臨床生物化學(xué)實驗技術(shù)

1、常用生物化學(xué)檢驗技術(shù)常用生物化學(xué)檢驗技術(shù)1第一節(jié)第一節(jié) 光譜分析技術(shù)光譜分析技術(shù)第二節(jié)第二節(jié) 電化學(xué)分析電化學(xué)分析第三節(jié)第三節(jié) 電泳技術(shù)電泳技術(shù)第四節(jié)第四節(jié) 層析技術(shù)層析技術(shù)第五節(jié)第五節(jié) 離心技術(shù)離心技術(shù)第六節(jié)第六節(jié) 自動生化分析技術(shù)自動生化分析技術(shù) 只講第一節(jié)，其它內(nèi)容在只講第一節(jié)，其它內(nèi)容在臨床檢驗臨床檢驗儀器學(xué)儀器學(xué)中講授。中講授。n本章內(nèi)容概要本章內(nèi)容概要2n教學(xué)目標(biāo)和要求教學(xué)目標(biāo)和要求1 1、掌握掌握分光光度技術(shù)的基本原理及定性和定量方法。分光光度技術(shù)的基本原理及定性和定量方法。2 2、熟悉熟悉分光光度計的的基本結(jié)構(gòu)和操作方法光源檢查分光光度計的的基本結(jié)構(gòu)和操作方法光源檢查和波長校正

2、、原子分光光度計的類型和影響熒光分析的和波長校正、原子分光光度計的類型和影響熒光分析的因素因素3 3、了解了解其他光譜分析技術(shù)的基本原理及在生化檢驗中其他光譜分析技術(shù)的基本原理及在生化檢驗中的應(yīng)用。的應(yīng)用。3第一節(jié)第一節(jié) 光譜分析技術(shù)光譜分析技術(shù)n分光光度技術(shù)的基本原理分光光度技術(shù)的基本原理n分光光度計的基本結(jié)構(gòu)分光光度計的基本結(jié)構(gòu)n分光光度計的操作方法分光光度計的操作方法 n分光光度技術(shù)的定性和定量方法分光光度技術(shù)的定性和定量方法 4n光譜分析技術(shù)原理：光譜分析技術(shù)原理： 利用各種化學(xué)物質(zhì)都具有發(fā)射、吸收或散射光譜譜系的特利用各種化學(xué)物質(zhì)都具有發(fā)射、吸收或散射光譜譜系的特征，以此來確定物質(zhì)性

3、質(zhì)、結(jié)構(gòu)或含量。征，以此來確定物質(zhì)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或含量。n光譜分析技術(shù)分類：光譜分析技術(shù)分類：發(fā)射光譜分析技術(shù)：發(fā)射光譜分析技術(shù)：火焰光度法、原子發(fā)射光譜法和熒光光譜法火焰光度法、原子發(fā)射光譜法和熒光光譜法 吸收光譜分析技術(shù)：吸收光譜分析技術(shù)：紫外、可見光分光光度法，原子吸收分光光紫外、可見光分光光度法，原子吸收分光光 度法和紅外光譜法度法和紅外光譜法 散射光譜分析技術(shù)：散射光譜分析技術(shù)：比濁法比濁法 5一、分光光度技術(shù)的基本原理一、分光光度技術(shù)的基本原理（一）吸光度與透光度（一）吸光度與透光度 A = -A = -lgTlgT = -lgI/I = -lgI/I0 0 = lgI= lgI0 0

4、/I/I 當(dāng)光線通過均勻、透明的溶液時可出現(xiàn)三種情況：一部分當(dāng)光線通過均勻、透明的溶液時可出現(xiàn)三種情況：一部分光被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透過溶液。設(shè)入射光被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透過溶液。設(shè)入射光強度為光強度為I0I0，透射光強度為，透射光強度為I I，I I和和I I0 0之比稱為透光度之比稱為透光度，即：即：T = I/IT = I/I0 0 T T100100為為T%T%稱為百分透光度。透光度的負(fù)對數(shù)稱為吸光度稱為百分透光度。透光度的負(fù)對數(shù)稱為吸光度即：即：6（二）（二）Lambert-BeerLambert-Beer定律定律 Lambert-BeerLamber

5、t-Beer定律是討論溶液吸光度同溶液濃度和溶液層定律是討論溶液吸光度同溶液濃度和溶液層厚度之間關(guān)系的基本定律，該定律是分光分析的理論基礎(chǔ)。其厚度之間關(guān)系的基本定律，該定律是分光分析的理論基礎(chǔ)。其表達式為：表達式為： A = KLC 式中式中A A為吸光度；為吸光度；K K為比例常數(shù)，稱為吸光系數(shù)；為比例常數(shù)，稱為吸光系數(shù)；L L為溶液為溶液層厚度，稱為光徑；層厚度，稱為光徑；C C為溶液濃度為溶液濃度 （Lambert-BeerLambert-Beer定律適用于可見光、紫外光、紅外光和均勻非散射的液體。）定律適用于可見光、紫外光、紅外光和均勻非散射的液體。）7 據(jù)據(jù)Lambert-BeerL

6、ambert-Beer定律，當(dāng)液層厚度為定律，當(dāng)液層厚度為cmcm，濃度單位為，濃度單位為mol/Lmol/L時，吸光系數(shù)時，吸光系數(shù)K K稱為稱為摩爾吸光系數(shù)摩爾吸光系數(shù)()()。的意義是：當(dāng)液層的意義是：當(dāng)液層厚度為厚度為1cm1cm，物質(zhì)濃度為，物質(zhì)濃度為1mol/L1mol/L時在特定波時在特定波長下的吸光度值。長下的吸光度值。是物質(zhì)的特征性常數(shù)。是物質(zhì)的特征性常數(shù)。 8（三）偏離（三）偏離Lambert-BeerLambert-Beer定律的因素定律的因素 應(yīng)用應(yīng)用Lambert-BeerLambert-Beer定律產(chǎn)生誤差主要來源于光學(xué)定律產(chǎn)生誤差主要來源于光學(xué)和化學(xué)兩方面的因素。

7、和化學(xué)兩方面的因素。1 1光學(xué)因素：光學(xué)因素： 要求入射光是單色光。入射光的譜帶越寬，其誤差越大。要求入射光是單色光。入射光的譜帶越寬，其誤差越大。 2 2化學(xué)因素：化學(xué)因素： 濃度、濃度、pHpH、溶劑和溫度等因素可影響化學(xué)平衡。、溶劑和溫度等因素可影響化學(xué)平衡。 9二、分光光度計的基本結(jié)構(gòu)二、分光光度計的基本結(jié)構(gòu)最常用的是最常用的是可見分光光度計可見分光光度計和和紫外紫外- -可見光分光光度計可見光分光光度計 光源光源單色器單色器比色杯比色杯檢測器檢測器顯示器顯示器五大部份五大部份n結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)：10（一）光源（一）光源u光源定義：光源定義： 指一種可以發(fā)射出供溶液或吸收物質(zhì)選擇性吸收的光。

8、光指一種可以發(fā)射出供溶液或吸收物質(zhì)選擇性吸收的光。光源應(yīng)在一定光譜區(qū)域內(nèi)發(fā)射出連續(xù)光譜，并有足夠的強度和良源應(yīng)在一定光譜區(qū)域內(nèi)發(fā)射出連續(xù)光譜，并有足夠的強度和良好的穩(wěn)定性，在整個光譜區(qū)域內(nèi)光的強度不應(yīng)隨波長有明顯的好的穩(wěn)定性，在整個光譜區(qū)域內(nèi)光的強度不應(yīng)隨波長有明顯的變化。變化。 u光源種類：光源種類： 可見光分光光度計常用光源是可見光分光光度計常用光源是鎢燈或鹵鎢燈。鎢燈或鹵鎢燈。 紫外光光度計常用紫外光光度計常用氫燈氫燈作為光源。作為光源。 11（二）單色器（二）單色器u定義：定義： 將來自光源的復(fù)合光分散為單色光的裝置稱為分將來自光源的復(fù)合光分散為單色光的裝置稱為分光系統(tǒng)或單色器。光系統(tǒng)

9、或單色器。 u種類：種類： 濾光片濾光片棱鏡棱鏡光柵光柵12（三）比色杯（三）比色杯又稱為吸收池或比色皿又稱為吸收池或比色皿 u材料：材料：常用無色透明、耐腐蝕和耐酸堿的玻璃或石英材料做成常用無色透明、耐腐蝕和耐酸堿的玻璃或石英材料做成 （五）顯示器（五）顯示器（四）檢測器（四）檢測器 檢測器是將透過溶液的光信號轉(zhuǎn)換為電信號，并將電信號檢測器是將透過溶液的光信號轉(zhuǎn)換為電信號，并將電信號放大的裝置。常用的檢測器為光電管和光電倍增管。放大的裝置。常用的檢測器為光電管和光電倍增管。 是將光電管或光電倍增管放大的電流通過儀表顯示出來的是將光電管或光電倍增管放大的電流通過儀表顯示出來的裝置。裝置。 13

10、三、分光光度計的操作方法三、分光光度計的操作方法（一）分光光度計的基本操作（一）分光光度計的基本操作以以721-A721-A型分光光度計為例，其基本的操作步驟為：型分光光度計為例，其基本的操作步驟為：1.1.開開721-A721-A分光光度計的開關(guān)，將比色池的蓋子打開，通電分光光度計的開關(guān)，將比色池的蓋子打開，通電2020分鐘使儀器預(yù)熱。分鐘使儀器預(yù)熱。2.2.將波長旋至測定的波長。將波長旋至測定的波長。3.3.將空白液、校準(zhǔn)液或待測液放入比色池，將空白液置于光路中。將空白液、校準(zhǔn)液或待測液放入比色池，將空白液置于光路中。4.4.將開關(guān)置于將開關(guān)置于T T位，打開比色池蓋子，用光量粗調(diào)和光量細(xì)

11、調(diào)調(diào)節(jié)位，打開比色池蓋子，用光量粗調(diào)和光量細(xì)調(diào)調(diào)節(jié)T T為為0.0,0.0,關(guān)上關(guān)上比色池蓋子，調(diào)節(jié)比色池蓋子，調(diào)節(jié)T T為為100.0100.0。5.5.將開關(guān)置于將開關(guān)置于A A，用消光調(diào)零調(diào)節(jié)，用消光調(diào)零調(diào)節(jié)A A為為0.00.06.6.重復(fù)步驟重復(fù)步驟4 4和和5 57.7.將校準(zhǔn)液或待測液推入光路，測量溶液的吸光度（將校準(zhǔn)液或待測液推入光路，測量溶液的吸光度（A A）14（二）吸光度的校正（二）吸光度的校正 鉻酸鉀的標(biāo)準(zhǔn)液可用于校正分光光度計的吸鉻酸鉀的標(biāo)準(zhǔn)液可用于校正分光光度計的吸光度。在光度。在25，將，將4mg鉻酸鉀溶于鉻酸鉀溶于100ml的的0.05mol/L KOH中，放入

12、比色池中，在不同波長中，放入比色池中，在不同波長下測定吸光度值，與己知的標(biāo)準(zhǔn)吸光度校正表進下測定吸光度值，與己知的標(biāo)準(zhǔn)吸光度校正表進行比較，可檢測儀器吸光度的準(zhǔn)確度行比較，可檢測儀器吸光度的準(zhǔn)確度。 15四、分光光度技術(shù)的定性和定量方法四、分光光度技術(shù)的定性和定量方法（一）分光光度技術(shù)的定性方法（一）分光光度技術(shù)的定性方法u定性依據(jù)：定性依據(jù)：最大吸收波長最大吸收波長maxmax和摩爾吸光系數(shù)和摩爾吸光系數(shù) 2.2.摩爾消光系數(shù)摩爾消光系數(shù)方法方法1.1.最大吸收波長最大吸收波長maxmax方法方法16（二）分光光度技術(shù)的定量方法（二）分光光度技術(shù)的定量方法1.1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法標(biāo)準(zhǔn)曲線法 根據(jù)根

13、據(jù)Lambert-BeerLambert-Beer定律，液體的濃度在一定范定律，液體的濃度在一定范圍內(nèi)與吸光度成正比關(guān)系。配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)圍內(nèi)與吸光度成正比關(guān)系。配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液（濃度應(yīng)包含高、中、低濃度范圍），按標(biāo)品溶液（濃度應(yīng)包含高、中、低濃度范圍），按標(biāo)本處理方法作相同處理，在特定波長下測定吸光度，本處理方法作相同處理，在特定波長下測定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫座標(biāo)，以吸光度為縱座標(biāo)以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫座標(biāo)，以吸光度為縱座標(biāo)，按最，按最小二乘法的原理，將對應(yīng)各點連成一條通過原點的小二乘法的原理，將對應(yīng)各點連成一條通過原點的直線，這條直線稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測溶液測定吸光直線，這條直線

14、稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測溶液測定吸光度后，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出其相應(yīng)的濃度。度后，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出其相應(yīng)的濃度。u方法：方法：17u制作和應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線時應(yīng)注意下面幾點：制作和應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線時應(yīng)注意下面幾點：（1 1）測定條件發(fā)生變化時（如更換標(biāo)準(zhǔn)品和試劑等），應(yīng)重新）測定條件發(fā)生變化時（如更換標(biāo)準(zhǔn)品和試劑等），應(yīng)重新繪制。繪制。（2 2）標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)有高的純度，標(biāo)準(zhǔn)液的配制應(yīng)準(zhǔn)確。）標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)有高的純度，標(biāo)準(zhǔn)液的配制應(yīng)準(zhǔn)確。（3 3）當(dāng)待測液吸光度超過線性范圍時，應(yīng)將標(biāo)本稀釋后再測定。）當(dāng)待測液吸光度超過線性范圍時，應(yīng)將標(biāo)本稀釋后再測定。（4 4）標(biāo)本測定的條件應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時的條件完全一致。）標(biāo)本測定的

15、條件應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時的條件完全一致。182 2比較法比較法 C Cu u=(=(A Au uC Cs s)/A)/As s 己知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本作同樣處理，使用相同的空白，己知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本作同樣處理，使用相同的空白，同時測定標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)本的吸光度，根據(jù)測定的吸光度及標(biāo)準(zhǔn)同時測定標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)本的吸光度，根據(jù)測定的吸光度及標(biāo)準(zhǔn)品濃度，可直接計算出標(biāo)本的濃度，計算公式為：品濃度，可直接計算出標(biāo)本的濃度，計算公式為： 其中其中CuCu和和AuAu為標(biāo)本管濃度和吸光度，為標(biāo)本管濃度和吸光度，CsCs和和AsAs分別為標(biāo)準(zhǔn)分別為標(biāo)準(zhǔn)管濃度和吸光度。用標(biāo)準(zhǔn)品法定量時，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度應(yīng)盡量管濃度和吸光度。用標(biāo)準(zhǔn)品法定量時，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度應(yīng)盡量和標(biāo)本管濃度相近。和標(biāo)本管濃度相近。 193 3其它分析方法其它分析方法 包括差示法、多組份混合物分析和利用包括差示法、多組份混合物分析和利用摩爾吸光系數(shù)分析等方法。摩爾吸光