扁蒴藤素對(duì)肺纖維化模型小鼠肺組織形態(tài)及轉(zhuǎn)化生長因子-β1、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)的影響

1、    扁蒴藤素對(duì)肺纖維化模型小鼠肺組織形態(tài)及轉(zhuǎn)化生長因子-1、-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)的影響    蔣金桃 崔國良 馮小可 甘可 談文峰 張前德 摘要：目的  觀察扁蒴藤素對(duì)肺纖維化模型小鼠肺組織形態(tài)及轉(zhuǎn)化生長因子（tgf）-1、-平滑肌肌動(dòng)蛋白（-sma）表達(dá)的影響，探討其作用機(jī)制。方法  采用氣管內(nèi)注射博來霉素溶液制備小鼠肺纖維化模型。將32只雄性c57bl/6j小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、扁蒴藤素組及吡非尼酮組，每組8只。正常組和模型組給予等量生理鹽水腹腔注射，扁蒴藤素組給予1 mg/kg扁蒴藤素溶液腹腔注射，吡非尼酮組給予50

2、mg/kg吡非尼酮溶液腹腔注射。給藥體積10 ml/kg，每日1次，連續(xù)28 d。取肺組織行he及masson染色，評(píng)估小鼠肺組織病理學(xué)變化及膠原沉積;免疫組化和western bot檢測小鼠肺組織tgf-1及-sma蛋白的表達(dá)。結(jié)果  he及masson染色顯示，扁蒴藤素組小鼠肺泡炎及肺纖維化評(píng)分低于模型組（p<0.05，p<0.05，p關(guān)鍵詞：扁蒴藤素;肺纖維化;轉(zhuǎn)化生長因子-1;-平滑肌肌動(dòng)蛋白;小鼠中圖分類號(hào)：r285.5    文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：a    文章編號(hào)：1005-5304（2020）04-0041-05doi：10.

3、3969/j.issn.1005-5304.201910238effects of pristimerin on morphology of lung tissue and expressions of tgf-1and -sma of pulmonary fibrosis model micejiang jintao1，2， cui guoliang1，2， feng xiaoke1，2， gan ke3， tan wenfeng1，2， zhang qiande1，21. institute of integrated medicine， nanjing medical universit

4、y， nanjing 210029， china;2. the first affiliated hospital of nanjing medical university， nanjing 210029， china;3. nanjing university of chinese medicine， nanjing 210023， chinaabstract： objective to explore the effects of pristimerin on morphology of lung tissue and the expressions of tgf-1 and -sma

5、of pulmonary fibrosis model mice; to explore the action mechanism. methods a mouse lung fibrosis model was prepared by intratracheal injection of bleomycin solution. 32 male c57bl/6j mice were randomly divided into control group， model group， pristimerin group and pirfenidone group， with 8 mice in e

6、ach group. the control and model groups were given the same amount of saline by intraperitoneal injection; the pristimerin group was given 1 mg/kg pristimerin by intraperitoneal injection， and the pirfenidone group was given 50 mg/kg pirfenidone by intraperitoneal injection. the administration volum

7、e was 10 ml/kg once a day for 28 consecutive days. lung tissues were obtained by he and masson staining to evaluate the pathological changes and collagen deposition in the lung tissues of mice. immunohistochemistry and western blot were used to determine the expressions of tgf-1 and -sma proteins in

8、 the lung tissues of mice. results he staining and masson staining showed that alveolar inflammation and pulmonary fiber score in mice of pristimerin group were significantly lower than the model group （pkeywords： pristimerin; pulmonary fibrosis; tgf-1; -sma; mice肺間質(zhì)纖維化是硬皮病等多種結(jié)締組織病的常見并發(fā)癥1，患者通常伴有進(jìn)行性呼

9、吸困難和肺功能惡化，目前臨床上對(duì)肺纖維化治療手段匱乏，預(yù)后較差，死亡率高。轉(zhuǎn)化生長因子（tgf）-1是目前研究最為廣泛的促纖維化因子之一，被認(rèn)為在肺纖維化進(jìn)程中起到至關(guān)重要的作用2。tgf-1會(huì)導(dǎo)致肌成纖維細(xì)胞的異常活化、過度表達(dá)-平滑肌肌動(dòng)蛋白（-sma）并導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（ecm）過量產(chǎn)生，最終導(dǎo)致肺組織結(jié)構(gòu)重塑、肺功能受損3。靶向抑制tgf-1信號(hào)傳導(dǎo)途徑是改善肺纖維化的有效治療策略4。盡管美國食品藥品管理局批準(zhǔn)的吡非尼酮和尼達(dá)尼布可減緩肺纖維化病程進(jìn)展5，但其治療成本較高、不良反應(yīng)大6，不能從根本上解決問題。因此，尋找新的治療藥物并證明其功效是肺纖維化患者的首要需求。扁蒴藤素（prist

10、imerin）是衛(wèi)矛科南蛇藤的主要活性成分，屬醌甲基三萜類化合物，具有廣譜抗腫瘤、抗炎、抗氧化等藥理活性7。最新研究顯示，扁蒴藤素可通過抑制相關(guān)纖維化基因阻斷多柔比星誘導(dǎo)的心肌纖維化8。為驗(yàn)證扁蒴藤素在肺纖維化中的作用，本實(shí)驗(yàn)觀察扁蒴藤素對(duì)博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型小鼠肺組織形態(tài)及tgf-1、-sma表達(dá)的影響，并初步探討其可能的作用機(jī)制。1  實(shí)驗(yàn)材料1.1  動(dòng)物spf級(jí)雄性c57bl/6j小鼠32只，2025 g，810周齡，購于南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖中心，動(dòng)物許可證號(hào)scxk（蘇）2017-0001。飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)峨眉嶺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心spf級(jí)動(dòng)物房，溫度202

11、4 ，相對(duì)濕度（50±5）%，常規(guī)自由飲食。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在南京醫(yī)科大學(xué)峨眉嶺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成。所有實(shí)驗(yàn)研究均遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理指南原則，并通過南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)審查批準(zhǔn)（iacuc-1708005-1）。1.2  藥物扁蒴藤素，美國sigma公司，批號(hào)066m4623v;注射用鹽酸博來霉素，日本化藥株式會(huì)社，批號(hào)2019460;吡非尼酮，大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)j1001a。1.3  主要試劑及儀器生理鹽水（美國hyclone公司，批號(hào)ad23987292），水合氯醛（國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司，批號(hào)20150630），tgf-1一抗（affinity

12、 biosciences，批號(hào)20r6523），-sma一抗（武漢三鷹，批號(hào)00075696），hrp標(biāo)記的羊抗兔二抗（jackson，批號(hào)128689），改良masson三色染色液試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20190117），多聚甲醛（servicebio公司，批號(hào)xs190206），bca蛋白測定試劑盒（thermo公司，批號(hào)sf249044）。高速冷凍離心機(jī)（德國eppendorf公司），-80 超低溫冰箱（日本sanyo公司），ae240型電子分析天平（蘇州市三豐劑量科技有限公司），脫水機(jī)（武漢俊杰電子有限公司），包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司），病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公

13、司），載玻片及蓋玻片（江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司），正置光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司），成像系統(tǒng)（日本尼康公司），電泳儀（美國bio-rad公司），7號(hào)腰穿針（揚(yáng)州市江洲醫(yī)療器械有限公司），1 ml無菌注射器（美國bd公司）。2  實(shí)驗(yàn)方法2.1  分組小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組、模型組、扁蒴藤素組和吡非尼酮組，每組8只。2.2  造模及給藥參照文獻(xiàn)9方法造模。小鼠給予4%水合氯醛（100 u/10 g）腹腔注射麻醉，仰臥固定于操作臺(tái)，頸部脫毛膏脫毛后酒精消毒，沿頸正中縱行切開皮膚，鈍性分離暴露氣管，用磨鈍后7號(hào)腰穿針緊貼舌根中央部緩慢插入氣管中，進(jìn)針深度約2

14、.5 cm，緩慢注入博來霉素溶液（5 u/kg，約0.05 ml）。正常組在相同條件下注入等體積無菌生理鹽水，隨后迅速將小鼠直立前后左右輕輕擺動(dòng)，使藥液均勻分布肺組織，縫合頸部傷口，酒精消毒手術(shù)切口及周圍皮膚。造模后次日，扁蒴藤素組腹腔注射1 mg/kg扁蒴藤素溶液進(jìn)行干預(yù)處理，吡非尼酮組腹腔注射50 mg/kg吡非尼酮溶液，模型組腹腔注射注射等體積生理鹽水。給藥體積10 ml/kg，每日1次，連續(xù)28 d。第29日小鼠麻醉處死，所有小鼠均取右肺下葉，置于4%多聚甲醛中固定。其余肺組織置2 ml凍存管中，于液氮快速冷凍后移至-80 超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?.3  肺組織病理學(xué)評(píng)估小鼠肺

15、組織置于4%多聚甲醛固定24 h后常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片后行he染色;嚴(yán)格按照改良masson三色染色液試劑盒說明書進(jìn)行masson染色。根據(jù)文獻(xiàn)10方法，肺組織病理切片he染色，鏡下觀察并進(jìn)行肺泡炎癥評(píng)分，0分：無肺泡炎;1分：輕度肺泡炎，受累面積小于全肺面積20%;2分：中度肺泡炎，受累面積占全肺面積20%50%;3分：重度肺泡炎，受累面積超過全肺50%。參照文獻(xiàn)11方法，肺組織病理切片masson染色，鏡下觀察并進(jìn)行纖維化評(píng)分。0分：肺組織結(jié)構(gòu)特征正常;1分：肺泡部分?jǐn)U大，肺泡間隔輕度增厚（正常3倍），受累面積小于全肺面積20%;2分：肺泡間隔中度增厚（>正常3倍），但無肺結(jié)構(gòu)損

16、毀;3分：肺泡間隔中度增厚（>正常3倍），纖維組織增多;4分：纖維組織團(tuán)塊形成面積小于鏡下視野10%，伴有輕度肺結(jié)構(gòu)損害;5分：纖維組織團(tuán)塊形成面積占鏡下視野的10%50%，伴有肺結(jié)構(gòu)損害;6分：纖維組織團(tuán)塊形成面積大于鏡下視野的50%，伴有明顯肺結(jié)構(gòu)損害;7分：嚴(yán)重肺結(jié)構(gòu)損毀，大片纖維化區(qū)域，蜂窩肺;8分：滿視野纖維組織。2.4  免疫組化檢測肺組織轉(zhuǎn)化生長因子-1和-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)取肺組織切片，二甲苯和梯度乙醇常規(guī)脫蠟，pbs沖洗，滴加h2o2阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶，檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加山羊血清覆蓋組織，分別滴加一抗tgf-1（1200）及-sma（1500）

17、，放入濕盒，4 過夜。pbs沖洗后分別滴加反應(yīng)增強(qiáng)液、二抗，dab染色，蘇木精復(fù)染，飽和碳酸鋰返藍(lán)，中性樹脂封片。于正置顯微鏡200倍鏡下觀察tgf-1及-sma表達(dá)，拍照并記錄。使用全自動(dòng)imagepro- plus 6.0計(jì)算軟件對(duì)免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行分析。2.5  western blot檢測轉(zhuǎn)化生長因子-1和-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)稱取肺組織20 mg，加入300 g蛋白裂解液，勻漿后抽提總蛋白，bca法測定蛋白濃度，按30 g/孔上樣，進(jìn)行sds-page電泳，電泳結(jié)束后將凝膠移至pvdf膜上。5%脫脂奶粉40 ml室溫封閉2 h，tbst洗膜3次×10 min。按抗

18、體說明書分別配制tgf-1一抗（11000）及-sma一抗（11000），4 孵育過夜。tbst洗膜3次×10 min。加入hrp標(biāo)記二抗，室溫慢搖孵育2 h。tbst洗膜3次×10 min。化學(xué)發(fā)光試劑曝光蛋白印跡條帶，image lab軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以gapdh為內(nèi)參，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。3  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用graphpad prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，多組比較用方差分析。p<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4  結(jié)果4.1  he染色結(jié)果正常組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡形態(tài)正常，肺泡壁纖細(xì)，肺

19、間質(zhì)無炎癥細(xì)胞浸潤;模型組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肺泡大量塌陷融合壞死，實(shí)變區(qū)肺泡壁增厚，有大量炎性細(xì)胞浸潤;扁蒴藤素組和吡非尼酮組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)基本完整，較少見肺泡塌陷或?qū)嵶儯闻萸豢梢娚倭垦仔约?xì)胞浸潤。見圖1。肺泡炎評(píng)分結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠肺泡炎評(píng)分明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）;與模型組比較，扁蒴藤素組和吡非尼酮組小鼠肺泡炎評(píng)分均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）。見圖2。4.2  masson染色結(jié)果正常組小鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)規(guī)則、整齊，有極少淡藍(lán)色細(xì)絲狀纖維沉積;模型組小鼠肺組織可見大量藍(lán)色膠原沉積于肺泡間隔及肺間質(zhì);扁蒴藤素組和吡非

20、尼酮組較模型組小鼠肺組織藍(lán)色膠原沉積均明顯減輕。見圖3。肺纖維化評(píng)分結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組小鼠肺組織纖維化評(píng)分明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）;與模型組比較，扁蒴藤素組和吡非尼酮組小鼠肺組織纖維化評(píng)分均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）。見圖4。4.3  免疫組化檢測結(jié)果正常組小鼠僅支氣管黏膜上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞有少量tgf-1呈弱陽性表達(dá)，模型組小鼠肺泡上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、支氣管黏膜上皮細(xì)胞廣泛表達(dá)tgf-1;與模型組比較，扁蒴藤素組和吡非尼酮組小鼠肺組織tgf-1表達(dá)明顯降低（p<0.05）。-sma蛋白主要表達(dá)于氣管周圍，以棕黃色染

21、色為陽性表達(dá)。與正常組比較，模型組小鼠肺組織-sma蛋白表達(dá)明顯升高（p<0.01）;與模型組比較，扁蒴藤素組和吡非尼酮組小鼠肺組織-sma蛋白表達(dá)明顯降低（p<0.05）。見圖5圖8。4.4  western blot檢測結(jié)果與正常組比較，模型組小鼠肺組織tgf-1和-sma蛋白表達(dá)顯著升高（p<0.01）;與模型組比較，扁蒴藤素組和吡非尼酮組小鼠肺組織tgf-1和-sma蛋白表達(dá)明顯降低（p<0.05，p<0.01）。見圖9、圖10。5  討論肺間質(zhì)纖維化是結(jié)締組織病的常見并發(fā)癥，其主要臨床表現(xiàn)為剌激性干咳和呼吸困難，發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，

22、最關(guān)鍵的病理特征被認(rèn)為在于成纖維細(xì)胞的異常增殖、成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞失調(diào)以及ecm大量沉積，最終導(dǎo)致肺功能衰竭12-13。近年來對(duì)肺纖維化機(jī)制的深入研究表明，tgf-1在肺纖維化動(dòng)物模型及肺纖維化患者中的表達(dá)顯著升高14，被認(rèn)為是肺纖維化發(fā)病及治療中的關(guān)鍵分子。tgf-1作為促纖維化因子，可引起成纖維細(xì)胞過度增殖活化，大量肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，ecm過度沉積，最終導(dǎo)致肺部組織結(jié)構(gòu)重塑、肺功能受損15。研究表明，-sma是肌成纖維細(xì)胞活化的標(biāo)記，胞漿中-sma表達(dá)使其具有收縮性，其與組織纖維化密切相關(guān)，同時(shí)其表達(dá)強(qiáng)度與肺纖維化程度呈正相關(guān)16-17。因此，-sma的表達(dá)水平可作為判定纖維化

23、程度的一個(gè)間接指標(biāo)，抑制tgf-1和-sma的表達(dá)，可改善肺纖維化的程度18。扁蒴藤素目前已成為治療腫瘤、自身免疫及炎癥性疾病的有效藥物19。同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道，扁蒴藤素可通過下調(diào)tgf-1等相關(guān)纖維化基因改善心肌纖維化8。鑒于其在心肌纖維化中的作用，本實(shí)驗(yàn)采用小鼠氣管內(nèi)注射博來霉素方法模擬具有肺纖維化病理特點(diǎn)的動(dòng)物模型，觀察并探討扁蒴藤素對(duì)肺纖維化小鼠的干預(yù)作用及其可能的作用機(jī)制。病理結(jié)果顯示，模型小鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肺泡間隔增厚，伴有大量炎性細(xì)胞浸潤和膠原纖維增生，表明小鼠肺纖維化模型構(gòu)建成功。經(jīng)扁蒴藤素或吡非尼酮干預(yù)后，肺泡炎和纖維化評(píng)分均明顯下降，提示扁蒴藤素可在一定程度上改善博來霉素

24、誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化，其作用效果與吡非尼酮相似。免疫組化及western blot結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠tgf-1和-sma蛋白表達(dá)明顯升高，這與既往研究報(bào)道20相一致，提示肺纖維化小鼠模型成功建立。經(jīng)扁蒴藤素及吡非尼酮干預(yù)后，tgf-1和-sma蛋白表達(dá)較模型組均不同程度降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示扁蒴藤素改善博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化可能是通過抑制tgf-1和-sma蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。目前臨床應(yīng)用吡非尼酮治療肺纖維化雖具有一定的療效，但尚未普遍推廣。本研究發(fā)現(xiàn)扁蒴藤素與吡非尼酮具有相似的抗纖維化作用，但具體機(jī)制及相關(guān)不良反應(yīng)還有待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)：1 atzenni f， g

25、erardi m c， barilaro g， et al. interstitial lung disease in systemic autoimmune rheumatic diseases：a comprehensive reviewj. expert rev clin immunol，2018，14（1）：69-82.2 sibinska， tian x， koerfei m. amplified canonical transforming growth factor- signalling via heat shock protein 90 in pulmonary fibros

26、isj. eur respir j，2017，49（2）：1501941.3 amo a i， gauglitz g g， barret j p， et al. new molecular medicine- based scar management strategiesj. burns，2014，40（4）：539.4 fischer a， baljuls a， reinders j， et al. regulation of raf activity by 14-3-3 proteinsj. journal of biological chemistry， 2008，284（5）：318

27、3-3194.5 raghu g， rochwerg b， zhang y， et al. an official ats/ers/jrs/alat clinical practice guideline：treatment of idiopathic pulmonary fibrosis. an update of the 2011 clinical practice guidelinej. am j respir crit care med，2015，192（2）：e3-e19.6 blaauboer m e， boeijen f r， emson c l， et al. extracel

28、lular matrix proteins：a positive feedback loop in lung fibrosis？j. matrix biol，2014，34：170-178.7 白殊同，佟麗，王琴，等.過山楓活性成分扁蒴藤素藥理作用研究進(jìn)展j.中國藥理學(xué)通報(bào)，2019，35（3）：318-321.8 ei-agamy d s， ei-harbi k m， khoshhal s， et al. pristimerin protects against doxorubicin-induced cardiotoxicity and fibrosis through modulatio

29、n of nrf2 and mapk/nf-b signaling pathwaysj. cancer manag res，2019，11：47-61.9 cabrera s， maciel m， herrera i， et al. essential role for the atg4b protease and autophagy in bleomycin-induced pulmonary fibrosisj. autophagy，2015，11（4）：670-694.10 szapiel s v， elson n a， fulmer j d， et al. bleomycin-indu

30、ced interstitial pulmonary disease in the nude athymic mousej. am rev respir dis，1979，120（4）：893-899.11 ashcroft t， simoson j m， timbrell v. simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scalej. j clin pathol，1988，41（4）：467-470.12 sakai n， tager a m. fibrosis of two：epithelial cell-fibroblast interactions in pulmonary fibrosisj. biochim biophys acta， 2013，1832（7）：911-921.13 chioma o s， drake w p. role of microbial agents in pulmonary fibrosisj. yale j biol med，2017，90（2）：219