PCR的原理和操作過程

1、PCR原理和基本操作過程2015.12.5臨床146生化實(shí)驗(yàn)小組第一節(jié) PCR技術(shù)原理 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reation,PCR)是一種DNA體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)能在短時(shí)間內(nèi)將極微量的目的基因或某DNA片段擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍，從極微量的標(biāo)本中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測(cè)鑒定。PCR技術(shù)具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)。 PCR基本原理PCR基本反應(yīng)步驟一、PCR的原理 PCR技術(shù)是一種在體外模擬DNA的復(fù)制過程的核酸擴(kuò)增技術(shù)。其原理是根據(jù)DNA的半保留復(fù)制，以及DNA分子在體外不同的溫度下雙鏈和單鏈可相互轉(zhuǎn)變的機(jī)制，在

2、體外人為地控制反應(yīng)系統(tǒng)的溫度，使雙鏈DNA變性，成為單鏈DNA；其次，單鏈DNA與人工引物鏈在退火過程中配對(duì)結(jié)合；最后，在DNA聚合酶的催化作用下，使引物沿單鏈模板延伸為雙鏈DNA，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增。PCR三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成，即變性、退火、引物延伸。二、三個(gè)基本步驟變性(denaturation)-高溫下將模板DNA雙鏈打開 退火(annealing)-引物在較低溫度下以共價(jià)鍵結(jié)合到模板DNA互補(bǔ)部位 延伸(extension)-TaqDNA聚合酶作用下，不斷向引物3端添加DNTP，DNA鏈不斷延伸反應(yīng)液中含有所有成分，以溫度變化來控制反應(yīng)階段：反應(yīng)液中含有所有成分，以溫度變化來控制反應(yīng)階段

3、：變性變性95度，退火度，退火55度，延伸度，延伸72度。度。1234522557294時(shí)間（min）溫度（）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95變變 性性第一輪擴(kuò)增第一輪擴(kuò)增PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過

4、程PCR的特點(diǎn)58引物1引物2DNA引物退退 火火PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶延延 伸伸PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)第1輪結(jié)束95第2輪開始PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)50TaqTaqTaqTaq72PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72第2輪結(jié)束PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增PCR的特點(diǎn)靈敏度高1.皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平2. 能從10

5、0萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞3.病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU4.細(xì)菌檢測(cè)的最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌簡(jiǎn)便、快速1.一次性加好反應(yīng)液，24 小時(shí)完成擴(kuò)增2.擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對(duì)標(biāo)本的純度要求低u血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNAPCR 的特點(diǎn)第二節(jié)PCR的實(shí)驗(yàn)步驟標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系 10X 擴(kuò)增緩沖液： 5l 模板DNA: 0.12g 引物： 各0.21mol/L 4種dNTP: 各200mol/L Mg2+: 1.5mmol/L Taq DNA聚合酶： 2.5UddH2O 補(bǔ)齊 總體積： 50lu可以按照比例放大或者縮小體系，不同的可以按照比例放大或者縮小體系，不同的P

6、CR反應(yīng)需要優(yōu)化反應(yīng)需要優(yōu)化u按照實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行即可按照實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行即可1.加樣 將上述總體積為50l的反應(yīng)體系加入一無(wú)菌0.5ml離心管中2離心 將加入的反應(yīng)物混合均勻后稍離心，加入一滴礦物油覆蓋于反應(yīng)混合物上3擴(kuò)增 在PCR儀上設(shè)置PCR反應(yīng)參數(shù)（具體數(shù)據(jù)根據(jù)引物和擴(kuò)增片段的大小而定）：94下加熱4分鐘左右；依次94變性1分鐘，45退火1分鐘，72延伸2分鐘，循環(huán)32次左右；72下保溫7分鐘，使反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增充分4PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析 PCR產(chǎn)物是否為特異性擴(kuò)增，其結(jié)果是否可靠，必須對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格的分析與鑒定，才能得出正確的結(jié)論。產(chǎn)物的分析，可依據(jù)研究對(duì)象和目的不同而采用不同的分析方法PCR循環(huán)參數(shù) 94 ，3min；94 ，45s；58 ，1min； 循環(huán)30次72 ，1min；72 ，10min；16 保溫（熱力學(xué)參數(shù)）（熱力學(xué)參數(shù)） 94 ，3min；94 ，45s；58 ，1min； 循環(huán)30次72 ，1min；72 ，10min；16 保溫 94 預(yù)變性，3min使DNA雙鏈完全打開退火： 58，1min 溫度由引物長(zhǎng)度和GC含量決定。 增加溫度能減