熒光定量PCR在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

1、熒光定量pcr在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用內(nèi)容提要一、基因診斷技術(shù)簡(jiǎn)介一、基因診斷技術(shù)簡(jiǎn)介二、乙型肝炎的病原檢測(cè)二、乙型肝炎的病原檢測(cè)三、丙型肝炎的病原檢測(cè)三、丙型肝炎的病原檢測(cè)四、性病相關(guān)病原體的檢測(cè)四、性病相關(guān)病原體的檢測(cè)基因診斷技術(shù)簡(jiǎn)介4 基因診斷3 免疫學(xué)診斷臨床診斷細(xì)胞膜細(xì)胞核dna轉(zhuǎn)錄 mrna翻譯蛋白質(zhì)1 形態(tài)學(xué)診斷2 生化診斷概念pcr與基因診斷技術(shù)l基因診斷即通過核酸的分子生物學(xué)檢測(cè)直接檢測(cè)基因的存在狀態(tài)或缺陷對(duì)疾病作出診斷的方法。lpolymerase chain reaction(pcr)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種dna的快速擴(kuò)增技術(shù)。pcr技術(shù)通過兩個(gè)短的稱為引物的dna小片段和一

2、種耐熱酶的作用，可在3個(gè)小時(shí)內(nèi)把特定的dna片段擴(kuò)增1000萬倍。 l九十年代中期pcr臨床應(yīng)用在國(guó)內(nèi)全面開展，1998年，熒光定量pcr技術(shù)開始在中國(guó)應(yīng)用于臨床檢測(cè)。熒光定量pcr技術(shù)l實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)，是指在反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)檢測(cè)整個(gè)pcr過程，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)pcr終產(chǎn)物的分析，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)未知的起始模版進(jìn)行定量分析的一種技術(shù)，是迄今對(duì)已知基因序列的核酸測(cè)定中最靈敏的方法。熒光染料：sybr green i、eva green熒光探針：taqman、 hybridization probes 、molecular beacon熒光定量pcr技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)l特異性強(qiáng)

3、：直接擴(kuò)增病原體的特異dna或異?；蚱蝜靈敏度高：可檢測(cè)到極少量的dna，有效降低漏診率l高效省時(shí)：擴(kuò)增周期短，有利于快速診斷l(xiāng)取材范圍廣：血清、痰液、體液、毛發(fā)等多種樣本l全封閉反應(yīng)：無需pcr后處理，降低污染l定量準(zhǔn)確：利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，采用對(duì)數(shù)期分析l自動(dòng)化程度高：操作安全，避免人為判斷rochelightcycler熒光定量pcr技術(shù)的臨床應(yīng)用l病毒性肝炎（hbv、hbv-ymdd、hcv）的基因檢測(cè)l性病相關(guān)病原體（ct、ng、uu、hpv）的基因檢測(cè)l優(yōu)生優(yōu)育項(xiàng)目診斷：人巨細(xì)胞病毒（hcmv）、單純皰疹病毒ii型（hsv）、弓形蟲（tox）、風(fēng)疹病毒l其它病原體檢測(cè)：結(jié)核桿菌、肺

4、炎支原體、eb病毒、傷寒桿菌、幽門螺旋桿菌等乙型肝炎的病原檢測(cè)乙肝病毒乙肝病毒 hbv的感染過程的感染過程乙肝如何傳染？慢性hbv感染病毒持續(xù)病毒持續(xù)6個(gè)月未被清除者個(gè)月未被清除者l免疫耐受期：hbv復(fù)制活躍l免疫清除期l非活動(dòng)或低復(fù)制期慢性乙型肝炎lhbeag陽性慢性乙型肝炎lhbeag陰性慢性乙型肝炎乙型肝炎肝硬化l代償期肝硬化l失代償期肝硬化hbsag與抗hbslhbsag在感染在感染hbv兩周后即可陽性。只要兩周后即可陽性。只要hbsag陽陽性就可診斷性就可診斷hbv感染，陰性則不能排除感染，陰性則不能排除hbv感染。感染。l抗抗hbs為保護(hù)性抗體，陽性表示對(duì)為保護(hù)性抗體，陽性表示對(duì)h

5、bv有免疫力。有免疫力。hbsag和抗和抗hbs同時(shí)陰性：同時(shí)陰性： 即所謂窗口期，此時(shí)即所謂窗口期，此時(shí)hbsag和抗和抗hbs都未產(chǎn)生。都未產(chǎn)生。hbsag和抗和抗hbs同時(shí)陽性：同時(shí)陽性： hbv感染恢復(fù)期，此時(shí)感染恢復(fù)期，此時(shí)hbsag未消失，抗未消失，抗hbs已已產(chǎn)生?；蛘呤莵喰透腥尽．a(chǎn)生。或者是亞型感染。 為什么hbsag陰性不能排除hbv感染？l窗口期窗口期l檢測(cè)試劑不夠靈敏檢測(cè)試劑不夠靈敏l隱匿性慢性乙肝（隱匿性慢性乙肝（s s基因變異）基因變異）l重疊重疊hcvhcv感染（干擾感染（干擾hbsaghbsag合成）合成）抗hbs陽性就萬無一失了嗎？單一抗單一抗hbshbs陽性陽

6、性hbv dnahbv dna檢出率檢出率0-11.8%0-11.8%l先后感染了不同的先后感染了不同的hbvhbv亞型亞型lhbvhbv病毒病毒s s基因變異基因變異如何診斷血清hbsag陰性的hbv感染？l提高提高檢測(cè)敏感性檢測(cè)敏感性l采用針對(duì)變異抗原的檢測(cè)試劑采用針對(duì)變異抗原的檢測(cè)試劑lhbv dnahbv dna的檢測(cè)！的檢測(cè)！hbeag與抗hbelhbeag的存在表示病毒復(fù)制活躍且有較強(qiáng)的的存在表示病毒復(fù)制活躍且有較強(qiáng)的傳染性。傳染性。hbeag消失而抗消失而抗hbe產(chǎn)生稱為血清產(chǎn)生稱為血清轉(zhuǎn)換?？罐D(zhuǎn)換?？筯be陽轉(zhuǎn)后，病毒復(fù)制水平低，傳染陽轉(zhuǎn)后，病毒復(fù)制水平低，傳染性降低。性降低。

7、l但長(zhǎng)期抗但長(zhǎng)期抗hbe陽性者并不代表病毒復(fù)制停止或陽性者并不代表病毒復(fù)制停止或無傳染性，研究顯示無傳染性，研究顯示20%50%仍可檢測(cè)到仍可檢測(cè)到hbv dna，部分可能由于前，部分可能由于前c區(qū)基因變異，區(qū)基因變異，導(dǎo)致不能形成導(dǎo)致不能形成hbeag。hbeag與抗hbe共存？l處于血清轉(zhuǎn)換過程中處于血清轉(zhuǎn)換過程中l(wèi)野生株與變異株同時(shí)存在野生株與變異株同時(shí)存在hbeag水平與hbv dna的關(guān)系lhbeaghbeag陽性標(biāo)本陽性標(biāo)本hbv dnahbv dna檢出率檢出率9090左右左右lhbeaghbeag與與hbv dnahbv dna有著良好的相關(guān)性有著良好的相關(guān)性hbeag陰性/抗

8、hbe陽性/hbv dna陽性hbv dna水平一般較低水平一般較低lhbvhbv低水平復(fù)制低水平復(fù)制lhbvhbv病毒前病毒前c c區(qū)基因變異區(qū)基因變異l重疊重疊hcvhcv感染感染“兩對(duì)半”缺陷l“兩對(duì)半”是hbv dna 是病毒復(fù)制和傳染性的直接標(biāo)志。是病毒復(fù)制和傳染性的直接標(biāo)志。hbv dna定量對(duì)于判斷病毒復(fù)制程度、傳染性大定量對(duì)于判斷病毒復(fù)制程度、傳染性大小、病毒藥物療效等有重要意義。小、病毒藥物療效等有重要意義。hbv dna拷貝數(shù)乙肝病毒載量拷貝數(shù)乙肝病毒載量hbv dna檢測(cè)的臨床意義lhbv dnahbv dna是是hbvhbv存在最直接的依據(jù)存在最直接的依據(jù)lhbv dn

9、ahbv dna是是hbvhbv復(fù)制的標(biāo)志復(fù)制的標(biāo)志lhbv dnahbv dna是患者具有傳染性的標(biāo)志是患者具有傳染性的標(biāo)志lhbv dnahbv dna對(duì)乙肝兩對(duì)半起補(bǔ)充作用對(duì)乙肝兩對(duì)半起補(bǔ)充作用lhbv dnahbv dna是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標(biāo)是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標(biāo)lhbv dnahbv dna可檢測(cè)出隱匿性慢性乙型肝炎可檢測(cè)出隱匿性慢性乙型肝炎提供直接證據(jù)縮短提供直接證據(jù)縮短“窗口期窗口期”pcrpcr檢測(cè)檢測(cè)“窗口期窗口期”核酸檢測(cè)縮短的核酸檢測(cè)縮短的“窗口期窗口期”的天數(shù)的天數(shù)hbvhbv56566-156-15hcvhcv707041-604

10、1-60hivhiv222210-1510-15有利于獻(xiàn)血員窗口期病毒核酸的篩查和早期診斷有利于獻(xiàn)血員窗口期病毒核酸的篩查和早期診斷hbv dna檢測(cè)的臨床意義hbv dna檢測(cè)的臨床意義 調(diào)查表明并不是所有調(diào)查表明并不是所有“大三陽大三陽”的病人的病人都處于都處于hbv復(fù)制期，具有傳染性；也不是所復(fù)制期，具有傳染性；也不是所有有“小三陽小三陽”的病人的病人hbv都無復(fù)制。因此，都無復(fù)制。因此，要準(zhǔn)確知道要準(zhǔn)確知道hbv是否處于復(fù)制狀態(tài)，最準(zhǔn)確是否處于復(fù)制狀態(tài)，最準(zhǔn)確的方法還是通過檢測(cè)的方法還是通過檢測(cè)hbv dna來決定。來決定。hbv dna檢測(cè)方法l斑點(diǎn)雜交（基本淘汰）斑點(diǎn)雜交（基本淘汰

11、）l定性定性pcr（基本淘汰）（基本淘汰）l熒光定量熒光定量pcr（主流）（主流）l基因芯片（將來？）基因芯片（將來？）為什么建議病人要進(jìn)行hbv dna檢測(cè)？熒光定量pcr方法檢測(cè)hbv感染的各期血清標(biāo)本copies/mlhbeag陽性慢性乙型肝炎病人8.3 x 108經(jīng)干擾素治療后hbeag轉(zhuǎn)陰6.2 x 103非活動(dòng)性hbsag攜帶者血清5.6 x 103原先血中hbv dna陽性，已痊愈超過12個(gè)月的血清103hbsag和hbeag均陽性而hbv dna陰性？l干擾素或拉米夫定等治療后病毒復(fù)制受抑制。干擾素或拉米夫定等治療后病毒復(fù)制受抑制。lpcr所用引物相應(yīng)的所用引物相應(yīng)的dna序列

12、發(fā)生突變，此序列發(fā)生突變，此引物與突變引物與突變dna不能配對(duì)結(jié)合。不能配對(duì)結(jié)合。l病毒病毒dna整合于宿主肝細(xì)胞染色體而血中游整合于宿主肝細(xì)胞染色體而血中游離離hbv dna很少或缺乏。很少或缺乏。乙肝的治療l目前尚無一種能迅速、直接殺死清除乙肝病毒的藥物，目前尚無一種能迅速、直接殺死清除乙肝病毒的藥物，最好的抗病毒藥物療效也僅能達(dá)到最好的抗病毒藥物療效也僅能達(dá)到5050左右。左右。l目前國(guó)際醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的治療慢性乙肝有確切療效的抗目前國(guó)際醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的治療慢性乙肝有確切療效的抗病毒藥物主要有兩大類：病毒藥物主要有兩大類： 干擾素：重組人干擾素：重組人-1b-1b干擾素、干擾素、- 2a- 2a

13、、 -2b-2b干擾素等。干擾素等。核苷類似物：拉米夫定、阿德福韋。核苷類似物：拉米夫定、阿德福韋。乙肝的治療主要包括抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗炎保肝、抗纖維化等對(duì)于hbv dna105的患者應(yīng)進(jìn)行抗病毒治療拉米夫定l可迅速降低hbv dnahbv dna的濃度，改善肝臟組織的病變，還可能阻斷肝纖維化的進(jìn)程，終止肝硬化的發(fā)展。l尤其是拉米夫定不受病毒感染的模式、野生型或基因組前c區(qū)突變的影響。l此外拉米夫定還能抑制肝移植受體和aidsaids病人體內(nèi)的hbvhbv復(fù)制。拉米夫定治療人群l有明顯hbv dna復(fù)制者l前c區(qū)變異的慢性乙型肝炎l代償期的慢性乙型肝炎l接受肝臟移植的患者l干擾素治療失敗拉米

14、夫定治療效果l絕大多數(shù)患者絕大多數(shù)患者h(yuǎn)bv dnahbv dna水平顯著下降。水平顯著下降。l用藥用藥4 4周開始下降，周開始下降，1212至至1616周約半數(shù)以上的病周約半數(shù)以上的病例血清例血清hbv dnahbv dna降到可檢測(cè)水平以下。降到可檢測(cè)水平以下。l治療治療1 1年后年后hbeaghbeag陰轉(zhuǎn)率約為陰轉(zhuǎn)率約為20%20%。l病毒學(xué)應(yīng)答：hbv dna低于檢測(cè)下限l血清學(xué)應(yīng)答l生化學(xué)應(yīng)答l組織學(xué)應(yīng)答應(yīng)用抗病毒藥物后如何判斷療效？應(yīng)用抗病毒藥物后如何判斷療效？l治療結(jié)束時(shí)治療結(jié)束時(shí)完全應(yīng)答完全應(yīng)答l隨訪隨訪1 1年年持續(xù)應(yīng)答持續(xù)應(yīng)答l無應(yīng)答無應(yīng)答ymdd變異lymddymdd：

15、酪氨酸蛋氨酸天門冬氨酸天：酪氨酸蛋氨酸天門冬氨酸天 門冬氨酸門冬氨酸l蛋氨酸（蛋氨酸（m m）突變?yōu)楫惲涟保ǎ┩蛔優(yōu)楫惲涟保╥ i）或纈氨酸（）或纈氨酸（v v）形成形成yiddyidd變異株或變異株或yvddyvdd變異株變異株 ?？共《局委熤写嬖诘膯栴}hbv-ymdd變異檢測(cè)的臨床意義l動(dòng)態(tài)檢測(cè)動(dòng)態(tài)檢測(cè)：服用拉米夫定：服用拉米夫定3個(gè)月開始，每月個(gè)月開始，每月 檢測(cè)檢測(cè)1次次l提前發(fā)現(xiàn)提前發(fā)現(xiàn)：可在耐藥臨床表現(xiàn)發(fā)生前：可在耐藥臨床表現(xiàn)發(fā)生前1-4個(gè)個(gè) 月檢測(cè)出突變株月檢測(cè)出突變株l及時(shí)調(diào)整及時(shí)調(diào)整：適時(shí)調(diào)整用藥方案，防止因耐：適時(shí)調(diào)整用藥方案，防止因耐 藥而導(dǎo)致病情惡化藥而導(dǎo)致病情惡化丙型

16、肝炎的病原檢測(cè)丙肝病毒lhcv是單鏈rna病毒l主要通過血液和血制品傳播l感染后易轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿窝谆虬l(fā)展為肝硬化、肝癌l呈全球性分布，約1%普通人群感染抗hcv igm和抗hcv igglhcv抗體不是保護(hù)性抗體，是存在hcv感染的標(biāo)志。l抗hcv igm在發(fā)病后即可檢測(cè)到，一般持續(xù)13個(gè)月。l如果抗hcv igm持續(xù)陽性，提示病毒持續(xù)復(fù)制，易轉(zhuǎn)為慢性。l低滴度抗hcv igg提示病毒處于靜止?fàn)顟B(tài)，高滴度提示病毒復(fù)制活躍。hcv抗原檢測(cè)的困難lhcvhcv在血液中含量極低，僅為在血液中含量極低，僅為hbvhbv的的1%1%lhcvhcv病毒顆粒很難有效地分離純化、人工合成抗原病毒顆粒很難有效地分

17、離純化、人工合成抗原l丙型肝炎的窗口期很長(zhǎng)，血清學(xué)檢測(cè)無法早期診斷丙型肝炎的窗口期很長(zhǎng)，血清學(xué)檢測(cè)無法早期診斷l(xiāng)抗體持續(xù)性存在，無法提示正確的病毒載量抗體持續(xù)性存在，無法提示正確的病毒載量lhcvhcv的型別復(fù)雜，高突變率的型別復(fù)雜，高突變率lhcvhcv核心抗原檢測(cè)試劑盒敏感性差：核心抗原檢測(cè)試劑盒敏感性差：45.68%45.68%hcv rna hcv rna陽性是病毒感染和復(fù)制的直接標(biāo)志。陽性是病毒感染和復(fù)制的直接標(biāo)志。hcv rna的定量測(cè)定有助于了解病毒復(fù)制程度、抗的定量測(cè)定有助于了解病毒復(fù)制程度、抗病毒治療的選擇及療效評(píng)估等。病毒治療的選擇及療效評(píng)估等。hcv rna熒光定量pcr

18、檢測(cè)的臨床意義l早期診斷：在免疫學(xué)檢測(cè)的“窗口期”或一部分不產(chǎn)生抗體的丙肝病毒攜帶者，都可出現(xiàn)hcv rna陽性，抗hcv陰性的檢測(cè)結(jié)果。l彌補(bǔ)elisa方法的高漏檢率,hcv rna可作為hcv感染診斷的指標(biāo)。lhcv rna定量可指導(dǎo)用藥，為療效觀察及預(yù)后判斷提供客觀指標(biāo)?？筯cv不能作為抗病毒療效的指標(biāo)。l慢性丙型肝炎長(zhǎng)期抗hcv陽性，這只表示曾經(jīng)感染了丙肝病毒并出現(xiàn)了相應(yīng)的免疫應(yīng)答，并不代表體內(nèi)仍有丙肝病毒的存在或復(fù)制，這時(shí)只能通過hcv rna定量檢測(cè)鑒別丙肝病毒的活動(dòng)性和復(fù)制程度。lhcv主要通過輸血和血制品傳播，對(duì)獻(xiàn)血員及血制品進(jìn)行檢測(cè)，以減少醫(yī)源性丙型肝炎的發(fā)生和傳播。核酸檢測(cè)

19、在核酸檢測(cè)在hcv感染的診斷中要比感染的診斷中要比hbv感染的診斷重要得多！感染的診斷重要得多！性病相關(guān)病原體的檢測(cè) 性病在我國(guó)已成為性病在我國(guó)已成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題，自題，自9999年以來，性病年以來，性病的發(fā)生率居高不下，其的發(fā)生率居高不下，其發(fā)病率在傳染性疾病中發(fā)病率在傳染性疾病中位居第位居第3 3位，位，0303年我國(guó)累年我國(guó)累計(jì)報(bào)道性病病例數(shù)（計(jì)報(bào)道性病病例數(shù)（hiv除外）除外）7373萬。浙江省為萬。浙江省為高發(fā)區(qū)，位居全國(guó)第三。高發(fā)區(qū)，位居全國(guó)第三。常見性傳播疾病病原體l淋病雙球菌(ng)l沙眼衣原體(ct)l解脲支原體(uu)l人類乳頭瘤病毒(hpv)

20、l人類免疫缺陷病毒(hiv)淋病雙球菌的傳統(tǒng)檢測(cè)方法l涂片染色：對(duì)于女性患者檢出率低，易出現(xiàn)假陰性l分離培養(yǎng)：培養(yǎng)較困難，生化鑒定復(fù)雜，時(shí)間長(zhǎng)lelisa抗原檢測(cè)法：存在交叉反應(yīng)，非特異反應(yīng)較嚴(yán)重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)ng的優(yōu)勢(shì)l可在短時(shí)間內(nèi)快速、準(zhǔn)確地直接從臨床各種標(biāo)本中檢出含量極低的病原菌l對(duì)女性疑似淋球菌引起的各種炎癥的診斷及鑒別診斷起決定性作用l對(duì)癥狀輕者或無癥狀的淋球菌感染者做到早期診斷和鑒別診斷l(xiāng)可用于療效考核沙眼衣原體沙眼衣原體感染與致病l近年來在歐美等國(guó)，沙眼衣原體的感染率和危害性已超過淋球菌l在我國(guó)，在非淋球菌性尿道炎中居首位在我國(guó)，在非淋球菌性尿道炎中居首位l泌尿生殖道感染，妨礙妊娠l盆腔感染，可致生殖能力損害傳統(tǒng)方法檢測(cè)沙眼衣原體的缺陷l“窗口期”檢測(cè)不出l不能判定是現(xiàn)癥感染還是既往感染熒光定量pcr檢測(cè)衣原體的優(yōu)勢(shì)l靈敏度98%以上、特異性100%l提高陽性檢出率l適用于感染的早期診斷和無癥狀攜帶者的檢查解脲支原體luu難以分離，需特殊培養(yǎng)基培養(yǎng)，操作費(fèi)時(shí)，需1-3天才能得到初步結(jié)果。l血清學(xué)檢查，僅10%uu尿道炎患者在病程中特異性抗體滴度升高4倍，使其