu)形成一種雙鏈二級結(jié)構(gòu), 以此招募以此招募Cas 蛋白蛋白, crRNA、tracrRNA 以及以及Cas 蛋白形成復(fù)合體蛋白形成復(fù)合體, 識別緊隨識別緊隨protospacer 序列后的序列后的PAM 序列序列,Cas 蛋白蛋白的核

52、酸酶結(jié)構(gòu)域?qū)εc的核酸酶結(jié)構(gòu)域?qū)εccrRNA 互互補(bǔ)的補(bǔ)的雙鏈雙鏈DNA 進(jìn)行切割進(jìn)行切割, 從而使細(xì)菌具有對抗同類噬菌體再次入侵的能力。從而使細(xì)菌具有對抗同類噬菌體再次入侵的能力。CRISPR 基因座在沒有受到外界壓力的情況下表達(dá)水平很低，當(dāng)外源的質(zhì)?；蜃跊]有受到外界壓力的情況下表達(dá)水平很低，當(dāng)外源的質(zhì)粒或是噬菌體入侵宿主菌時(shí)或是噬菌體入侵宿主菌時(shí)CRISPR 的表達(dá)很快被誘導(dǎo)上調(diào)。的表達(dá)很快被誘導(dǎo)上調(diào)。 7071727374 噬菌體或是質(zhì)粒上與間隔序列對應(yīng)的序列被稱為噬菌體或是質(zhì)粒上與間隔序列對應(yīng)的序列被稱為protospacer，通常，通常protospacer 的的5或是或是3 端延

53、伸幾個(gè)端延伸幾個(gè)堿基序列很保守，堿基序列很保守， 被稱為被稱為PAM(protospacer adjacent motifs)，它的長度一般為，它的長度一般為25堿基，一般與堿基，一般與protospacer 相隔相隔14 堿基。堿基。 新間隔序列的獲得可能分為三步：首先識別入侵的核酸和新間隔序列的獲得可能分為三步：首先識別入侵的核酸和掃描外源掃描外源DNA 潛在的潛在的PAM，將，將臨近臨近PAM 的序列作為候選的序列作為候選protospacer；然后在；然后在CRISPR 基因座的基因座的5端端合成重復(fù)序合成重復(fù)序列列；最后新的間隔序列；最后新的間隔序列整合到整合到兩個(gè)重復(fù)序列之間。兩個(gè)

54、重復(fù)序列之間。75764. CRISPR/Cas 系統(tǒng)的應(yīng)用系統(tǒng)的應(yīng)用 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的作用特性與限制性核酸內(nèi)切酶相似，系統(tǒng)的作用特性與限制性核酸內(nèi)切酶相似，它對序列的特異性切割主要依賴于它對序列的特異性切割主要依賴于crRNA 與與Cas 蛋白形蛋白形成的核糖核蛋白復(fù)合物識別靶序列上的成的核糖核蛋白復(fù)合物識別靶序列上的PAM 以及以及protospacer 。 根據(jù)根據(jù)CRISPR/Cas 系統(tǒng)這一特性，將其用于設(shè)計(jì)人工的核系統(tǒng)這一特性，將其用于設(shè)計(jì)人工的核酸內(nèi)切酶酸內(nèi)切酶(engineered endonuclease，EEN)，用來對我，用來對我們感興趣的基因位點(diǎn)進(jìn)行修飾們感

55、興趣的基因位點(diǎn)進(jìn)行修飾 三類三類CRISPR/Cas 系統(tǒng)中系統(tǒng)中Type型系統(tǒng)的核糖核蛋白復(fù)型系統(tǒng)的核糖核蛋白復(fù)合物相對簡單，除合物相對簡單，除crRNA 和和tracrRNA 外，只有外，只有Cas9 一一個(gè)蛋白目前，產(chǎn)膿鏈球菌個(gè)蛋白目前，產(chǎn)膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes SF370)的的Type型系統(tǒng)是被改造的最為成功的人工核酸型系統(tǒng)是被改造的最為成功的人工核酸內(nèi)切酶，已經(jīng)在人類細(xì)胞、小鼠、斑馬魚中成功實(shí)現(xiàn)了基內(nèi)切酶，已經(jīng)在人類細(xì)胞、小鼠、斑馬魚中成功實(shí)現(xiàn)了基因組定點(diǎn)修飾。因組定點(diǎn)修飾。77784.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求系統(tǒng)靶向要求最主要的要求：最主要

56、的要求：PAM（protospacer-adjacent motif）為）為NGG。79 在人類基因組中，平均每在人類基因組中，平均每8bp就出現(xiàn)一個(gè)就出現(xiàn)一個(gè)NGG PAM。80814.2 Cas介導(dǎo)編輯模板替換介導(dǎo)編輯模板替換 2013年年1月月29日在日在nature biotechnology上發(fā)表的上發(fā)表的RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems一文中，作者利用一文中，作者利用CRISPR-Cas系系統(tǒng)用設(shè)計(jì)好的統(tǒng)用設(shè)計(jì)好的DNA模板替換的相應(yīng)基因來達(dá)到基因的定向模板替換的相應(yīng)基因來達(dá)到基因的定向

57、修飾。修飾。82834.3 Cas介導(dǎo)基因修飾介導(dǎo)基因修飾 2013年年1月月29日在日在nature biotechnology上發(fā)表的上發(fā)表的efficient genome editing in zebra fish using a CRISPR-Cas system一文中，作者利用人工合成的一文中，作者利用人工合成的sgRNAs能指導(dǎo)能指導(dǎo)Cas9內(nèi)源性核酸酶對斑馬魚胚胎基因進(jìn)行修飾。內(nèi)源性核酸酶對斑馬魚胚胎基因進(jìn)行修飾。848586NoImageCas9sg-RNA87 2013年年2月月15日在日在science上發(fā)表的上發(fā)表的Multiplex Genome Engineerin

58、g Using CRISPR/Cas Systems一文一文中，作者利用一個(gè)包含兩個(gè)靶向不同基因的中，作者利用一個(gè)包含兩個(gè)靶向不同基因的spacers的的crRNA實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對兩個(gè)基因進(jìn)行編輯。實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對兩個(gè)基因進(jìn)行編輯。4.4 Cas介導(dǎo)雙基因修飾介導(dǎo)雙基因修飾 88NoImage89NoImage5 CRISPR-Cas系統(tǒng)前景分析系統(tǒng)前景分析 這是一項(xiàng)靶向基因修飾的革新技術(shù)，一項(xiàng)極具有這是一項(xiàng)靶向基因修飾的革新技術(shù)，一項(xiàng)極具有可能獲得諾貝爾獎(jiǎng)技術(shù)?？赡塬@得諾貝爾獎(jiǎng)技術(shù)。90 2013年年4月月12日在日在cell stem cell上發(fā)表的上發(fā)表的Enhanced Efficiency

59、 of Human Pluripotent Stem Cell Genome Editing through Replacing TALENs with CRISPRs一文中，作者一文中，作者利用利用TALENs和和CRISPRs對同一基因進(jìn)行修飾，效率分別為對同一基因進(jìn)行修飾，效率分別為0%-34%和和51%-79%。91 而且從實(shí)際應(yīng)用的角度來說，而且從實(shí)際應(yīng)用的角度來說，CRISPRs比比TALENs更更容易操作，因?yàn)槊恳粚θ菀撞僮鳎驗(yàn)槊恳粚ALENs都需要重新合成，而用于都需要重新合成，而用于CRISPR的的gRNA只需要替換只需要替換20個(gè)核苷酸就行。個(gè)核苷酸就行。92u只需合成

60、一個(gè)只需合成一個(gè)sgRNA就能實(shí)現(xiàn)對基因的特異性修飾，就能實(shí)現(xiàn)對基因的特異性修飾，Cas蛋白不具特異性。蛋白不具特異性。u編碼編碼sgRNA的序列不超過的序列不超過100bp，因此比構(gòu)建，因此比構(gòu)建TALENs和和ZFNs更簡單方便。更簡單方便。u較短的較短的sgRNA序列也避免了超長、高度重復(fù)的序列也避免了超長、高度重復(fù)的TALENs編編碼載體帶來的并發(fā)癥。碼載體帶來的并發(fā)癥。u可以對任何后面緊隨可以對任何后面緊隨NGG(PAM)的的20 bp 的序列進(jìn)行編輯的序列進(jìn)行編輯; u能同時(shí)作用于多個(gè)靶位點(diǎn)；能同時(shí)作用于多個(gè)靶位點(diǎn)；技術(shù)優(yōu)勢93 CRISPRdb 和和CRISPI 是兩個(gè)專門收錄是