第三章固定化

1、Enzyme Engineering酶工程掌握固定化生物催化劑的概念以及吸附法、包埋法、共掌握固定化生物催化劑的概念以及吸附法、包埋法、共價(jià)結(jié)合法、無載體固定化酶的基本技術(shù)和原理。價(jià)結(jié)合法、無載體固定化酶的基本技術(shù)和原理。重點(diǎn)與難點(diǎn)重點(diǎn)與難點(diǎn)教學(xué)目的教學(xué)目的 1、固定化酶的NCF和CF的關(guān)系及其應(yīng)用；2、高效、高效固定化酶的原則；3、為什么包埋法在實(shí)際工作中廣泛應(yīng)用？它如何與交、為什么包埋法在實(shí)際工作中廣泛應(yīng)用？它如何與交聯(lián)法結(jié)合以改善缺點(diǎn)。聯(lián)法結(jié)合以改善缺點(diǎn)。課堂教學(xué)設(shè)計(jì)課堂教學(xué)設(shè)計(jì) 講授和自學(xué)相結(jié)合。自行比較總結(jié)各種固定化酶方講授和自學(xué)相結(jié)合。自行比較總結(jié)各種固定化酶方法的優(yōu)缺點(diǎn)。設(shè)計(jì)包埋

2、法或結(jié)合交聯(lián)法固定細(xì)胞的試驗(yàn)法的優(yōu)缺點(diǎn)。設(shè)計(jì)包埋法或結(jié)合交聯(lián)法固定細(xì)胞的試驗(yàn)方案。方案。教學(xué)時數(shù)教學(xué)時數(shù) 5學(xué)時學(xué)時思考題思考題固定化酶屬于修飾酶嗎？固定化與酶的化學(xué)修飾在方法上有何異同？固定化酶活力、穩(wěn)定性、專一性等特性發(fā)生了哪些改變？為什么？固定化酶的實(shí)際反應(yīng)速率不同于固有速率？原因何在？針對目前的研究現(xiàn)狀，你認(rèn)為可以從哪些角度來深入固定化酶技術(shù)的研究？請說明其理由。試述固定化生物催化劑的應(yīng)用。比較游離生物催化劑與固定化生物催化劑的應(yīng)用。設(shè)計(jì)固定化系統(tǒng)時，如何從載體、酶、方法三方面考慮？除了固定細(xì)胞、酶，還可以固定其他嗎？固定化酶活力的測定方法有哪些？簡要敘述每種方法。 生物催化的類型與生

3、物催化的類型與 方式方式n1 類型：n 含酶整細(xì)胞：生長細(xì)胞、休止細(xì)胞、凍 干細(xì)胞、處理或修飾細(xì)胞。n分離純化酶：細(xì)胞萃取液、純酶制劑、處理或修飾酶、多酶系統(tǒng)。n2 方式：游離狀態(tài)、固定化n3催化反應(yīng)相:水溶液、含有機(jī)溶劑的水溶液、n水-有機(jī)溶劑的雙相系統(tǒng)、有機(jī)溶液或水微溶有機(jī)溶液第三章第三章 固定化酶固定化酶n第一節(jié)第一節(jié) 概述概述n第二節(jié)第二節(jié) 固定化酶的性質(zhì)及其影響因素固定化酶的性質(zhì)及其影響因素n第三節(jié)第三節(jié) 固定化酶的制備固定化酶的制備n第四節(jié)第四節(jié) 固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞n第五節(jié)第五節(jié) 固定化輔酶和原生質(zhì)體固定化輔酶和原生質(zhì)體n第六節(jié)第六節(jié) 酶反應(yīng)器和固定化酶（細(xì)胞）酶反應(yīng)器和固定化酶

4、（細(xì)胞）的應(yīng)用的應(yīng)用什么是固定化酶？處于閉鎖狀態(tài)并能發(fā)揮催化作用的酶。水溶性酶水溶性酶水不溶性載體水不溶性載體水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技術(shù)固定化技術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 概述概述二二 固定化酶的優(yōu)缺點(diǎn)固定化酶的優(yōu)缺點(diǎn)n 多次使用多次使用 n 可以裝塔連續(xù)反應(yīng)可以裝塔連續(xù)反應(yīng)n優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 純化簡單純化簡單n 提高產(chǎn)物質(zhì)量提高產(chǎn)物質(zhì)量n 應(yīng)用范圍廣應(yīng)用范圍廣n缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 首次投入成本高首次投入成本高n 大分子底物較困難大分子底物較困難第一節(jié)結(jié)束第一節(jié)結(jié)束n點(diǎn)擊返回第二節(jié)第二節(jié) 固定化酶的性質(zhì)及其影響因素固定化酶的性質(zhì)及其影響因素n一一 影響固定化酶性質(zhì)的因素影響固定化酶性質(zhì)的

5、因素n二二 固定化后酶性質(zhì)的變化固定化后酶性質(zhì)的變化n三三 評價(jià)固定化酶的指標(biāo)評價(jià)固定化酶的指標(biāo)一一 影響固定化酶性質(zhì)的因素影響固定化酶性質(zhì)的因素1 酶本身的變化，主要是由于活性中酶本身的變化，主要是由于活性中心的氨基酸殘基、高級結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)心的氨基酸殘基、高級結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)等發(fā)生了變化。等發(fā)生了變化。一一 影響固定化酶性質(zhì)的因素影響固定化酶性質(zhì)的因素2 載體的影響載體的影響n（1） 分配效應(yīng)分配效應(yīng)n（2） 空間障礙效應(yīng)空間障礙效應(yīng)n（3） 擴(kuò)散限制效應(yīng)擴(kuò)散限制效應(yīng)3. 固定化方法的影響固定化方法的影響二二固定化后酶性質(zhì)的變化固定化后酶性質(zhì)的變化n1 固定化對酶活性的影響：酶活性下降，固定

6、化對酶活性的影響：酶活性下降，反應(yīng)速度下降反應(yīng)速度下降二二 固定化酶的性質(zhì)固定化酶的性質(zhì)2 固定化對酶穩(wěn)定性的影響固定化對酶穩(wěn)定性的影響n（1） 操作穩(wěn)定性提高操作穩(wěn)定性提高n（2） 貯存穩(wěn)定性比游離酶大多數(shù)提高。貯存穩(wěn)定性比游離酶大多數(shù)提高。n (3 ) 對熱穩(wěn)定性，大多數(shù)升高，有些反而降低。對熱穩(wěn)定性，大多數(shù)升高，有些反而降低。n (4 ) 對分解酶的穩(wěn)定性提高。對分解酶的穩(wěn)定性提高。n（5） 對變性劑的耐受力升高對變性劑的耐受力升高2 固定化后酶穩(wěn)定性提高的原因：固定化后酶穩(wěn)定性提高的原因：na. 固定化后酶分子與載體多點(diǎn)連接。固定化后酶分子與載體多點(diǎn)連接。nb. 酶活力的釋放是緩慢的。

7、酶活力的釋放是緩慢的。nc. 抑制自降解，提高了酶穩(wěn)定性。抑制自降解，提高了酶穩(wěn)定性。3 pH的變化的變化nPH對酶活性的影響：對酶活性的影響：n（1） 改變酶的空間構(gòu)象改變酶的空間構(gòu)象n（2）影響酶的催化基團(tuán)的解離）影響酶的催化基團(tuán)的解離n（3）影響酶的結(jié)合基團(tuán)的解離）影響酶的結(jié)合基團(tuán)的解離n（4）改變底物的解離狀態(tài)，酶與底物不能結(jié)合或結(jié)合后）改變底物的解離狀態(tài)，酶與底物不能結(jié)合或結(jié)合后不能生成產(chǎn)物。不能生成產(chǎn)物。固定化酶固定化酶pH的變化的變化n1） 載體帶負(fù)電荷，載體帶負(fù)電荷，pH向堿性方向移動向堿性方向移動。 n微環(huán)境微環(huán)境是指在固定化酶附近的局部環(huán)境，而把主體溶是指在固定化酶附近的局

8、部環(huán)境，而把主體溶液稱為液稱為宏觀環(huán)境。宏觀環(huán)境。3固定化酶固定化酶pH的變化的變化n載體帶正電荷，載體帶正電荷，pH向酸性方向移動。向酸性方向移動。n（2）產(chǎn)物性質(zhì)對）產(chǎn)物性質(zhì)對pH的影響的影響n催化反應(yīng)的產(chǎn)物為酸性時，固定化酶的催化反應(yīng)的產(chǎn)物為酸性時，固定化酶的pH值比游離酶的值比游離酶的pH值高；反之則低值高；反之則低4 最適溫度變化最適溫度變化n一般與游離酶差不多，但有些會有較明顯的變化。一般與游離酶差不多，但有些會有較明顯的變化。n5 底物特異性變化底物特異性變化n作用于低分子底物的酶作用于低分子底物的酶 特異性沒有明顯變化特異性沒有明顯變化n既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物

9、的酶既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特異性往往會變化。特異性往往會變化。6 米氏常數(shù)米氏常數(shù)Km的變化，的變化，Km值隨載體性質(zhì)變化值隨載體性質(zhì)變化由于分配效應(yīng)：由于分配效應(yīng)：=Si=Si微環(huán)境微環(huán)境/S/S宏觀環(huán)境宏觀環(huán)境 Km=Km/(Km=Km/(表觀米氏常數(shù)表觀米氏常數(shù)) )n（1 1） 載體與底物帶相同電荷，載體與底物帶相同電荷，SiS,KmSiS,Km固定化酶降低了酶的親和力。固定化酶降低了酶的親和力。n（2 2） 載體與底物電荷相反，靜電作用，載體與底物電荷相反，靜電作用，SiSSiS，則，則1,Km1,KmKm米氏方程推導(dǎo)米氏方程推導(dǎo)n對簡單的固定化酶系統(tǒng)，其動力

10、學(xué)性質(zhì)一般服從米對簡單的固定化酶系統(tǒng)，其動力學(xué)性質(zhì)一般服從米氏方程：氏方程： 三三 評價(jià)固定化酶的指標(biāo)：評價(jià)固定化酶的指標(biāo)：n1 酶活定義（酶活定義（IU)：在特定條件下，每一分鐘催化一個：在特定條件下，每一分鐘催化一個微摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定義為微摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定義為1個酶活單位。個酶活單位。n 計(jì)量單位計(jì)量單位n2. 酶比活定義（游離）：每毫克酶蛋白或酶酶比活定義（游離）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的酶活力單位所具有的酶活力單位 品質(zhì)的體現(xiàn)品質(zhì)的體現(xiàn)三三 評價(jià)固定化酶的指標(biāo)：評價(jià)固定化酶的指標(biāo)：n1. 固定化酶的比活：固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶每

11、（克）干固定化酶所具有的酶活力單位?；盍挝弧 或：單位面積（或：單位面積（cm2）的酶活力單位表示）的酶活力單位表示（酶膜、酶管、酶板）。（酶膜、酶管、酶板）。n2. 操作半衰期操作半衰期：衡量穩(wěn)定性的指標(biāo)。衡量穩(wěn)定性的指標(biāo)。 連續(xù)測活條件下固定化酶活力下降為最初活力一半所需連續(xù)測活條件下固定化酶活力下降為最初活力一半所需要的時間（要的時間（t1/2）三三 評價(jià)固定化酶的指標(biāo)：評價(jià)固定化酶的指標(biāo)：n3. n4. n或稱偶聯(lián)效率，活力保留百分?jǐn)?shù)?；蚍Q偶聯(lián)效率，活力保留百分?jǐn)?shù)。n5.相對酶活力：相對酶活力：具有相同酶蛋白（或具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力與）量的固定化酶活力與游離酶

12、活力的比值稱為相對酶活力游離酶活力的比值稱為相對酶活力n 四四 固定化酶的活力測定方法介紹固定化酶的活力測定方法介紹n1. 振蕩測定法：稱取一定量的固定化酶振蕩測定法：稱取一定量的固定化酶 加入一定量的底物溶加入一定量的底物溶液，液， 一邊振蕩或攪拌，一邊進(jìn)行催化反應(yīng)一邊振蕩或攪拌，一邊進(jìn)行催化反應(yīng) 取出一定量的反取出一定量的反應(yīng)液進(jìn)行酶活力測定。應(yīng)液進(jìn)行酶活力測定。n2. 酶柱測定法：將一定量的固定化酶裝進(jìn)具有恒溫裝置的反應(yīng)柱中酶柱測定法：將一定量的固定化酶裝進(jìn)具有恒溫裝置的反應(yīng)柱中 讓底物溶液以一定的流速流過酶柱讓底物溶液以一定的流速流過酶柱 收集流出的反應(yīng)液收集流出的反應(yīng)液 測測定其中產(chǎn)

13、物的生成量或底物的消耗量定其中產(chǎn)物的生成量或底物的消耗量 四四 固定化酶的活力測定方法介紹固定化酶的活力測定方法介紹n3. 連續(xù)測定法連續(xù)測定法n利用連續(xù)分光光度法等測定方法可以對固定化酶利用連續(xù)分光光度法等測定方法可以對固定化酶反應(yīng)液進(jìn)行連續(xù)測定，從而測定固定化酶的酶活反應(yīng)液進(jìn)行連續(xù)測定，從而測定固定化酶的酶活力。力。n 第二節(jié)第二節(jié)固定化酶的性質(zhì)及其影響因素提要固定化酶的性質(zhì)及其影響因素提要n影響固定化酶性質(zhì)的因素n固定化酶的性質(zhì)n評價(jià)固定化酶的指標(biāo) 酶本身的變化載體的影響固定化對酶活性的影響固定化對酶穩(wěn)定性的影響最適pH的變化最適溫度變化底物特異性與游離酶不同米氏常數(shù)Km的變化評價(jià)指標(biāo)活

14、力測定方法第二節(jié)結(jié)束第二節(jié)結(jié)束n點(diǎn)擊返回第三節(jié)第三節(jié) 固定化酶的制備固定化酶的制備n一一 一般方法及特點(diǎn)一般方法及特點(diǎn)n二二 酶的固定化方法酶的固定化方法一一 一般方法及特點(diǎn)一般方法及特點(diǎn)關(guān)鍵在于選擇適當(dāng)?shù)墓潭ɑ椒ê捅匾妮d體以及穩(wěn)定性關(guān)鍵在于選擇適當(dāng)?shù)墓潭ɑ椒ê捅匾妮d體以及穩(wěn)定性研究、改進(jìn)。研究、改進(jìn)。1 四大類方法：四大類方法：n吸附法（包括電吸附法）吸附法（包括電吸附法）n結(jié)合法（無機(jī)多孔材料）結(jié)合法（無機(jī)多孔材料）n交聯(lián)法（雙功能試劑）交聯(lián)法（雙功能試劑） n包埋法（微膠囊法）包埋法（微膠囊法） 各類固定化方法的特點(diǎn)比較各類固定化方法的特點(diǎn)比較: 比較項(xiàng)目比較項(xiàng)目吸附法吸附法結(jié)合

15、法結(jié)合法 交聯(lián)法交聯(lián)法包埋法包埋法物理吸附物理吸附.共價(jià)鍵結(jié)合共價(jià)鍵結(jié)合離子鍵結(jié)合離子鍵結(jié)合 制備難易制備難易易易難難易易 較難較難較難較難固定化程度固定化程度弱弱強(qiáng)強(qiáng)中等中等 強(qiáng)強(qiáng)強(qiáng)強(qiáng)活力回收率活力回收率較高較高低低高高 中等中等高高載體再生載體再生可能可能不可能不可能可能可能 不可能不可能不可能不可能費(fèi)用費(fèi)用低低高高低低 中等中等低低底物專一性底物專一性不變不變可變可變不變不變 可變可變不變不變適用性適用性酶源多酶源多較廣較廣廣泛廣泛 較廣較廣小分子底物、小分子底物、藥用酶藥用酶2 選擇方法依據(jù)：選擇方法依據(jù)： n（1） 酶的性質(zhì)酶的性質(zhì)n（2） 載體的性質(zhì)載體的性質(zhì)n（3） 制備方法的選

16、擇制備方法的選擇3 固定化后酶的考察項(xiàng)目：固定化后酶的考察項(xiàng)目：n（1） 測定固定化酶的活力，以確定固定化測定固定化酶的活力，以確定固定化過過n程的活力回收率。程的活力回收率。n（2） 考察固定化酶穩(wěn)定性考察固定化酶穩(wěn)定性n（ 2） 考察固定化酶最適反應(yīng)條件考察固定化酶最適反應(yīng)條件二二 酶的固定化方法酶的固定化方法n（一）（一） 吸附法吸附法n（二）結(jié)合法（二）結(jié)合法n（三）交聯(lián)法（三）交聯(lián)法n（四）（四） 包埋法（包埋法（entrapping method）酶和細(xì)胞固定化示意圖酶和細(xì)胞固定化示意圖（一）（一） 吸附法吸附法n1 物理吸附：物理吸附：利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體利用各種固體

17、吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上。吸附在其表面上。n（一）（一） 吸附法吸附法n常用載體：常用載體：n無機(jī)載體：氧化鋁、活性碳、皂土、硅藻土、金屬氧化無機(jī)載體：氧化鋁、活性碳、皂土、硅藻土、金屬氧化物、硅膠。一般吸附量物、硅膠。一般吸附量120.3-615營養(yǎng)要求營養(yǎng)要求簡單簡單簡單簡單復(fù)雜復(fù)雜光照要求光照要求大多數(shù)要光照大多數(shù)要光照不要求不要求不要求不要求對剪切力對剪切力敏感敏感大多數(shù)不敏感大多數(shù)不敏感敏感敏感主要產(chǎn)物主要產(chǎn)物色素、藥物、香色素、藥物、香精、酶等精、酶等醇、有機(jī)酸、氨基醇、有機(jī)酸、氨基酸、抗生素、核酸、抗生素、核苷酸、酶苷酸、酶疫苗、激素、疫苗、激素、抗體、酶抗體、酶固定化

18、細(xì)胞的特點(diǎn)固定化細(xì)胞的特點(diǎn)n類型：類型：n生理狀態(tài)：生理狀態(tài)：n形狀：形狀：n使用周期：理論上講，固定化增殖細(xì)胞保持了細(xì)胞原有的全部活性，使用周期：理論上講，固定化增殖細(xì)胞保持了細(xì)胞原有的全部活性， 只要載體不解體，不污染就可以長期使用。只要載體不解體，不污染就可以長期使用。概念：概念：n固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動的細(xì)固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動的細(xì)胞稱為固定化細(xì)胞胞稱為固定化細(xì)胞.該細(xì)胞能進(jìn)行正常的生長、繁殖和新該細(xì)胞能進(jìn)行正常的生長、繁殖和新陳代謝，又稱固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞。陳代謝，又稱固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞。細(xì)胞固定化方法細(xì)胞固定化方法n吸

19、附法n包埋法吸附法吸附法n它主要通過載體與細(xì)胞間的靜電引力，即細(xì)它主要通過載體與細(xì)胞間的靜電引力，即細(xì)胞表面與載體之間范德華作用力，離子鍵和胞表面與載體之間范德華作用力，離子鍵和氫鍵作用力，才使細(xì)胞固定在載體上的。氫鍵作用力，才使細(xì)胞固定在載體上的。 影響吸附法的主要因素影響吸附法的主要因素 n（1）Z-電位：電位： Z-電位能近似地代表表面電荷密度的大電位能近似地代表表面電荷密度的大小小n（2）細(xì)胞的性質(zhì)和細(xì)胞壁的組成：細(xì)胞壁的電荷性質(zhì)）細(xì)胞的性質(zhì)和細(xì)胞壁的組成：細(xì)胞壁的電荷性質(zhì)n（3）載體的性質(zhì)：特別是玻璃、陶瓷等無機(jī)材料）載體的性質(zhì)：特別是玻璃、陶瓷等無機(jī)材料包埋固定法包埋固定法 n包理

20、法是在細(xì)胞自身并不與凝膠基體發(fā)生化學(xué)鍵包理法是在細(xì)胞自身并不與凝膠基體發(fā)生化學(xué)鍵合的情況下將其包埋在半透性聚合物顆粒（或膜）合的情況下將其包埋在半透性聚合物顆粒（或膜）內(nèi)的一種固定化方法。包埋法的最大優(yōu)點(diǎn)是能較內(nèi)的一種固定化方法。包埋法的最大優(yōu)點(diǎn)是能較好的保持細(xì)胞內(nèi)多酶系統(tǒng)的活力，可象游離細(xì)胞好的保持細(xì)胞內(nèi)多酶系統(tǒng)的活力，可象游離細(xì)胞那樣進(jìn)行產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)。那樣進(jìn)行產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)。 包埋法分類包埋法分類n常用載體：瓊脂、海藻酸鈣、角叉菜常用載體：瓊脂、海藻酸鈣、角叉菜膠、明膠、聚丙烯酰胺膠、明膠、聚丙烯酰胺n常用凝膠包埋法常用凝膠包埋法通過改變載體溶液參數(shù)包埋細(xì)胞通過改變載體溶液參數(shù)包埋細(xì)胞

21、n改變載體溶液、操作溫度、鹽濃度、改變載體溶液、操作溫度、鹽濃度、pH值和值和溶劑等參數(shù)時，亦可使其轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀態(tài)，溶劑等參數(shù)時，亦可使其轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀態(tài)，將細(xì)胞包埋其中。將細(xì)胞包埋其中。研究熱點(diǎn)研究熱點(diǎn)光交聯(lián)樹脂包埋法光交聯(lián)樹脂包埋法 n例：相對分子量為例：相對分子量為1000-3000的光交聯(lián)聚氨酯預(yù)聚物等，的光交聯(lián)聚氨酯預(yù)聚物等，加入加入1%左右的光敏劑，加水配成一定濃度，加熱至左右的光敏劑，加水配成一定濃度，加熱至50，然后與一定濃度的細(xì)胞懸浮液混合均勻，攤成一定厚度然后與一定濃度的細(xì)胞懸浮液混合均勻，攤成一定厚度的薄層，用紫外照射的薄層，用紫外照射3min，就可制得，就可制得第四節(jié)固定

22、化細(xì)胞提要第四節(jié)固定化細(xì)胞提要n特點(diǎn)n方法n目的第四節(jié)結(jié)束第四節(jié)結(jié)束n點(diǎn)擊返回第五節(jié)第五節(jié) 固定化原生質(zhì)體和輔酶固定化原生質(zhì)體和輔酶n一一 原生質(zhì)體固定化的方法原生質(zhì)體固定化的方法n制備原生質(zhì)體制備原生質(zhì)體將原生質(zhì)體重新懸浮在含有滲透壓穩(wěn)將原生質(zhì)體重新懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的緩沖液中配成原生質(zhì)體懸浮液定劑的緩沖液中配成原生質(zhì)體懸浮液包埋法固定化包埋法固定化原生質(zhì)體。原生質(zhì)體。n關(guān)鍵：原生質(zhì)體如何制備？關(guān)鍵：原生質(zhì)體如何制備？二二 原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體的制備n將對數(shù)生長期的細(xì)胞收集將對數(shù)生長期的細(xì)胞收集懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的高滲緩沖液中的高滲緩沖液中去細(xì)胞壁去細(xì)胞壁分離

23、純化分離純化得到原得到原生質(zhì)體生質(zhì)體-活性鑒定活性鑒定三三 酶解注意要點(diǎn)酶解注意要點(diǎn)n1 酶解前要預(yù)處理：主要是為了使酶滲透到細(xì)胞器中去。酶解前要預(yù)處理：主要是為了使酶滲透到細(xì)胞器中去。n采取的策略：先加入物質(zhì)抑制或阻止某種細(xì)胞壁的成分采取的策略：先加入物質(zhì)抑制或阻止某種細(xì)胞壁的成分合成，可以使酶插入。合成，可以使酶插入。n一般加入：巰基乙醇，一般加入：巰基乙醇，Triton-100,甘氨酸、青霉素。甘氨酸、青霉素。三三 酶解注意要點(diǎn)酶解注意要點(diǎn)n2 酶系選擇：酶系選擇：n溶菌酶溶菌酶n蝸牛酶蝸牛酶n葡聚糖酶葡聚糖酶n纖維素、半纖維素、和果膠酶纖維素、半纖維素、和果膠酶n3 酶濃度選擇（酶濃度

24、選擇（0.5%-1%）三三 酶解注意要點(diǎn)酶解注意要點(diǎn)n4 酶解溫度和酶解溫度和pHn5 酶解終點(diǎn)確定酶解終點(diǎn)確定四四 穩(wěn)定劑（高滲溶液）要求穩(wěn)定劑（高滲溶液）要求n1 加入的化合物對細(xì)胞和原生質(zhì)體無毒性加入的化合物對細(xì)胞和原生質(zhì)體無毒性n2 不會影響水解酶的活性不會影響水解酶的活性n3 對代謝產(chǎn)物無不良影響對代謝產(chǎn)物無不良影響四四 穩(wěn)定劑加入操作注意點(diǎn)穩(wěn)定劑加入操作注意點(diǎn)n1一定一定pH （酶和菌體活性最高）（酶和菌體活性最高） n2一定的濃度（過高濃度原生質(zhì)體易脫水皺縮）一定的濃度（過高濃度原生質(zhì)體易脫水皺縮）n3種類：無機(jī)鹽種類：無機(jī)鹽-對細(xì)菌對細(xì)菌n 有機(jī)物糖和糖醇有機(jī)物糖和糖醇-酵母酵

25、母n4易于滲入質(zhì)膜、易于被原生質(zhì)體和菌體分解的物質(zhì)易于滲入質(zhì)膜、易于被原生質(zhì)體和菌體分解的物質(zhì)不宜作為穩(wěn)定劑不宜作為穩(wěn)定劑五五 原生質(zhì)體細(xì)胞活性的檢測原生質(zhì)體細(xì)胞活性的檢測n1 熒光素雙醋酸鹽（熒光素雙醋酸鹽（FDA) 染色法染色法n2 酚藏花紅染色法酚藏花紅染色法n3 伊文思蘭染色法伊文思蘭染色法四四 輔酶固定化輔酶固定化n1 原因原因n有機(jī)輔因子中具有某些特殊的化學(xué)基團(tuán)，參與酶的催化反應(yīng)有機(jī)輔因子中具有某些特殊的化學(xué)基團(tuán)，參與酶的催化反應(yīng)(遞氫、遞氫、遞電子或遞某些化學(xué)基團(tuán)的作用）遞電子或遞某些化學(xué)基團(tuán)的作用）n有機(jī)輔因子在使用過程中要流失，并且不能自行再生有機(jī)輔因子在使用過程中要流失，并

26、且不能自行再生n有機(jī)輔因子價(jià)格昂貴有機(jī)輔因子價(jià)格昂貴n工業(yè)上應(yīng)用全酶的關(guān)鍵是有機(jī)輔因子的保留和再生工業(yè)上應(yīng)用全酶的關(guān)鍵是有機(jī)輔因子的保留和再生輔酶固定化的方法：輔酶固定化的方法：n2 固定化方法與酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亞胺法以及重氮固定化方法與酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亞胺法以及重氮偶聯(lián)法等共價(jià)偶聯(lián)，或?qū)⑵溥M(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾后固定在超濾器中。偶聯(lián)法等共價(jià)偶聯(lián)，或?qū)⑵溥M(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾后固定在超濾器中。n3 輔酶固定化必須解決輔酶在多個酶之間傳遞的障礙。輔酶固定化必須解決輔酶在多個酶之間傳遞的障礙。n策略：先在輔酶的一定部位進(jìn)行修飾策略：先在輔酶的一定部位進(jìn)行修飾-引入功能團(tuán)和間隔臂

27、（形成輔引入功能團(tuán)和間隔臂（形成輔酶衍生物）酶衍生物）- 再與水溶性高分子結(jié)合再與水溶性高分子結(jié)合輔酶的固定化輔酶的固定化輔酶的固定化輔酶的固定化輔酶再生的形式：輔酶再生的形式：n輔酶和酶共固定輔酶和酶共固定與酶分子偶聯(lián)成輔酶與酶分子偶聯(lián)成輔酶-酶復(fù)合物酶復(fù)合物第五節(jié)第五節(jié) 固定化原生質(zhì)體和輔酶的固定化固定化原生質(zhì)體和輔酶的固定化n原生質(zhì)體n輔酶固定化 方法固定化要點(diǎn)原因方法形式第五節(jié)結(jié)束第五節(jié)結(jié)束n點(diǎn)擊返回第六節(jié)第六節(jié) 酶反應(yīng)器和固定化酶（細(xì)胞）的應(yīng)用酶反應(yīng)器和固定化酶（細(xì)胞）的應(yīng)用 n 酶反應(yīng)器介紹酶反應(yīng)器介紹n 酶反應(yīng)器的選擇和應(yīng)用酶反應(yīng)器的選擇和應(yīng)用n 固定化酶和細(xì)胞的應(yīng)用固定化酶和細(xì)

28、胞的應(yīng)用生物催化反應(yīng)器工程生物催化反應(yīng)器工程n通過反應(yīng)器型式、操作方式的改變能通過反應(yīng)器型式、操作方式的改變能否使生物催化反應(yīng)效率最大化否使生物催化反應(yīng)效率最大化？n將反應(yīng)與傳質(zhì)緊密相關(guān)將反應(yīng)與傳質(zhì)緊密相關(guān) 一酶反應(yīng)器。一酶反應(yīng)器。n 分批攪拌反應(yīng)器。分批攪拌反應(yīng)器。n攪拌罐型攪拌罐型n 連續(xù)流攪拌桶反應(yīng)器。連續(xù)流攪拌桶反應(yīng)器。n固定床型固定床型 （填充床反應(yīng)器）（填充床反應(yīng)器）n流化床反應(yīng)器流化床反應(yīng)器n連續(xù)攪拌桶連續(xù)攪拌桶-超濾反應(yīng)器超濾反應(yīng)器n循環(huán)反應(yīng)器循環(huán)反應(yīng)器n膜式反應(yīng)器膜式反應(yīng)器n鼓泡塔型鼓泡塔型 分批攪拌反應(yīng)器分批攪拌反應(yīng)器n反應(yīng)器結(jié)構(gòu)簡單，不需要特殊裝置，適與小反應(yīng)器結(jié)構(gòu)簡單，

29、不需要特殊裝置，適與小規(guī)模試驗(yàn)規(guī)模試驗(yàn) 連續(xù)流攪拌桶反應(yīng)器連續(xù)流攪拌桶反應(yīng)器n連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器 填充床反應(yīng)器填充床反應(yīng)器n旋轉(zhuǎn)填充床流化床反應(yīng)器流化床反應(yīng)器n與連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器類似，是讓適量與連續(xù)流攪拌桶式反應(yīng)器類似，是讓適量的顆粒狀酶懸浮于反應(yīng)床中，不用攪拌器，的顆粒狀酶懸浮于反應(yīng)床中，不用攪拌器，而是底物向上流過固定酶床，因此流速要而是底物向上流過固定酶床，因此流速要適當(dāng)控制。適當(dāng)控制。 循環(huán)反應(yīng)器循環(huán)反應(yīng)器n高效內(nèi)循環(huán)生物反應(yīng)器（HCR） 連續(xù)攪拌桶連續(xù)攪拌桶-超濾反應(yīng)器超濾反應(yīng)器膜式反應(yīng)器膜式反應(yīng)器n定義：由膜狀或板狀固定化酶或固定化微生物組裝的反定義：由膜狀或板狀固定化酶或固定

30、化微生物組裝的反應(yīng)器均稱為膜式反應(yīng)器。應(yīng)器均稱為膜式反應(yīng)器。n類型：直接接觸式酶膜反應(yīng)器、擴(kuò)散型膜反應(yīng)器和多相類型：直接接觸式酶膜反應(yīng)器、擴(kuò)散型膜反應(yīng)器和多相酶膜反應(yīng)器。酶膜反應(yīng)器。膜式反應(yīng)器膜式反應(yīng)器n采用聚砜中空纖維膜反應(yīng)器固定淀粉酶可控制淀粉水解，采用聚砜中空纖維膜反應(yīng)器固定淀粉酶可控制淀粉水解，制備糊精。制備糊精。鼓泡塔型反應(yīng)器鼓泡塔型反應(yīng)器n適用對象：反應(yīng)中涉及氣體的吸收或產(chǎn)生時適用。適用對象：反應(yīng)中涉及氣體的吸收或產(chǎn)生時適用。n氣體進(jìn)入方式：氣體進(jìn)入方式：n與底物一起從底部進(jìn)入，經(jīng)過氣體分散板分散。與底物一起從底部進(jìn)入，經(jīng)過氣體分散板分散。n和循環(huán)液從底部以切線方向進(jìn)入。和循環(huán)液從

31、底部以切線方向進(jìn)入。生物催化反應(yīng)分離耦合反應(yīng)器生物催化反應(yīng)分離耦合反應(yīng)器Diagram of the enzymatic synthesis of cefaclor with in situ product removal. (1) Complexation reactor, (2) enzymatic reaction reactor, (3) peristaltic pump, (4) sintered-glass (G2), (5) mechanical stirrer.0102030405060024681012Time (h)Concentration (mmoldm-3)7ACCA

32、 without ISPRcefaclor without ISPR7-ACCA with ISPRcefaclor with ISPR產(chǎn)物在線分離策略實(shí)現(xiàn)頭孢克羅半連續(xù)制備產(chǎn)物在線分離策略實(shí)現(xiàn)頭孢克羅半連續(xù)制備01020304050600102030405060Time (h)7-ACCA (mM)Journal of Molecular Catalysis, 17(2):81-87, 2003. Biotechnology Letters, 2003, 25 (14): 1195-1198. J. Molecular Catalysis B: Enzymatic,2003,26 (1-2)

33、:99-104. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2004, 79:480-485. 減壓式反應(yīng)器用于生物催化反應(yīng)中易揮發(fā)產(chǎn)物的在線去除Wei Dongzhi*, Yu ying, Biocatalysis and Biotransformation, 2003,21(3)135-139. 生物催化合成油酸乙基葡萄糖苷酯生物催化合成油酸乙基葡萄糖苷酯減壓式反應(yīng)器用減壓式反應(yīng)器用常規(guī)反應(yīng)器用常規(guī)反應(yīng)器用反應(yīng)器選擇反應(yīng)器選擇n酶的形式：酶的形式： 溶液酶溶液酶n 顆粒狀或片狀固定化酶顆粒狀或片狀固定化酶n 膜狀和纖維狀固定化酶膜狀

34、和纖維狀固定化酶n底物的物理性質(zhì)：溶解性、顆粒物質(zhì)和膠體物質(zhì)底物的物理性質(zhì)：溶解性、顆粒物質(zhì)和膠體物質(zhì)n反應(yīng)操作要求反應(yīng)操作要求n酶的穩(wěn)定性酶的穩(wěn)定性n應(yīng)用和可塑性和成本應(yīng)用和可塑性和成本酶反應(yīng)器的應(yīng)用酶反應(yīng)器的應(yīng)用n控制酶反應(yīng)器液態(tài)流動方式控制酶反應(yīng)器液態(tài)流動方式n反應(yīng)器中流動方式的改變會使酶與底物的接觸不良，造成反應(yīng)器生反應(yīng)器中流動方式的改變會使酶與底物的接觸不良，造成反應(yīng)器生產(chǎn)能力降低。產(chǎn)能力降低。n流動方式改變造成反混程度的變化，會發(fā)生程度不同的反應(yīng)或副反流動方式改變造成反混程度的變化，會發(fā)生程度不同的反應(yīng)或副反應(yīng)。應(yīng)。n物料粒子進(jìn)入反應(yīng)器后所經(jīng)歷的時間稱為粒子的年齡。粒子離開反物料粒

35、子進(jìn)入反應(yīng)器后所經(jīng)歷的時間稱為粒子的年齡。粒子離開反應(yīng)器時的年齡稱為停留時間。應(yīng)器時的年齡稱為停留時間。n反應(yīng)器內(nèi)不同年齡的粒子間的混合稱為反混。反應(yīng)器內(nèi)不同年齡的粒子間的混合稱為反混。酶反應(yīng)器的應(yīng)用酶反應(yīng)器的應(yīng)用n酶反應(yīng)器對底物恒定轉(zhuǎn)化酶反應(yīng)器對底物恒定轉(zhuǎn)化n目的：反應(yīng)器能平穩(wěn)的進(jìn)行工作，有利于實(shí)現(xiàn)自控操作目的：反應(yīng)器能平穩(wěn)的進(jìn)行工作，有利于實(shí)現(xiàn)自控操作n方法：控制底物流速方法：控制底物流速n國外熱點(diǎn)：將固定化酶反應(yīng)器串聯(lián)或并聯(lián)操作國外熱點(diǎn)：將固定化酶反應(yīng)器串聯(lián)或并聯(lián)操作。酶反應(yīng)器的應(yīng)用酶反應(yīng)器的應(yīng)用n保持酶反應(yīng)器的穩(wěn)定性：保持酶反應(yīng)器的穩(wěn)定性：n防止酶變性、中毒、自溶或載體磨損。防止酶變性

36、、中毒、自溶或載體磨損。n防止酶反應(yīng)器中微生物污染防止酶反應(yīng)器中微生物污染n向底物中加入殺菌、抑菌物質(zhì)，或有機(jī)溶劑向底物中加入殺菌、抑菌物質(zhì)，或有機(jī)溶劑n底物物料預(yù)先除菌底物物料預(yù)先除菌n在在45度以上環(huán)境中或酸、堿緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)度以上環(huán)境中或酸、堿緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)n酶反應(yīng)器每次用后消毒酶反應(yīng)器每次用后消毒二固定化酶（細(xì)胞）的應(yīng)用二固定化酶（細(xì)胞）的應(yīng)用n1 固定化酶（細(xì)胞）在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用固定化酶（細(xì)胞）在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用n2 固定化酶在醫(yī)藥治療上的應(yīng)用固定化酶在醫(yī)藥治療上的應(yīng)用n3 固定化酶在分析化學(xué)中應(yīng)用固定化酶在分析化學(xué)中應(yīng)用n4 固定化酶和親和色譜固定化酶和親和色譜n5 固定

37、化酶與環(huán)境保護(hù)固定化酶與環(huán)境保護(hù)n6 新能源開發(fā)中的應(yīng)用新能源開發(fā)中的應(yīng)用n7 固定化酶在基礎(chǔ)理論研究中應(yīng)用固定化酶在基礎(chǔ)理論研究中應(yīng)用1 固定化酶（細(xì)胞）在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用固定化酶（細(xì)胞）在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用n葡萄糖異構(gòu)酶葡萄糖異構(gòu)酶世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的一種固定化酶。世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的一種固定化酶。n用吸附法、結(jié)合法、凝膠包埋法等進(jìn)行固定化。用吸附法、結(jié)合法、凝膠包埋法等進(jìn)行固定化。n n 葡萄糖異構(gòu)酶葡萄糖異構(gòu)酶n葡萄糖葡萄糖 果糖果糖 果葡糖漿果葡糖漿固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用n聚丙烯酰胺凝膠包埋含有延胡索酸酶的產(chǎn)氨短桿聚丙烯酰胺凝膠包埋含有延胡索酸酶的產(chǎn)氨

38、短桿菌菌體，制得固定化延胡索酸酶。工業(yè)化生產(chǎn)菌菌體，制得固定化延胡索酸酶。工業(yè)化生產(chǎn)L-蘋果酸蘋果酸n利用固定化乳糖酶可以連續(xù)生產(chǎn)低乳糖奶利用固定化乳糖酶可以連續(xù)生產(chǎn)低乳糖奶n固定化酵母細(xì)胞等微生物可用于生產(chǎn)各種酒類固定化酵母細(xì)胞等微生物可用于生產(chǎn)各種酒類固定化原生質(zhì)體的應(yīng)用固定化原生質(zhì)體的應(yīng)用n研究中：研究中：n固定后化枯草桿菌原生質(zhì)體生產(chǎn)堿性磷酸酶，使原來存在于細(xì)胞中固定后化枯草桿菌原生質(zhì)體生產(chǎn)堿性磷酸酶，使原來存在于細(xì)胞中的堿性磷酸酶，全部分泌到發(fā)酵液中，提高產(chǎn)率的堿性磷酸酶，全部分泌到發(fā)酵液中，提高產(chǎn)率36%，可連續(xù)使用，可連續(xù)使用37天。天。2 固定化酶在醫(yī)藥治療上的應(yīng)用固定化酶在醫(yī)

39、藥治療上的應(yīng)用n例例1n固定化青霉素?；福灰淖児潭ɑ嗝顾仵；福灰淖僷H值等條件，就既可以值等條件，就既可以催化青霉素或頭孢菌素水解生成催化青霉素或頭孢菌素水解生成6-氨基青霉烷酸酸或氨基青霉烷酸酸或7-氨基頭孢霉烷酸氨基頭孢霉烷酸n也可以催化也可以催化6-APA或或7-ACA與其他的羧酸衍生物進(jìn)行反與其他的羧酸衍生物進(jìn)行反應(yīng)應(yīng)n合成新的具有不同惻鏈基團(tuán)的青霉素或頭孢霉素合成新的具有不同惻鏈基團(tuán)的青霉素或頭孢霉素青霉素?；复呋铣深^孢類抗生素青霉素酰化酶催化合成頭孢類抗生素OH2NR2R1NH2NSOOOHNR1NH2NSOOO OHH1: D-(-)-PGA (R1 = H,

40、R2 = NH2)2: D-(-)-PGM (RI = H, R2 = OMe)3. D-(-)-HPGA (R1 = OH, R2 = NH2)4: D-(-)-HPGM (R1 = H, R2 = OMeH2OPenicillin G acylase+Ampicillin (RI = H)Amoxicillin (R1 = OH) 7-ACA as nucleus青霉素酰化酶催化合成頭孢類抗生素青霉素?；复呋铣深^孢類抗生素R2R1NH2NSNNSR3R1OOOOOOH2NNH2OHR3HOH+Penicillin G acylaseH2O7-ACCA (R3 = Cl)7-ADCA (

41、R3 = Me)Cefaclor (R1 = H, R3 = Cl)Cephalexin (R1 = H, R3 = Me)Cefadroxil ( R1 = OH, R3 = Me)7-ACCA or 7-ADCA as nucleus酶促合成頭孢類抗生素酶促合成頭孢類抗生素n - Reversible reaction n - Hydrolysis of substrate or product by biocatalystn - Difficulty of separation of product from reactantsCHCOOCH3NH2CHCOOHNH2CHCONHNSOC

42、OOHCH3NH2H2NNSOCOOHCH3+H2NNSOCOOHCH3+Esterase HydrolaseSynthetase固定化酶在醫(yī)藥治療上的應(yīng)用固定化酶在醫(yī)藥治療上的應(yīng)用n例例2：制造人工腎：制造人工腎n利用固定化脲酶透析液和活性炭一起制成的體外循環(huán)裝利用固定化脲酶透析液和活性炭一起制成的體外循環(huán)裝置，大大提高了療效。固定化脲酶由酶與離子交換樹脂置，大大提高了療效。固定化脲酶由酶與離子交換樹脂一起制成微小膠囊尿酶可分解尿素為一起制成微小膠囊尿酶可分解尿素為NH3和和CO2，NH3被被樹脂吸附，樹脂吸附，CO2可由肺部排出，活性炭用以吸附尿素以可由肺部排出，活性炭用以吸附尿素以外的代

43、謝廢物。外的代謝廢物。 3固定化酶在分析化學(xué)中應(yīng)用固定化酶在分析化學(xué)中應(yīng)用n酶柱和酶管，可與分光光度計(jì)、熒光計(jì)或電量計(jì)結(jié)合，酶柱和酶管，可與分光光度計(jì)、熒光計(jì)或電量計(jì)結(jié)合，形成酶電極，進(jìn)行某些物質(zhì)的自動分析。形成酶電極，進(jìn)行某些物質(zhì)的自動分析。酶電極酶電極221,5DODH O葡萄糖葡萄糖內(nèi)酯酶電極酶電極n特點(diǎn)：快速、方便、靈敏、精確特點(diǎn)：快速、方便、靈敏、精確n范圍：糖類、抗生素、氨基酸、甾體化合物、有機(jī)酸、范圍：糖類、抗生素、氨基酸、甾體化合物、有機(jī)酸、脂粉、醇類、胺類以及尿素、尿酸、硝酸、磷酸等脂粉、醇類、胺類以及尿素、尿酸、硝酸、磷酸等n要求：酶必須有較強(qiáng)的專一性，并且要有一定的純度。

44、要求：酶必須有較強(qiáng)的專一性，并且要有一定的純度。一概論生物傳感器又稱生物活性物質(zhì)修飾的傳感器。一般傳感器可分為物理傳感器和化學(xué)傳感器。例如熱敏電阻是最常用的物理傳感器，而玻璃pH電極是最常用的化學(xué)傳感器。 固定化青霉素酶層熱敏電阻pH電極敏感部固定化青霉素酶層生物傳感器的基本原理；易測量的物理,化學(xué)量生物活性物質(zhì)不易測量的化 學(xué) , 生 物量基礎(chǔ)傳感器測量信號 酶生物傳感器微生物細(xì)胞生物傳感器動物組織生物傳感器植物組織生物傳感器免疫生物傳感器基因生物傳感器其他雜合膜生物傳感器電化學(xué)生物傳感器（又稱為生物電極）光學(xué)（纖維）生物傳感器熱敏生物傳感器壓電晶體生物傳感器等等生物電極還可分為；基于O2檢測的生物電極基于H2O2檢測的生物電極基于NH3檢測的生物電極基于CO2檢測的生物電極基于pH檢測的生物電極電子轉(zhuǎn)移介體生物電極直接電位免疫生物電極酶標(biāo)免疫電極等等生物傳感器中涉及的生物反應(yīng)主要有三類；1.酶反應(yīng)（包括多酶反應(yīng)）;Ckdtdv)1 (2.免疫反應(yīng);3.雜交(合)反應(yīng);雜交反應(yīng)是指作為基因探針的單鏈寡核苷酸與目標(biāo)核苷酸以堿基配