牛白細胞黏附缺陷病的牛白細胞功能檢測

1、牛白細胞黏附缺陷病的牛白細胞功能檢測 作者：曹宏偉, 馬金柱, 夏紅兵, 張大生, 朱戰(zhàn)波, 崔玉東, 樸范澤【關鍵詞】 牛白細胞黏附缺陷?。˙LAD）; 白細胞; 牛1974 年, 世界上首次報道人發(fā)生一種容易感染、白細胞增生和趨化、吞噬功能缺陷的疾病, 1984 年確定其病因, 它是一種與白細胞黏附有關的細胞表面糖蛋白整合素表達缺陷所致, 并定名為白細胞黏附缺陷病1。1983 年報道了牛白細胞黏附缺陷病(bovine leukocyte adhesion deficiency, BLAD)2, 該病是一種常染色體單基因隱性遺傳疾病, 病因為白細胞表面整合素CD18（2）亞單位383位堿基由

2、A突變?yōu)镚, 與之相應的位于胞外高度保守區(qū)的128位天門冬氨酸突變成甘氨酸, 致使白細胞表面的2整合素表達明顯減少或缺乏, 白細胞的黏附、 趨化、 吞噬和過氧化物生成等功能下降, 進而導致中性粒細胞不能黏附到血管壁而到達炎癥部位發(fā)揮病原清除作用, 使機體出現(xiàn)嚴重的重復感染3。BLAD主要發(fā)生于114個月齡的Holstein牛, 且多在犢牛時期死亡, 但Muller 等4進一步研究發(fā)現(xiàn),一旦病牛超過12月齡, 感染的嚴重性和頻率下降, 而且只需要零星的抗生素治療即可維持其生存。2004年10月, 我們對成年奶牛進行BLAD攜帶情況調(diào)查時, 在大慶市某牛場發(fā)現(xiàn)1頭3.5歲Holstein奶牛為BL

3、AD病牛, 該牛經(jīng)常發(fā)生感染和不斷使用抗生素治療。為了解該BLAD病牛的白細胞功能變化情況, 本研究中對白細胞的黏附、趨化、吞噬和過氧化物生成等功能進行了檢測。1 材料和方法1.1 材料患有BLAD的Holstein奶牛(編號為1054) 和同齡健康牛（編號為1038）均來自于黑龍江省大慶市奶牛繁殖育種中心; 酵母菌和酵母聚糖zymosan為Sigma公司產(chǎn)品; 發(fā)光氨 Luminol為 Aldrich產(chǎn)品。1.2 方法1.2.1 白細胞的分離和計數(shù)以肝素 (20×104 U/L)為抗凝劑, 從奶牛的尾靜脈中采血10 mL。將抗凝血以2 000 r/min 于常溫離心10 min,

4、血液分為3層, 中間層為白細胞層。用移液管先吸掉上層液, 再將白細胞層移到另一離心管內(nèi), 加入6倍體積的8.3 g/L NH4Cl溶液, 37水浴5 min, 使帶入的紅細胞裂解后, 以2 000 r/min 離心10 min沉淀白細胞, 然后用Hanks平衡鹽溶液 (HBSS)洗滌白細胞3次后, 將白細胞以5×109/L的密度懸浮于HBSS中, 經(jīng)Wright Giemsa染色鏡檢, 細胞存活狀態(tài)良好。利用常規(guī)血細胞計數(shù)方法對以上BLAD牛和健康牛進行白細胞計數(shù)3次, 然后取平均值作為最后結果。1.2.2 白細胞黏附性測定將預熱5 min的1 mL含有自體10%血漿的白細胞（5&#

5、215;109 /L）懸液加入尼龍毛柱里, 之后對流出的白細胞計數(shù)。根據(jù)公式計算白細胞黏附率: 白細胞黏附率=100-（流出細胞數(shù)/初始細胞數(shù)×100）。1.2.3 白細胞趨化反應測定在瓊脂糖凝膠平皿上打兩組孔, 每3孔為1組, 孔的直徑為2.5 mm, 孔和孔的距離為 2.5 mm。中央孔加10 L的白細胞懸浮液（1×109/L）, 外孔加入以自體新鮮血清處理過的酶母聚糖zymosan 10 L, 內(nèi)孔加入10 L HBSS作對照液; 將平板放在含有5 mL/L CO2的潮濕培養(yǎng)箱中于37溫育2 h后, 在平皿中加滿99%的甲醇, 室溫30 min后, 輕輕倒出甲醇, 再

6、加滿37%甲醛溶液, 室溫放置60 min后, 除去甲醛溶液, 之后再移去瓊脂糖, 用WrightGiemsa方法對平皿中的白細胞進行染色, 然后用測微目鏡觀察細胞的游走情況和趨化性。1.2.4 白細胞吞噬功能測定將200 L白細胞（1.5×1010/L）、100 L稀釋血清和200 L酵母懸浮液（2.5×1014/L）混合后, 以低速搖床中37溫育30 min, 其后, 加入2mL冰冷的HBSS, 再進行400g離心10min, 在沉淀中加入2滴0.1g/L的品紅染液, 然后用顯微鏡觀察白細胞的吞噬情況。最后計算出在100個白細胞中吞噬酵母菌和未吞噬酵母菌的白細胞數(shù), 并

7、得出白細胞的吞噬率。1.2.5 過氧化物生成測定過氧化物生成測定是使用發(fā)光氨Luminol通過化學發(fā)光法檢測的。取96孔微孔板, 每孔中加入容量為350L, 其中含3×106個白細胞, CaCl2濃度為0.5mmol/L, MgCl2濃度為1mmol/L, Luminol濃度為10mol/L, HRP濃度為50mg/L, 于37溫育5 min, 再加入溫浴的35 L血清調(diào)理過的酵母聚糖zymosan (10 g/L), 用發(fā)光檢測儀于37檢測每孔的化學發(fā)光值5。2 結果2.1 白細胞計數(shù)BLAD牛和健康牛白細胞均經(jīng)3次計數(shù), 經(jīng)過計算正常牛白細胞數(shù)為 (7.6±0.22)&

8、#215;109/L, BLAD牛白細胞數(shù)為 (27.5±0.29)×109/L, BALD牛白細胞數(shù)約是正常牛的3.6倍。2.2 白細胞黏附性測定對白細胞的黏附性進行重復檢測, 結果BLAD牛白細胞黏附到尼龍纖維上的黏附率要比正常牛白細胞低很多（P<0.05）, 說明BLAD牛白細胞的黏附功能明顯降低（表1）。表1 BLAD牛和正常牛白細胞的黏附率檢測（略）2.3 白細胞趨化反應測定對白細胞趨化反應檢測結果為, BLAD牛白細胞的任意游走范圍(R)為(2.1±0.25)mm, 趨化反應(C)為(3.3±0.16)mm; 而正常牛白細胞的游

9、走范圍(R)為(2.77±0.24)mm, 趨化反應(C)為(4.33±0.21)mm。BLAD牛白細胞趨化反應要比正常牛白細胞的趨化反應明顯降低（P<0.05）。2.4 白細胞吞噬功能測定對白細胞吞噬功能檢測結果為, 正常白細胞對酵母的吞噬率為82%左右, 而且在鏡下觀察到多數(shù)白細胞吞噬25個酵母, 僅有少數(shù)白細胞吞噬12個酵母; 相比之下, BLAD牛白細胞對酵母的吞噬率為25.7%左右, 觀察到大部分白細胞能夠吞噬12個酵母, 僅有極少數(shù)的白細胞能夠吞噬23個酵母。表明BLAD牛白細胞吞噬能力要比正常牛白細胞的吞噬能力明顯下降（P0.05）。2.5 過氧

10、化物生成測定對白細胞過氧化物生成檢測結果為: 正常牛白細胞的過氧化物產(chǎn)生隨時間的延長而增加, 在300 s左右時達到峰值, 隨后下降（圖1）; 相比之下, BLAD牛白細胞過氧化物產(chǎn)生的量較少, 增加緩慢, 在900 s時達到峰值, 且光發(fā)射強度約為正常牛白細胞的1/3。結果表明BLAD牛白細胞過氧化物生成量比正常牛白細胞明顯降低。3 討論 白細胞整合素家族包括LFAl (CD11a/CD18)、Mac1 (CD11b/CD18) 和p150, 95 (CD11c/CD18)三種分子, 它們具有共同的CD18（2）鏈, 其中LFA1在白細胞穩(wěn)固黏附到血管內(nèi)皮上和穿過血管內(nèi)皮的移行中起主要作用,

11、 Mac1是一種主要的吞噬細胞受體, 同整合素p150, 95一起發(fā)揮作用, 識別作為配體的纖連蛋白和補體片段iC3b6。由于BLAD牛白細胞表面整合素亞單位CD18分子383位的堿基由A變?yōu)镚(A383G), 與之相應的位于胞外高度保守區(qū)的128位的天門冬氨酸變成了甘氨酸, 致使白細胞表面的CD18整合素表達明顯減少或缺乏, 而使白細胞在炎癥反應時不能利用整合素穿過血管壁到達病原侵入部位, 而使機體臨床發(fā)病。 通過對BLAD牛白細胞研究表明, 該病牛白細胞的數(shù)量明顯增加, 這可能是因為整合素亞單位（CD18）的功能缺陷引起白細胞功能下降的代償性增強所致。另外, 這頭BLAD牛白細胞的黏附和趨

12、化功能的降低可能與LFA1分子功能改變有直接關系; BLAD牛白細胞的吞噬功能明顯下降可能與Mac1和p150, 95二者發(fā)揮的調(diào)理作用缺陷有一定關系; 調(diào)理的酵母聚糖刺激BLAD牛白細胞過氧化物產(chǎn)生的減少可能與整合素亞單位（CD18）溝通細胞內(nèi)外的橋梁作用和細胞信號傳導作用的減弱甚至消失有關。本研究對這頭病牛白細胞各項白細胞功能進行檢測表明, 這頭BLAD牛白細胞的黏附、趨化、吞噬和過氧化物產(chǎn)生等功能與正常牛白細胞相比均明顯降低, 這些研究結果與國外的研究結果相符7。正是因為如此, 該病牛在臨床上才經(jīng)常出現(xiàn)感染, 并常常需要使用抗生素進行治療, 因此增加了養(yǎng)牛成本, 使該牛于2005年11月

13、被淘汰。本研究中沒有對BLAD牛白細胞的整合素表達量及其亞單位（CD18）構象變化方面進行研究, 同時也沒未對BLAD牛白細胞中鈣離子濃度進行檢測, 尚需今后進一步研究才能夠更加深入認識BLAD發(fā)病機制?！緟⒖嘉墨I】 1Kishimoto TK, Hollander N, Robert TM, et al. Heterogeneous mutations in the beta subunit common to the LFA1, Mac1 and p150, 95 glycoproteins cause leukocyte adhesion deficiencyJ. Cell, 1987,

14、 50: 193-202.2Hagemoser WA. Roth JA, Lofstedt J, et al. Granulocytopathy in a Holstein heiferJ. J Am Vet Med Assoc, 1983, 183: 1093-1094.3Gerardi AS. Bovine leukocyte adhesion deficiency: a review of a modern disease and its implicationsJ. Res Vet Sci, 1996, 61: 183-186.4Muller KE, Bernadina WE, Kalsbeek HC, et al. Bovine leukocyte adhesion deficiency clinical course and laboratory findings in eight affected animalsJ. Vet Q, 1994, 16: 27-33.5崔玉東. 胞漿Ca2+和某些激酶對NADPH氧化酶激活和肌動蛋白聚合的作用J. 中